資源簡介

(共26張PPT)
第1節 基因工程及其技術
第2課時
基于PCR技術，運用結構與功能觀等觀念理解PCR技術的過程、原理、條件等內容，并能夠歸納出PCR和DNA復制的異同點。
掌握瓊脂糖凝膠電泳法的原理和操作步驟，并能夠利用電泳法對PCR擴增產物進行鑒定和產物數量的計算。
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DNA解旋酶
DNA聚合酶
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RNA引物
游離的dNTP
DNA連接酶
細胞內DNA復制：
一、聚合酶鏈式反應（PCR)技術
1.提出者：
Kary Banks Mullis
1944.12-2019.8
PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器
美國科學家穆里斯獲1993年諾貝爾化學獎
2.含義：
PCR技術是目的DNA片段(目的基因)的體外擴增技術，整個過程是在體外進行，故又叫做體外DNA擴增技術。
DNA半保留復制、DNA熱變性
3.原理：
4.條件：
模板（目的基因）、2種引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、緩沖溶液（含Mg2+ )
待擴增的DNA片段（模板）
引物
耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）
4種脫氧核苷酸（dNTP）
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DNA引物
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DNA引物
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變性（94℃）
退火
（55℃-65℃）
延伸（72℃）
Taq聚合酶
游離的dNTP
5.過程：
小組討論1：
思考PCR過程中利用的模板、2種引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、緩沖溶液（含Mg2+ )分別有什么作用？
耐高溫的 DNA 聚合酶/Taq酶（作用：催化子鏈的合成）
4 種脫氧核糖核苷酸/dNTP（作用：合成DNA的原料）
模板 DNA（作用：合成子鏈的模板）
2種引物（作用：使DNA聚合酶從引物的3'端開始合成子鏈）
Mg2+緩沖液（作用：激活 DNA 聚合酶/維持適宜的pH、離子濃度等）
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目的基因
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引物
6.PCR產物的計算問題:
在第3輪擴增時能得到完整的目的基因
經過n輪擴增后共有目的基因2n-2n個
經過n輪擴增，共消耗引物1 2n-1個
第n輪擴增，需要消耗引物1 2n-1個
6.PCR產物的計算問題:
PCR技術 DNA復制
相同點 原則
原料
條件
不同點 解旋方式
場所
酶
結果
堿基互補配對
四種脫氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高溫下變性解旋
解旋酶催化
體外復制
細胞內（主要在細胞核內）
耐高溫的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整個DNA分子
小組討論2: PCR技術與DNA復制過程比較？
二、利用PCR技術擴增DNA片段并完成電泳鑒定
（1）嘗試運用PCR儀擴增DNA片段
（2）關注PCR技術的應用
（3）學習瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段的方法和技術
1.實驗目的：
2.實驗原理：
通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器，一次PCR一般要經歷30次循環。
PCR儀
3.實驗試劑：
材料 用量
10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+） 5μL
2.5mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP） 4μL
10μmol/L的引物Ⅰ 2μL
10μmol/L的引物Ⅱ 2μL
H2O 35μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶） 1U
模板DNA （用量為1pg-1μg） 1μL
4.實驗過程：
移液——離心——擴增
移液
離心
擴增
用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分
待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）
參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。
循環程序 變性 復性 延伸
預變性
94℃,5min
30次
94℃,30s
55℃,30s
72℃,1min
最后一次
94℃,1min
55℃,30s
72℃,10min
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可根據目的片段長度適當調整延伸時間
預變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合。
注意事項
為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
PCR擴增不能隨意加大試劑用量。
①DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動。
②在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。電泳時，DNA分子的相對分子質量越大，受到的阻力越大，遷移速率越慢；反之，越快。
③通過凝膠成像儀或紫外透射儀觀察和記錄電泳結果。
5.電泳鑒定原理：
微量離心管
電泳裝置
微量移液器
實際上是進行PCR反應的場所
用于向微量離心管轉移PCR配方中的液體
包括電泳儀、電泳槽等
6.電泳所需器材：
（1）無菌水、瓊脂糖；
（2）電泳緩沖液（TAE或TBE），維持電泳過程中合適的PH；
（3）凝膠載樣緩沖液（內含指示劑——溴酚藍），又叫上樣緩沖液；
目的：1.增加樣品密度，保證DNA均勻的沉入加樣孔，2.加溴酚藍可監測
電泳進程）
（4）核酸染料（常用核酸染料為EB即溴化乙錠），可在300nm的紫外燈下觀察到。
7.電泳所需試劑
8.電泳具體步驟
配置凝膠溶液—制備凝膠—加樣—電泳—觀察記錄
配制瓊脂糖溶液
根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻
制備凝膠
將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜
加樣
將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物
電泳
接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳
觀察記錄
取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相
結果分析與評價
1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？
可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。進行電泳鑒定的結果應該是一條條帶，該片段大小約為750bp。
2.沒擴增出條帶，可能的原因有：
3.如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：
漏加了PCR的反應成分（引物、酶、模板、原料等），PCR程序設置不當等。
1.引物設過短與非目的序列有同源性;2.引物之間形成了引物二聚體；3.退火溫度過低，非特異性片段多；DNA聚合酶的質量不好等。
1．PCR技術
變性
退火
延伸
在約94℃高溫下，作為模板的雙鏈DNA解旋（變性）為兩條單鏈DNA。
反應體系的溫度降至約55℃，2條引物分別與對應單鏈DNA上的特定部位配對。
溫度回升到約72℃，4種dNTP根據堿基互補配對原則，在Taq酶的作用下連接到引物3'端，引物鏈延伸，形成互補的DNA雙鏈。
2．利用PCR技術擴增DNA片段并完成電泳鑒定
配制PCR反應體系
設置程序進行擴增
配制瓊脂糖凝膠液
制備凝膠加樣緩沖液
加PCR產物
電泳
凝膠成像儀記錄電泳結果
對比分析
1．下列有關PCR過程的敘述，不正確的是（ ）
A．變性過程中破壞的是DNA分子內堿基對之間的氫鍵
B．復制過程中引物與DNA模板鏈的結合依靠堿基互補配對原則完成
C．延伸過程中需要DNA聚合酶、四種核糖核苷酸
D．PCR技術與細胞內DNA復制相比所需要的酶的最適溫度較高
C
2．PCR是一種體外擴增DNA的技術，模擬了體內的DNA復制過程。下圖為PCR技術的原理示意圖，對于圖中物質和過程的說明，錯誤的是（ ）
A．物質a：游離的dNTP
B．過程①：氫鍵斷裂
C．過程②：邊解旋邊復制
D．過程③：遵循堿基互補配對原則
C

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