資源簡介

(共28張PPT)
第2節 微生物的培養技術與應用
（二）微生物的選擇培養和計數（第2課時）
① 從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌
② 統計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌
絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用 的 培養基，可以從土壤中分離出 的細菌。
脲酶
以尿素作為唯一氮源
選擇
分解尿素
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
探究實踐---土壤中分解尿素的細菌的分離和計數
1 實驗目的
2 實驗原理
土壤取樣
制備培養基
土壤稀釋
涂布平板
觀察培養
菌落計數
①取樣地點：酸堿度接近中性，潮濕，肥沃。
（目的細菌適宜在該環境中生長）
②取樣過程：鏟去3cm左右表層土,再取土樣
（細菌絕大部分分布在距地表3～8cm的土壤層）
③注意事項：
取土樣時用的鐵鏟和取樣袋使用前都需要滅菌。操作完成后，要洗手。
3 實驗步驟
土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
①選擇培養基：
②牛肉膏蛋白胨培養基：
作為對照組，來判斷選擇培養基是否具有選擇作用。
以尿素為唯一氮源。
土壤取樣
制備培養基
土壤稀釋
涂布平板
觀察培養
菌落計數
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL
無菌水
90mL無菌水
分離微生物：保證獲得菌落數在30～300之間適于計數的平板。在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，可選用稀釋范圍更大的稀釋液進行平板培養。例如：將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養。
土壤取樣
制備培養基
土壤稀釋
涂布平板
觀察培養
菌落計數
選擇培養基
（實驗組：平行重復）
牛肉膏蛋白胨培養基(作為對照)
（用以判斷選擇培養基是否具有選擇作用）
測細菌時，一般選用104、105、106倍稀釋的稀釋液進行平板培養。
土壤取樣
制備培養基
土壤稀釋
涂布平板
觀察培養
菌落計數
組別 具體組別 具體操作 作用
實驗組 實驗組1 涂布接種的選擇培養基 三次重復排除偶然因素對實驗
結果的影響，用以分離并計數
能分解尿素的細菌。
實驗組2 涂布接種的選擇培養基 實驗組3 涂布接種的選擇培養基 對照組1 涂布接種的牛肉膏蛋白胨培養基
對照組 對照組2 不涂布接種的選擇培養基
對照組3 不涂布接種的牛肉膏蛋白胨培養基
實驗現象
實驗組1、2、3分離得到尿素分解菌的單菌落；
對照組1：得到多種菌落且菌落數明顯多于實驗組；對照組2、3 組正常情況下無菌落。
檢驗選擇培養基是否具有選擇作用。
檢驗選擇培養基中是否有雜菌污染。
檢驗牛肉膏蛋白胨培養基中是否有雜菌污染。
① 培養條件：細菌一般在30～37℃的溫度下培養1～2d。
② 觀察：每隔24h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果。防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。
③ 一般來說，在相同的培養條件下，同種微生物表現出穩定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。
注意事項：本實驗使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標記。例如，在標記培養皿（皿底）時應該注明組別、培養日期和平板上培養樣品的稀釋度等。
土壤取樣
制備培養基
土壤稀釋
涂布平板
觀察培養
菌落計數
102
103
104
105
106
需要的平板，要做好標記
當菌落數目穩定時，選取菌落數在30~300的平板進行計數，同一稀釋度下至少計數3個平板，求出平均值，并根據所對應的稀釋度計算出樣品中細菌的數目。設計如下表格記錄并計數。
稀釋度 104 105 106 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值
每個平板的菌落數
土壤取樣
制備培養基
土壤稀釋
涂布平板
觀察培養
菌落計數
102
103
104
105
106
已接種的稀釋不同倍數的的選擇培養基培養結果
4 結果評價與分析
空白對照
稀釋106倍
菌落數 52
菌落數 63
菌落數 77
思考：你能計算出每克土樣中分解尿素的細菌數嗎？
每g樣品中的菌落數＝
(64÷0.1)×106
=6.4×108個
-----如果沒有接種的培養基上沒有菌落生長，說明培養基沒有被雜菌污染。
------如果接種后的完全培養基上的菌落數明顯多于選擇培養基上的菌落數，說明選擇培養基篩選出了一些尿素分解菌。
(1)結合對照組，分析培養物中是否有雜菌污染以及選擇培養基是否篩選出一些菌落。
(2)你是否獲得了某一稀釋度下菌落數為30~300的平板？在這一稀釋度下，是否至少有2個平板的菌落數接近？
------如果得到了兩個或多個菌落數為30～300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進行菌落的計數。
------如果是用同一土樣進行的操作，數據應該比較接近。如果差異很大，就需要從操作是否規范、培養基配制是否合理等方面查找原因。
(3)你統計的每克土樣中能分解尿素的細菌的菌落數是多少？與其他同學統計的結果接近嗎？如果差異很大,可能是什么原因引起的？
① 各操作細節要保證“無菌”。如移液管要經過滅菌，
梯度稀釋時，試管口和移液管在離火焰1~2cm處，涂布器要經過灼燒滅菌等。
② 將涂布器浸在盛有質量分數為70%的酒精的燒杯中。取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼燒。
③ 操作中要注意防火。不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。
④ 涂布結束后，應將一個未接種的培養基和已接種的培養基放在一起培養，以檢測培養基是否有雜菌污染。
注意事項
(1)在以尿素作為唯一氮源的培養基中分離出的微生物都是能分解尿素的嗎？
-----不一定。
-----如固氮菌或利用尿素分解菌的代謝物進行生長繁殖的微生物，
5 進一步探究
因此能在選擇培養基上生長的微生物不一定都是所需的微生物，還需要進一步的驗證。
在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑。
培養某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。
脲酶催化尿素分解成氨→培養基堿性增強→ 酚紅變紅
酚紅培養基——鑒定分解尿素的細菌
原 理
(2)鑒定
鑒別培養基
伊紅和美藍培養基鑒別大腸桿菌
剛果紅培養基鑒別纖維素分解菌
在基礎培養基中，加入某種特殊的化學物質，這種物質會與某種微生物的代謝物發生反應，產生明顯的特征性變化，根據這種特征性變化，就可將該種微生物與其他微生物區分開來。
項目 選擇培養基 鑒別培養基
原理 加入不影響甚至促進目標微生物生長，而抑制或阻止其他種類微生物生長的化學物質 加入某種指示劑或化學藥品(不影響微生物正常生長)，使微生物的某種代謝產物與培養基中的特定指示劑或化學藥品發生反應
用途 培養、分離出目標微生物 鑒別目標微生物
舉例 培養酵母菌和霉菌時，可在培養基中加入青霉素，抑制細菌的生長；利用以尿素為唯一氮源的培養基來培養可分解尿素的細菌 可用伊紅美藍培養基鑒定飲用水或乳制品中是否含有大腸桿菌(若有，則菌落呈黑色)
大腸桿菌
尿素分解菌
隨堂練習
1．下列關于“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數”實驗操作的敘述，不正確的是(　　)
A．利用稀釋涂布平板法估算菌落數目的關鍵是有恰當的稀釋度
B．若要判斷選擇培養基是否起到了選擇作用，需要設置未接種的牛肉膏蛋白胨培養基作為對照
C．該實驗應采用稀釋涂布平板法
D．用以尿素為唯一氮源且添加了酸堿緩沖劑的培養基來培養該細菌后不會使酚紅指示劑變紅
B
小資料
在實際應用中，有時需要配制兼具選擇作用和鑒別作用的培養基。例如，金黃色葡萄球菌可耐高濃度的NaCl，且能利用甘露糖醇產酸，可以根據這些特點來設計培養基，選擇并鑒別金黃色葡萄球菌：在培養基中加入濃度為7.5%的NaCl、甘露糖醇和酸堿指示劑，金黃色葡萄球菌能夠在這種培養基中生長，如果觀察到有些菌落周圍培養基顏色發生變化，可以推斷這些菌落是金黃色葡萄球菌，之后再進行進一步鑒定。如果在以尿素為唯一氮源的選擇培養基中加入酚紅指示劑，可以初步鑒定尿素分解菌，這種培養基也是一種既有選擇作用又有鑒別作用的培養基。
微生物的數量測定
選擇培養基的作用
微生物選擇培養獲取純培養物的方法-稀釋涂布平板法
微
生
物
的
選
擇
培
養
和
計
數
選擇培養基
微生物的選擇培養
科學實例
篩選原則
選擇培養基的概念及舉例
稀釋涂布平板法的操作過程
間接計數法 — 稀釋涂布平板法
直接計數 —計數板計數法
土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
培養基的制備
實驗設計
（1）土壤取樣
（2）樣品的稀釋
（3）稀釋涂布平板法接種
（4）微生物的培養與觀察
結果分析
【課堂小結】
一概念測驗
1研究人員用無機鹽、瓊脂和石油配制的培養基從被石油污染的土壤中篩選出了一種石油降解菌。判斷下列相關表述是否正確。
① 這種培養基是一種選擇培養基。（ ）
② 利用這種石油降解菌可以降解石油。修復土壤。（ ）
③ 相對于未被污染的土壤,從被石油污染的土壤中更容易分離到石油降解菌。（ ）
2用稀釋涂布平板法來統計樣品中的活菌數時，通過統計平板上的菌落數就能推測出樣品中的活菌數,原因是（ ）
A. 菌落中的細菌數目是固定的
B. 平板上的一個菌落就是一個細菌
C. 通過此方法統計的菌落數與活菌的實際數目相同
D. 平板上的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌
√
√
√
D
練習與應用
二 拓展應用
1反芻（chú）動物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活著多種微生物，其中許多微生物能分解尿素。請你設計一個實驗從瘤胃中分離出能夠分解尿素的微生物。
提示：反芻動物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會死亡，因此分離其中能分解尿素的微生物除了需要準備選擇培養基，還應該參照厭氧菌的培養方法進行實驗設計。
2 地球上的植物每年產生的纖維素超過70億噸，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，這是因為它們能夠產生纖維素酶。對這些微生物的研究與應用，使人們能夠利用精桿等生產酒精，用纖維索酶處理服裝面料等。已知剛果紅是一種染料，它可以與纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不與水解后的纖維二糖、葡萄糖等發生這種反應。當我們在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅與纖維素形成紅色復合物；而當纖維索被纖維素分解菌分解后，復合物就無法形成，培養基中會出現以這些菌為中心的透明圈
（1）現在要從土壤中分離纖維素分解菌，請你給出詳細的實驗方案。
提示：可以參考本節“探究 實踐”中的設計思路進行設計。
土壤取樣
制備培養基
土壤稀釋
涂布平板
觀察培養
菌落計數
（2)你打算到什么環境中去尋找纖維素分解菌？為什么？
提示：纖維素分解菌大多分布在富含纖維素的環境中，采集土樣時，可以選擇纖維素豐富的環境，如樹林中多年落葉形成的腐殖土等。
（3)有同學說，可以把濾紙埋在土壤中，經過一段時間后，再從已腐爛的濾紙上篩選纖維素分解菌。請你評價這一做法。
提示：這是人工設置適合纖維素分解菌生存的環境,腐爛的濾紙上很可能有纖維素分解菌。

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