資源簡介

(共32張PPT)
第1節 基因工程及其技術
第3課時
闡明基因工程的原理，能運用流程圖的形式概括出基因工程的基本操作程序。
概述目的基因獲取的4種方法，以及DNA粗提取的具體流程。
如果利用大腸桿菌生產人類胰島素，將需要經過哪些步驟呢？
基因工程的基本操作程序:
目的基因的篩選與獲取
基因表達
載體的構建
將目的基因
導入受體細胞
目的基因的檢測與鑒定
一、目的基因的獲取
1.目的基因主要是________________________
編碼蛋白質的基因
例如：
自主閱讀P94
與生物抗逆性相關的基因
與優良品質相關的基因
與生物藥物和保健品相關的基因
與毒物降解相關的基因
與工業所需用酶相關的基因等
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
終止子
非編碼區
非編碼區
編碼區
編碼區上游
編碼區下游
啟動子
能轉錄相應的mRNA，
進一步編碼（翻譯）
出蛋白質的DNA區段。
不能轉錄為相應的mRNA，不能編碼蛋白質的區段
不能轉錄為相應的mRNA，不能編碼蛋白質的區段
原核細胞基因結構（補充內容）：
非編碼區
非編碼區
編碼區
編碼區上游
編碼區下游
啟動子
終止子
非編碼區：
含有能調控遺傳信息表達的DNA序列。
不轉錄，不編碼蛋白質。
RNA聚合酶識別并結合的位點，驅動基因轉錄出mRNA
啟動子
終止子
本質：
位置：
作用：
是一段有特殊序列結構的DNA片段；
位于基因上游；
本質：
位置：
作用：
也是一段有特殊序列結構的DNA片段；
位于基因下游；
終止轉錄
非編碼區
非編碼區
編碼區
編碼區上游
編碼區下游
啟動子
終止子
思考：區分啟動子和終止子與起始密碼子和終止密碼子？
啟動子和起始密碼子、終止子和終止密碼子的區別
項目 啟動子 終止子 起始密碼子 終止密碼子
化學 成分 DNA片段 DNA片段 mRNA上三個相鄰堿基 mRNA上三個相鄰堿基
位置 目的基因首端 目的基因尾端 mRNA首端 mRNA尾端
作用 RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出RNA 決定轉錄 的結束 翻譯的 起始信號 決定翻譯過程的結束
真核細胞的基因結構（補充內容）：
編碼區
非編碼區
非編碼區
內含子
外顯子
啟動子
終止子
編碼區上游
編碼區下游
編碼區：
間隔的、不連續的，
有外顯子、內含子之分。
間隔的、不連續的
外顯子：
內含子：
數量關系：外顯子=內含子 + 1
能轉錄相應的mRNA，進一步能編碼蛋白質的DNA序列
能轉錄相應的mRNA，但卻不能編碼蛋白質的DNA序列
原核細胞 真核細胞
不同點 編碼區是_____的 編碼區是間隔的、_____的
相同點 都由能夠編碼蛋白質的________和具有調控作用的________區組成的 原核細胞與真核細胞的基因結構比較
（2）編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？
連續
不連續
編碼區
非編碼
（1）非編碼序列：
包括非編碼區和內含子
2.獲取目的基因的常用方法：
一、目的基因的獲取
從生物組織中直接獲取
化學方法直接人工合成
從基因文庫中獲取目的基因
利用 PCR 技術擴增目的基因
2.1 化學方法直接人工合成
①反轉錄法*：主要用于相對分子質量較大而又不知其核苷酸序列的基因。
它以目的基因的mRNA為模板，借助逆轉錄酶合成雙鏈DNA，其過程如下：
目的基因的mRNA
雙鏈DNA（目的基因）
反轉錄
②化學合成法：a.對比較小的目的基因，明確脫氧核苷酸序列后，可通過DNA合成儀直接人工合成；
DNA合成儀
②化學合成法：b.對于全基因或較大基因，采用半合成的方法。
合成基因的部分寡核苷酸片段
適當條件下退火得到模板—引物復合體
在 dNTP 存在的條件下，通過 Klenow酶將雙鏈 DNA 的突出 5′ 端補平，合成相應的互補鏈，再用相應的 DNA 連接酶修復缺口，獲得兩條完整的互補雙鏈
某種基因的化學合成過程示意圖
2.2 從基因文庫中獲取目的基因
基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多 DNA 片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。
組成：
基因組文庫：
部分基因文庫：
包含一種生物的全部基因
如cDNA文庫
限制酶
基因組DNA
與載體重組
轉化細菌
體外包裝
某種生物的DNA
限制酶
多個DNA片段
與載體重組
導入受體菌儲存
其目的是分離有用的目的基因和
保存某種生物的全部基因。
基因組文庫
與載體重組
反轉錄酶
mRNA
cDNA
特定細胞內的mRNA
反轉錄酶
mRNA-DNA雜合鏈
降解mRNA
單鏈DNA
DNA聚合酶
雙鏈DNA
導入受體菌群儲存
與載體重組
cDNA文庫
基因組文庫和部分基因文庫的比較
文庫類型 cDNA文庫 基因組文庫
文庫大小
基因中啟動子
基因中內含子
基因多少
物種間基因交流
小
大
無
有
無
有
某種生物的部分基因
某種生物的全部基因
可以
部分基因可以
答：用 DNA 探針從基因文庫中準確提取目的基因
根據目的基因的核苷酸序列制成一段與之互補的核苷酸短鏈，并用同位素標記，即成為探針。用這一探針探查基因文庫中已經變性的 DNA 片段（單鏈），如果有一個 DNA 片段能和探針片段互補而結合成雙鏈（分子雜交），這一片段即含有所需要的基因。
思考：1.如何從基因文庫中提取目的基因？
轉錄
初級RNA
成熟mRNA
非編碼區
非編碼區
編碼區
與RNA聚合酶結合位點
外顯子
內含子
1
2
3
4
5
啟動子
終止子
剪切、拼接
DNA聚合酶
單鏈DNA
cDNA
逆轉錄酶
逆轉錄
復制
不含非編碼序列。即不含非編碼區和內含子
2. 真核生物的基因用逆轉錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？
PCR——
多聚酶鏈式反應
是一項在生物體外對目的基因進行擴增的技術。通過此技術，可獲取大量的目的基因（優點）。
2.3 利用 PCR 技術擴增目的基因
原理：
前提：
原料：
方式：
DNA復制
要有一段已知目的基因的核苷酸序列（為了合成引物）
以_______方式擴增，即______（n為擴增循環的次數）
指數
2n
模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩定DNA聚合酶（Taq酶）；
2.3 利用 PCR 技術擴增目的基因
變性：加熱至90℃以上雙鏈DNA高溫下打開
退火：冷卻至55℃左右
DNA引物與單鏈DNA結合
延伸：加熱至72℃左右以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈
變性
退火
延伸
過程：
DNA的 提取和 鑒定
DNA從哪
兒提取？
怎樣將DNA與
細胞中的其他
物質分離？
如何鑒定
——DNA的粗提取與鑒定
2.4 從生物組織中直接獲取
DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精
初步分離 DNA 和蛋白質
DNA 在不同濃度的NaCl 溶液中溶解度不同，能溶于物質的量濃度為2 mol/L的NaCl 溶液，在0.14 mol/L的NaCl 溶液中溶解度最小
溶解DNA
在一定溫度下，DNA被二苯胺試劑染成藍色
鑒定DNA
1.實驗原理：
DNA的粗提取與鑒定
邊做邊學：
2.實驗材料：
一般選取雞血來提取DNA，雞血中血細胞含量高，DNA含量豐富，材料易得，細胞易吸水漲破。也可以選用植物細胞如洋蔥等，只是破碎植物細胞比較麻煩，提取洋蔥DNA時，需先將洋蔥切碎，然后加入一定量的洗滌劑和食鹽，進行充分攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。
注意：該實驗中不能選用豬血處等哺乳動物的血，因為哺乳動物成熟的紅細胞沒有細胞核和各種細胞器。
洗滌劑作用：溶解細胞膜、核膜，釋放出細胞內含物
食鹽的作用：使構成染色體的核蛋白加速解聚，游離出DNA分子，并使DNA分子充分溶解于NaCl溶液中
3.實驗步驟：
制備雞血細胞
取質量濃度為0.1g·mL-1的檸檬酸鈉溶液（防止血液凝固）100mL和新鮮雞血180mL，注入500mL燒杯中，充分攪拌。將混合均勻的雞血細胞液置于4℃冰箱內，靜置一天，使血細胞沉淀。
破碎細胞：取出準備好的雞血細胞液5~10mL，注入50mL燒杯中，并向燒杯中加入20mL蒸餾水，攪拌5min；
提取核內物質：用墊有紗布的漏斗過濾，取其濾液。
破碎細胞，獲取含DNA的濾液
3.實驗步驟：
溶解細胞核內的DNA
取物質的量濃度為2mol·L-1的NaCl溶液40mL加入濾液中，用玻璃棒沿同一方向輕輕攪拌，使其混合均勻，并過濾除去不溶的雜質。
析出含DNA的黏稠物
取適量蒸餾水沿燒杯壁緩緩加入濾液，同時用玻璃棒沿同一方向輕輕攪拌，觀察燒杯中有無絲狀物出現。當絲狀物不再增加時，停止加入蒸餾水。用玻璃棒將絲狀物挑起，這就是含有一定雜質的DNA
4.實驗結果展示：
獼猴桃的DNA
豬肝細胞的DNA
原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大
試管 編號 A（對照組） B（實驗組）
步驟1 2 mol/L的 NaCl溶液5mL 2 mol/L的
NaCl溶液5mL
步驟2 不進行任何處理 加絲狀物或沉淀物
步驟3 加入4mL二苯胺試劑，混勻 加入4mL二苯胺試劑，混勻
步驟4 沸水浴5 min 沸水浴5 min
實驗 現象 溶液不變藍色 溶液逐漸變為藍色
實驗 結論 DNA在沸水浴的情況下遇二苯胺會被染成藍色 DNA的鑒定及結果
小組討論：
2.DNA的粗提取完成后，如何進一步純化上述含有雜質的DNA？
不相同；第一次加入的目的是使雞血細胞吸水漲破，釋放出核物質，
第二次加入的目的是稀釋 NaCl 溶液，從而析出 DNA。
向溶解有 DNA 和蛋白質的溶液中加入適量的、冷卻的、體積分數為95% 的乙醇溶液，溶液中會出現白色絲狀物即 DNA，而部分蛋白質會溶解在乙醇溶液中，這樣可以對 DNA 起到進一步的純化作用。
1.在DNA的粗提取中，兩次加入蒸餾水的作用相同嗎？
目的基因的獲取
目的基因
獲取目的基因的常用方法
從生物組織中直接獲取
化學方法直接人工合成
從基因文庫中獲取目的基因
利用 PCR 技術擴增目的基因
啟動子
終止子
起始密碼子
終止密碼子
內含子
外顯子

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