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第3章 第2節(jié)
人教版 選擇性必修3
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
二/
第一步：目的基因的篩選與獲取
一/
目錄
CONTENTS
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
三/
第四步：目的基因的檢測(cè)與鑒定
四/
DNA 片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
五/
02
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
二
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
cDNA文庫(kù)
5‘
3‘
3‘
5‘
Bt基因
（目的基因）
PCR（設(shè)計(jì)引物加上酶切位點(diǎn)）
Bt基因
EcoRⅠ酶切位點(diǎn)
EcoRⅠ酶切位點(diǎn)
二
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
Bt基因！
EcoRⅠ酶切位點(diǎn)
EcoRⅠ酶切位點(diǎn)
（目的基因）
Bt基因
二
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
Bt基因
（目的基因）
重組DNA分子
剛才模擬的是什么過(guò)程？
二
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
基因表達(dá)載體構(gòu)建的過(guò)程：
質(zhì)粒
載體
限制酶
目的基因
限制酶切割位點(diǎn)
限制酶切割位點(diǎn)
限制酶
在構(gòu)建抗蟲(chóng)棉的基因表達(dá)載體時(shí)，首先會(huì)用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口
用同種限制酶或
能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
DNA連接酶
重組
DNA分子
基因表達(dá)載體
（核心工作）
二
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
基因表達(dá)載體構(gòu)建的過(guò)程：
目的基因
限制酶切割位點(diǎn)
限制酶
用同種限制酶或
能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
DNA連接酶
重組
DNA分子
基因表達(dá)載體
目的基因
（核心工作）
為什么要構(gòu)建基因表達(dá)載體？
使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
基因表達(dá)載體應(yīng)該具備什么結(jié)構(gòu)才能到達(dá)以上目的？
二
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
Bt基因
（目的基因）
基因表達(dá)載體
如果目的基因需要復(fù)制需要什么結(jié)構(gòu)？
復(fù)制原點(diǎn)
如果目的基因需要表達(dá)需要什么條件？
需要啟動(dòng)子和終止子
啟動(dòng)子和終止子應(yīng)該加在哪？
啟動(dòng)子
終止子
位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。
二
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
啟動(dòng)子類型：
誘導(dǎo)型啟動(dòng)子
組成型啟動(dòng)子
組織特異性啟動(dòng)子
二
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。
啟動(dòng)子類型：
誘導(dǎo)型啟動(dòng)子
即在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)刺激后，基因轉(zhuǎn)錄水平在該類啟動(dòng)子的調(diào)控下大幅度地提升或降低。
誘導(dǎo)物
作用
誘導(dǎo)型啟動(dòng)子
激活或抑制
目的基因表達(dá)
如：光誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、熱誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、真菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子和共生細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子等。
二
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。
啟動(dòng)子類型：
組成型啟動(dòng)子
能夠調(diào)控基因表達(dá)，使其基本恒定在一定程度上，從而使基因在不同部位或組織中的表達(dá)水平不存在明顯差異。這類啟動(dòng)子一般來(lái)自于管家基因，可連續(xù)不斷地啟動(dòng)基因的表達(dá)。
如：使Bt基因表達(dá)的啟動(dòng)子
可能存在問(wèn)題：
如外源基因在整株植物中表達(dá)，產(chǎn)生大量異源蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破了植物原有的代謝平衡，有些產(chǎn)物對(duì)植物并非必需甚至有毒，因而阻礙了植物的正常生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致死亡；
二
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。
啟動(dòng)子類型：
組織特異性啟動(dòng)子
其調(diào)控作用使得基因往往只在某些特定器官或組織中表達(dá)，且表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。
優(yōu)點(diǎn)：
啟動(dòng)的外源基因在受體中僅在需要的部位特異表達(dá)，克服了組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)的外源基因在受體植物中非特異、持續(xù)、高效表達(dá)所造成的浪費(fèi)，增加轉(zhuǎn)基因的效果。
P54
P90
二
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
Bt基因
（目的基因）
基因表達(dá)載體
復(fù)制原點(diǎn)
基因表達(dá)載體還應(yīng)具有什么結(jié)構(gòu)？
啟動(dòng)子
終止子
位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。
終止子相當(dāng)于一盞紅色信號(hào)燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。
標(biāo)記基因
為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的重組DNA分子細(xì)胞篩選出來(lái)。
抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。
標(biāo)記基因作用：
標(biāo)記基因常見(jiàn)類型：
為什么構(gòu)建的基因表達(dá)載體要篩選？如何篩選？
左
右
右
左
目的基因自身環(huán)化
質(zhì)粒自連
單個(gè)片段
兩個(gè)片段之間會(huì)出現(xiàn)什么問(wèn)題？
正向連接
反向連接
正向連接
反向連接
轉(zhuǎn)錄方向
轉(zhuǎn)錄方向
模板鏈
模板鏈
正向連接
反向連接
轉(zhuǎn)錄方向
轉(zhuǎn)錄方向
模板鏈
模板鏈
轉(zhuǎn)錄
CCA……UCCCUAA
mRNA1
轉(zhuǎn)錄
UUAGGGA……UGG
mRNA2
反向連接將導(dǎo)致最終表達(dá)產(chǎn)物不相同！
正向連接
反向連接
兩種片段連接還有其他情況嗎？
+
目的基因與目的基因連接
+
質(zhì)粒與質(zhì)粒連接
如何避免此類問(wèn)題？
使用雙酶切法分別對(duì)目的基因兩側(cè)和質(zhì)粒進(jìn)行切割，使之產(chǎn)生不同的黏性末端！
+
不能環(huán)化！
①可以防止質(zhì)粒、目的基因的自身環(huán)化連接；
②還可以防止目的基因與載體的反向連接。
雙酶切法作用：
如何使用標(biāo)記基因篩選？
請(qǐng)結(jié)合下圖，回答問(wèn)題：
（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？
不能
因?yàn)镾maⅠ切割會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。
質(zhì)粒上的抗性基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無(wú)法進(jìn)一步篩選。
二
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
-GGGCCC-
-CCCGGG-
（2）只使用EcoRⅠ分別切割質(zhì)粒和外源DNA，能否構(gòu)建基因表達(dá)載體？
如果能有何弊端？
能
①質(zhì)粒、目的基因發(fā)生自身環(huán)化；
②質(zhì)粒與目的基因會(huì)發(fā)生反向連接。
二
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
-GGGCCC-
-CCCGGG-
（3）與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)是什么？
①可以防止質(zhì)粒、目的基因的自身環(huán)化連接；
②還可以防止目的基因與載體的反向連接。
二
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
-GGGCCC-
-CCCGGG-
科學(xué)家利用基因工程生產(chǎn)人胰島素過(guò)程中所使用的質(zhì)粒和目的基因的部分結(jié)構(gòu)如下圖所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
經(jīng)典題
(1)基因工程的核心是基因表達(dá)載體的構(gòu)建，圖中質(zhì)粒上的____________可作為標(biāo)記基因?qū)⒑心康幕虻募?xì)胞篩選出來(lái)。
LacZ（β-半乳糖苷酶基因）和AmpR（氨芐青霉素抗性基因）
經(jīng)典題
(2)科學(xué)家從胰島B細(xì)胞中獲取總RNA，為得到大量的人胰島素基因，需要用到____________酶，獲得的人胰島素基因序列中___________（填“含有”或“不含有”）啟動(dòng)子。
逆轉(zhuǎn)錄酶和耐高溫的DNA聚合酶
不含有
經(jīng)典題
(3)為了使人胰島素基因和質(zhì)粒正確連接，應(yīng)選擇___________（填限制酶）切割質(zhì)粒，在通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增人胰島素基因時(shí)，可在引物1和引物2的5'端分別添加___________和____________（填限制酶）的識(shí)別序列，以使目的基因和質(zhì)粒具有相同的黏性末端。
氨芐青霉素和X-gal
XhoI
EcoRⅠ
經(jīng)典題
(4)β-半乳糖苷酶可分解無(wú)色的X-gal并產(chǎn)生藍(lán)色的產(chǎn)物，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落為白色。將大腸桿菌與基因表達(dá)載體混合培養(yǎng)一段時(shí)間后，將大腸桿菌接種到添加___________的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，應(yīng)挑選___________的菌落作為工程菌生產(chǎn)人胰島素。
氨芐青霉素和X-gal
白色
03
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
三
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
受體細(xì)胞類型
植物細(xì)胞
動(dòng)物細(xì)胞
微生物細(xì)胞
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
花粉管通道法
我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)
常用
顯微注射法
Ca2+處理法
三
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
植物細(xì)胞
花粉管通道法
方法一：用微量注射器將含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中
含目的基因的DNA 溶液
（我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）
（我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）
三
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
植物細(xì)胞
花粉管通道法
方法二：在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。
三
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
植物細(xì)胞
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
轉(zhuǎn)化：
目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。實(shí)質(zhì)是基因重組。
農(nóng)桿菌
農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有侵染能力。
三
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
農(nóng)桿菌
農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有侵染能力。
Ti質(zhì)粒
T-DNA
（可轉(zhuǎn)移的DNA）
三
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
Ti質(zhì)粒
T-DNA
（可轉(zhuǎn)移的DNA）
目的基因
構(gòu)建表達(dá)載體
含目的基因的
重組 Ti 質(zhì)粒
轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
含重組 Ti 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
含重組 Ti 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌
導(dǎo)入植物細(xì)胞
將目的基因插入
染色體 DNA 中
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
將目的基因插入
染色體 DNA 中
表現(xiàn)出新性狀的植株
三
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
Ti質(zhì)粒
T-DNA
（可轉(zhuǎn)移的DNA）
目的基因
構(gòu)建表達(dá)載體
含目的基因的
重組 Ti 質(zhì)粒
轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
含重組 Ti 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌
導(dǎo)入植物細(xì)胞
將目的基因插入
染色體 DNA 中
第一次拼接
第二次拼接
第一次導(dǎo)入
第二次導(dǎo)入
該過(guò)程涉及兩次拼接和兩次導(dǎo)入，你能總結(jié)嗎？
兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。
兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（非人工操作）。
三
第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
根據(jù)受體植物的不同，所用的具體轉(zhuǎn)化方法有所區(qū)別。
例如，可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；
可以將花序直接浸沒(méi)在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。

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