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(共22張PPT)
第1節 基因工程及其技術
第4課時
利用大腸桿菌生產人類胰島素，我們已經獲取了胰島素基因，接下來該如何使其在大腸桿菌中穩定存在呢？
第二步：基因表達載體的構建
二、基因表達載體的構建——核心
1、目 的：
確保基因在受體細胞中穩定存在，并且遺傳給下一代， 使目的基因能夠有效表達。
思考1：若要干擾素基因在大腸桿菌中穩定存在，并能夠表達和發揮作用，載體還需要哪些結構？(閱讀課本97頁內容)
a、復制原點
b、目的基因
c、啟動子
d、終止子
位于基因的上游,是RNA聚合酶結合位點，驅動基因轉錄出mRNA
位于基因的下游,終止轉錄
e、標記基因
DNA復制起點
思考2：各個元件有什么作用？(閱讀課本97頁內容)
能控制表達所需要的特殊性狀
初步篩選接受了目的基因受體細胞
①用一定的限制酶切割載體，使其出現一個切口，露出黏性末端。
②用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③將切下的目的基因片段拼接到載體的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子。
2、過 程：
補充1：單酶切體系總結：
①質粒、目的基因會發生自身環化連接
②質粒與目的基因會發生反向連接
缺點：
補充2：雙酶切體系總結：
思考：雙酶切有什么優點？
（1）不破壞目的基因：切點應位于目的基因兩端，如圖甲中可選擇PstⅠ，而
不選擇SmaⅠ。
（2）保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點：所選擇的限制酶盡量不
要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ。
補充3：限制酶的選擇原則
1.結合基因表達載體模式圖分析以下問題：
(1)圖中a、b、c分別代表什么結構？
a為啟動子、b為終止子、c為復制原點。
(2)啟動子和終止子與起始密碼子和終止密碼子是一回事嗎？
不是，啟動子和終止子位于DNA上，是基因表達載體必需的部分。而起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開始和結束。
(3)為什么目的基因要插入啟動子和終止子之間？
啟動子位于目的基因的首端使轉錄開始，終止子位于目的基因的尾端，使轉錄終止；只有順序正確，目的基因才能正常轉錄。
主要是農桿菌轉化法
①農桿菌特點：
三、將目的基因導入受體細胞
易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力
②原理：農桿菌含有Ti質粒，其上的T-DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。
1. 將目的基因導入植物細胞的方法
③轉化過程:
Ti質粒
目的基因
構建
表達載體
導入
植物細胞
插入
植物細胞染色DNA
表達
新性狀
轉入
農桿菌
小組討論：
農桿菌轉化法中兩次拼接、兩次導入的目的：
(1)兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上。
(2)兩次導入：第一次導入是將含目的基因的重組Ti質粒導入農桿菌；第二次導入(非人工操作)是將含目的基因的T－DNA導入受體細胞。
2. 將目的基因導入動物細胞
①常用方法：
顯微注射技術
②常用受體細胞：
受精卵
③基本操作程序：
將含有目的基因
的表達載體提純
受精卵
顯微
注射
早期胚
胎培養
胚胎移植
發育成為具有
新性狀的動物
注意：對于動物來說，受體細胞一般是受精卵，受精卵具有體積大、易操作、經培養可直接表達性狀的優點。
繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少等。
3.將目的基因導入微生物細胞
①原核生物的特點：
②常用方法：
Ca2+處理法（感受態細胞法）
首先用 Ca2+ 處理大腸桿菌細胞 → 感受態細胞 → 將重組表達載體 DNA分子與感受態細胞混合 → 感受態細胞吸收 DNA 分子。
③基本操作程序：
Ca2+的作用：增加細胞壁的通透性
1.檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因
① 首先取出轉基因生物的基因組DNA；
A 方法:
DNA分子雜交
B 過程:
② 將人工合成的目的基因的DNA片段用放射性同位素標記或熒光標記,以此做探針；（單鏈）
③ 使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中。
四、目的基因及其表達產物的檢測鑒定
2.檢測目的基因是否轉錄出了mRNA
①方法:
分子雜交法
②過程:用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA。
3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質
方法：抗原-抗體雜交法
4.個體生物學水平的鑒定
轉基因生物 鑒定方法 成功標志
抗蟲植物
抗病毒（菌）植物
抗鹽植物
抗除草劑植物
獲取目的基因產物的轉基因生物
飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）
害蟲死亡
病毒（菌）感染（抗病接種實驗）
未出現病斑
鹽水澆灌
正常生長
噴灑除草劑
正常生長
提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較
功能、活性正常
1.研究表明，將豌豆早枯病毒(PEBV)的復制酶C端編碼序列轉入煙草后，轉基因煙草會對PEBV表現出抗性。下列說法正確的是
A.該過程需要用到限制酶和DNA聚合酶來構建基因表達載體
B.將豌豆早枯病毒(PEBV)的復制酶C端編碼序列導入煙草細胞最常用的
方法是Ca2＋處理法
C.只要在轉基因煙草細胞內檢測出豌豆早枯病毒(PEBV)的復制酶C端編
碼序列就代表成功了
D.檢測轉基因生物DNA上是否插入了目的基因，可以用DNA分子雜交法
√
2.在檢測抗蟲基因是否成功轉入棉花基因組的方法中，不屬于分子水平的是
A.觀察害蟲吃棉葉是否死亡
B.檢測目的基因片段與DNA探針能否形成雜交帶
C.檢測目的基因轉錄形成的mRNA與DNA探針能否形成雜交帶
D.檢測目的基因表達產物蛋白質能否與特定抗體形成雜交帶
√
1.目的基因的篩選與獲取
4.目的基因的檢測與鑒定
2.基因表達載體的構建
3.將目的基因導入受體細胞
基因工程的基本操作程序

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