資源簡介

(共32張PPT)
3 微生物的數量測定
2 微生物的選擇培養
1 選擇培養基
任務：舉例說明通過調整培養基的配方可有目的地選擇微生物
任務：闡明選擇培養微生物的思路與原理
任務：概述稀釋涂布平板法和顯微鏡計數法是測定微生物數量常用的方法
微生物的選擇培養和計數
第2節 微生物的培養技術及應用
自然界中微生物數量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當要分離的微生物在混合菌群中不是優勢種群時，更難實現，僅通過一般的平板劃線法或稀釋涂布平板法很難實現。該怎么辦？
1.獲得純凈的微生物培養物的關鍵是什么？
防止雜菌污染
2.微生物的純培養過程包括哪些步驟？
配制培養基、滅菌、接種、分離和培養
1973年，科學家從美國黃石國家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌( Thermus aquaticus)，進而從這種菌中提取出耐高溫的DNA聚合酶。這種酶目前已被廣泛用于體外擴增DNA片段的聚合酶鏈式反應(PCR)。
（1）.為什么水生棲熱菌能更容易在熱泉中找到并被篩選出來呢？
這是因為水生棲熱菌適應熱泉的環境，能在 70~80 ℃的高溫條件下生存，而絕大多數微生物在此條件下不能生存。
（2）.在自然界中，想進行微生物篩選的原則是什么？
耐熱微生物
耐寒微生物
石油分解菌
根據微生物對生存環境的要求，到相應環境中去尋找。
一、選擇培養基
1.科學實例：尋找耐高溫的DNA聚合酶
2.篩選原則：
美國黃石公園
實驗室中目的 菌株怎么篩選？
一 選擇培養基
啟示：根據微生物對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找。
耐寒微生物
耐熱微生物
石油分解菌
纖維素分解菌
人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養、溫度和pH）等，同時抑制或阻止其他微生物生長。
實驗室中微生物篩選的原理
選擇培養基
一 選擇培養基
2.選擇培養基的類型
類型 條件 分離得到的菌種
改變培養條件 高溫環境 耐高溫微生物
高鹽環境 金黃色葡萄球菌等耐鹽菌
添加某種化學物質 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
特殊碳源、氮源 尿素是唯一氮源 能分解尿素的微生物
石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物
營養缺陷 不加碳源 自養型微生物
不加氮源 固氮菌
在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基稱為選擇培養基。
一 選擇培養基
1、概念
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學性質穩定，是一種重要的農業氮肥。尿素施入土壤后，被某些細菌分解成NH3，NH3再轉化成NO3-、NH4+等才能被植物吸收。而這些細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶，來催化尿素分解成NH3,NH3可作為細菌生長的氮源。
尿素分子模型
1.如果讓你配制一種培養基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養基的配方該如何設計？
討論
在選擇培養基中，以尿素作為唯一氮源，可以將分解尿素的細菌分離出來。
2.該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點？
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
瓊脂 15.0g
蒸餾水 1000ml
該培養基與普通培養基相比，區別只是用尿素作為唯一氮源，培養基的其他營養成分基本相同。
一 選擇培養基
3、選擇培養基的配方設計
3.選擇培養基的配方設計
如果讓你配制一種培養基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養基的配方該如何設計？
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
瓊脂 20.0g
蒸餾水 定容到1000ml
培養基一
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
瓊脂 15.0g
蒸餾水 定容到1000ml
培養基二
選擇哪種培養基更合適？

可作為完全培養基
（起對照作用）
一 選擇培養基
02
1g土壤中有多少能分解尿素的細菌？
分離：獲得分解尿素的細菌的純培養物
計數：測定分解尿素的細菌的數量
概念：將菌液進行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到固體培養基的表面，進行培養。
主要過程:
A、梯度稀釋菌液 B、涂布平板
稀釋度足夠高時，能在培養基表面形成單個菌落。
稀釋涂布平板法
二、微生物的選擇培養
02
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 無菌水
90mL無菌水
10g
微量
移液器
①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中
注意：取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的紙袋在使用前都要滅菌。
取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。
②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。
A 梯度稀釋
稀釋涂布平板法
二、微生物的選擇培養
02
③取0.1mL菌液，滴加到培養基表面。
⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。
⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。
注意：多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒。
④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。
B、涂布平板
稀釋涂布平板法
二、微生物的選擇培養
恒溫培養箱
待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入30-37℃的恒溫培養箱中，培養1-2d。
在涂布有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的單菌落。
同樣是分離得到單菌落，平板劃線法和稀釋涂布平板法有何不同？
二、微生物的選擇培養
稀釋103倍
稀釋104倍
稀釋105倍
空白對照
平板劃線法 稀釋涂布平板法
純化原理
接種工具
單菌落的獲得
用途
接種效果圖
相同點 通過連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散
將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋程度的菌液分別涂布到固體培養基的表面，進行培養，以得到單菌落
接種環
涂布器
從最后劃線的區域挑取
稀釋度合適，整個平板上都可找到單菌落
分離純化菌種，獲得單菌落
①分離純化菌種，獲得單菌落②用于計數
①都能分離純化菌種；②都是在固體培養基上進行的。
2.平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較：
二、微生物的選擇培養
03
當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過計數平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。
1.稀釋涂布平板法
1.稀釋涂布平板法
2.顯微鏡直接計數法
——間接計數法
——直接計數法
計數原則:
為了保證結果準確，選擇30-300個菌落的平板進行計數；
每個稀釋度至少取3個平板取其平均值；
分析實驗結果時，要考慮重復組結果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實驗。
三. 微生物的數量測定
統計的菌落往往比活菌的實際數目低；
統計的結果一般用菌落數而不是活菌數來表示；
恰當的稀釋度、涂布是否均勻是成功統計菌落數目的關鍵。
結果分析:
當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
03
1.稀釋涂布平板法
三. 微生物的數量測定
03
計算公式:
每g樣品中的菌落數＝
(C÷V)×M
M代表稀釋倍數
C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數
V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)
例：某同學在稀釋倍數為106 的培養基中測得平板上菌落數的平均數為234，那么每g樣品中的菌落數是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
（234÷0.1）×106=2.34×109
答
B
例：甲同學做此實驗在稀釋倍數105獲得3個平板，菌落數分別是80、90、100，涂布平板時均使用0.1ml菌液，試計算每克土壤中可以分離尿素的細菌數目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107個
1.稀釋涂布平板法
三. 微生物的數量測定
1、請計算：4號試管的結果表明每克土壤中的活菌數約為 個。
1.1×108
2、通過稀釋涂布平板法統計的細菌的數目與它的實際數目相同嗎？
提示　統計的細菌數往往比活菌實際數目低。因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
練一練
2.顯微鏡直接計數：——直接計數法
（1）方法：
利用特定的細菌計數板或血細胞計數板在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量。
相關信息
細菌計數板可對細菌等較小的細胞進行觀察和計數，血細胞計數板常用于相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等的觀察和計數。
（2）優點：
快速直觀
（3）缺點：
②個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察。
每毫升原液所含細菌數＝
①統計的結果一般是活菌數和死菌數的總和，不能區分死菌與活菌。
每小格平均細菌數×400×10000×稀釋倍數
血細胞計數板
三. 微生物的數量測定
微生物的計數方法比較
內容 直接計數法 間接計數法
主要用具 顯微鏡、細菌計數板或血細胞計數板 涂布器
計數依據 細菌個數 培養基上菌落數
優點 計數方便、操作簡單 計數的是活菌
缺點 不能區分死菌與活菌 當兩個或多個菌體連在一起時,平板上觀察到的只是一個菌落
計算公式 每毫升原液含菌株數＝每小格平均菌株數×400×1 0000×稀釋倍數 每克樣品中的菌株數：(C ÷ V）× M
C：某稀釋度下平板上生長的平均菌落數；V：涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)；M：稀釋倍數
結果 比實際值偏大 比實際值偏小
實例.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
（1）原理：絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的選擇培養基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。
常見的分解尿素的微生物：芽孢桿菌、小球菌、棒狀桿菌等細菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
瓊脂 15.0g
蒸餾水 1000ml
①從物理性質看該培養基屬于什么培養基？
②從功能分析該培養基屬于什么培養基？
固體培養基
選擇培養基
三. 微生物的數量測定
（2）.實驗步驟：
1）土壤取樣
①取樣地點要求：酸堿度接近中性的潮濕土壤。
②取樣過程：
3）樣品稀釋與取樣涂布
2）制備培養基
①細菌：一般用104、105、106稀釋液。
②真菌：一般用102、103、104稀釋液。
以保證獲得菌落數在30～300之間適于計數的平板。
選擇一個比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養，以保證能從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數。
在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數？
相當于做預實驗。
鏟去表層土（一般3cm左右）。細菌絕大部分分布 在距地表3～8cm的土壤層。
思考
三. 微生物的數量測定
（2）.實驗步驟：
4）微生物的培養與觀察
①培養條件：不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間。細菌一般在30～37℃的溫度下培養1～2d。
②觀察：每隔24h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果。防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。
③一般來說，在相同的培養條件下，同種微生物表現出穩定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。（鑒別指示劑）
得到的菌落一定是分解尿素的細菌嗎？
不一定，還需要進一步的鑒定
三. 微生物的數量測定
實踐 探究 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
三. 微生物的數量測定
組 具體組別 具體操作 作用
接種組 實驗組1 選擇培養基 三次重復排除偶然因素對實驗結果的影響，用以分離并計數能分解尿素的細菌。
實驗組2 選擇培養基 實驗組3 選擇培養基 實驗組4 牛肉膏蛋白胨培養基 實驗組4與實驗組1 、2、3組對比用以驗證選擇培養基是否具有選擇作用。
不接種組 對照組1 選擇培養基 對照組1與實驗組1 、2、3組對比用以驗證選擇培養基中是否含有雜菌。
對照組2 牛肉膏蛋白胨培養基 對照組2與實驗組4 對比用以驗證牛肉膏蛋白胨培養基中是否含有雜菌。
結果 實驗組1、2、3分離得到尿素分解菌的單菌落； 實驗4組得到多種菌落；對照組1、2組正常情況下無菌落。 ①結合對照組，分析培養物中是否有雜菌污染以及選擇培養基是否篩選出一些菌落。
②你是否獲得了某一稀釋度下菌落數為30～300的平板 在這一稀釋度下，是否至少有2個平板的菌落數接近
③你統計的每克土樣中能分解尿素的細菌的菌落數是多少 與其他同學統計的結果接近嗎 如果差異很大，可能是什么原因引起的
如果沒有接種的培養基上沒有菌落生長，說明培養基沒有被雜菌污染。如果接種后的完全培養基上的菌落數明顯多于選擇培養基上的菌落數，說明選擇培養基篩選出了一些尿素分解菌。
如果得到了兩個或多個菌落數為30～300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進行菌落的計數。
如果是用同一土樣進行的操作，數據應該比較接近。如果差異很大，就需要從操作是否規范、培養基配制是否合理等方面查找原因。
三. 微生物的數量測定
土壤中分解尿素的細菌的鑒定
在以尿素作為唯一氮源的培養基中分離出的微生物都是能分解尿素的嗎？
因為有些微生物可以利用其他微生物的代謝產物進行生長繁殖。
不一定。
對分離的菌種進行鑒定還需要借助生物化學的方法。
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養基堿性增強→ 酚紅變紅→脲酶陽性
操作：在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑。培養某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。
①液體培養基可以直接看液體的變色情況；
②固體培養基上可以觀察菌落周圍是否出現紅色環帶，紅色環帶直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強。
在培養基中加入某種指示劑或化學藥品(不影響微生物正常生長)，使微生物的某種代謝產物與培養基中的特定指示劑或化學藥品發生反應。從而達到鑒定的作用。
鑒別培養基：
拓展應用
纖維素分解菌的鑒定
（1）篩選纖維素分解菌的方法____________。該方法可以通過____反應直接篩選。
剛果紅染色法
顏色
（2）原理：
剛果紅是一種染料，它可以與纖維素形成紅色復合物，但并不和纖維二糖、葡萄糖發生這種反應。在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅與纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素酶分解后剛果紅—纖維素的復合物就無法形成，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣我們可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。
可根據是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌
是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅-美藍 培養基上培養，大腸桿菌菌落呈現黑色，通過計算得出水樣中大腸桿菌的數量。
到生活中去
測定飲水中大腸桿菌數量的方法：
鑒別培養基
微生物的數量測定
選擇培養基的作用
微生物選擇培養獲取純培養物的方法-稀釋涂布平板法
微
生
物
的
選
擇
培
養
和
計
數
選擇培養基
微生物的選擇培養
科學實例
篩選原則
選擇培養基的概念及舉例
稀釋涂布平板法的操作過程
間接計數法 — 稀釋涂布平板法
直接計數 —計數板計數法
土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
培養基的制備
實驗設計
（1）土壤取樣
（2）樣品的稀釋
（3）稀釋涂布平板法接種
（4）微生物的培養與觀察
實驗結果
練習與應用
一、概念檢測
1. 研究人員用無機鹽、瓊脂和石油配制的培養基從被石油污染的土壤中篩選出了一種石油降解菌，判斷下列相關表述是否正確。
（1）這種培養基是一種選擇培養基。（ ）
（2）利用這種石油降解菌可以降解石油，修復土壤。（ ）
（3）相對于未被污染的土壤，從被石油污染的土壤中更容易分離到石油降解菌。（ ）
2. 用稀釋涂布平板法來統計樣品中的活菌數時，通過統計平板上的菌落數就能推測出樣品中的活菌數，原因是（ ）
A. 菌落中的細菌數目是固定的
B. 平板上的一個菌落就是一個細菌
C. 通過此方法統計的菌落數與活菌的實際數目相同
D. 平板上的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌
√
√
√
D
練習與應用
二、拓展應用
1.反芻（chú）動物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活著多種微生物，其中許多微生物能分解尿素。請你設計一個實驗從瘤胃中分離出能夠分解尿素的微生物。
由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會死亡，因此分離其中能分解尿素的微生物除了需要準備選擇培養基，還應該參照厭氧菌的培養方法進行實驗設計。
拓展應用
2.地球上的植物每年產生的纖維素超過70億噸，其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用，這是因為它們能夠產生纖維素酶。對這些微生物的研究與應用，
使人們能夠利用秸稈等生產酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。已知剛
果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，
但并不與水解后的纖維二糖、葡萄糖等發生這種反應。當我們在含有纖
維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅與纖維素形成紅色復合物；而當
纖維素被纖維素分解菌分解后，復合物就無法形成，培養基中會出現以
這些菌為中心的透明圈（如下圖所示）。請回答下列問題。
(1)現在要從土壤中分離纖維素分解菌，請你給出詳細的實驗方案。
提示：制備土壤浸出液，接種到以纖維素為唯一碳源的培養基中培養。在稀釋涂布到含剛果紅的以纖維素為唯一碳源的培養基中培養。菌落周圍出現透明圈的菌落即為能分解纖維素的微生物。
以纖維素為唯一碳源的培養基是____________。
加有剛果紅的培養基是_____________。
選擇培養基
鑒別培養基
4. 地球上的植物每年產生的纖維素超過70 億噸，其中40%～ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，這是因為它們能夠產生纖維素酶。對這些微生物的研究與應用，使人們能夠利用秸稈等生產酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。已知剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不與水解后的纖維二糖、葡萄糖等發生這種反應。當我們在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅與纖維素形成紅色復合物；而當纖維素被纖維素分解菌分解后，復合物就無法形成，培養基中會出現以這些菌為中心的透明圈（如下圖所示）。請回答下列問題。
（3）有同學說，可以把濾紙埋在土壤中，經過一段時間后，再從已腐爛的濾紙上篩選纖維素分解菌。請你評價這一做法。
可以選擇纖維素豐富的環境，如樹林中多年落葉形成的腐殖土等。
可行，這是人工設置適合纖維素分解菌生存的環境,腐爛的濾紙上很可能有纖維素分解菌。
（2）你打算到什么環境中去尋找纖維素分解菌？為什么？

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