資源簡介

(共38張PPT)
3.2
基因工程的基本操作程序
你知道轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？
培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟呢？
培育轉基因抗蟲棉的四個步驟：
與載體拼接
普通棉花
（無抗蟲特性）
棉花細胞
抗蟲棉
（有抗蟲特性）
導入
抗蟲基因
重組DNA分子
1.目的基因的篩選與獲取
2.基因表達載體的構建
3.將目的基因導入受體細胞
4.目的基因的 檢測與鑒定
一、第一步：目的基因的篩選與獲取（P76）
1.目的基因
⑴概念：
在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因就是目的基因。
如：與生物抗逆性、優良品質、生產藥物、毒物降解和工業用酶等相關基因。
主要是編碼特定蛋白質的基因，
也可以是具有調控作用的因子。
Bt抗蟲蛋白基因，簡稱Bt基因
Bt抗蟲蛋白
使棉花抗蟲
一、第一步：目的基因的篩選與獲取（P76）
1.目的基因
⑵實例：
培育轉基因抗蟲棉用到的Bt抗蟲蛋白基因，簡稱Bt基因。
蘇云金芽孢桿菌
產生
Bt 基因
伴胞晶體蛋白
（Bt抗蟲蛋白）
表達
破壞鱗翅目昆蟲的消化系統
殺死棉鈴蟲
導入
抗蟲棉
培育
棉花細胞
一、第一步：目的基因的篩選與獲取（P76）
2.篩選合適的目的基因
①從相關已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。
②利用序列數據庫和序列比對工具進行篩選。
蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關
掌握了Bt基因的序列信息。
Bt蛋白分解為多肽后，與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，造成害蟲死亡。
Bt蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環境中才表現出毒性，人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體。
Q：篩選出來的目的基因如何獲取？
一、第一步：目的基因的篩選與獲取（P76）
3.獲取目的基因的方法
人工合成
從基因文庫中獲取
利用PCR獲取和擴增目的基因
一、第一步：目的基因的篩選與獲取（P76）
3.獲取目的基因的方法
⑴人工合成目的基因
①前提：基因比較小、核苷酸序列已知
②方法：通過DNA合成儀用化學方法直接合成
⑵從基因文庫中獲取
將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。
蛋白質的
氨基酸序列
mRNA的
核苷酸序列
基因的
核苷酸序列
目的基因
推測
推測
化學合成
DNA合成儀
基因組文庫
部分基因文庫（如cDNA文庫）
生物材料
人工合成
獲取目的基因
DNA
cDNA
一定大小范圍的DNA
PCR
mRNA
基因組文庫 cDNA文庫
基因文庫
包括
限制酶
酶切
逆轉錄
導入受體菌中保存
一、第一步：目的基因的篩選與獲取（P76）
3.獲取目的基因的方法
⑶利用PCR獲取和擴增目的基因
①概念：
PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。是一項根據DNA半保留復制的原理，通過在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。（穆里斯）
Q：PCR需要什么條件呢？先回顧DNA的復制過程！
PCR擴增儀/PCR儀
參與的組分 在DNA復制中的作用
解旋酶 打開DNA雙鏈
DNA母鏈 提供DNA復制的模板
4種脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈
ATP 為合成DNA子鏈供能
引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸
體內DNA復制所需的基本條件
Q：體外復制怎么改進？
參與的組分 在DNA復制中的作用
解旋酶 打開DNA雙鏈
DNA母鏈 提供DNA復制的模板
4種脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈
ATP 為合成DNA子鏈供能
引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸
體內DNA復制所需的基本條件
體外用
高溫代替
體外用耐高溫的DNA聚合酶
一般為DNA單鏈
引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物長度通常為20 30個核苷酸。
3′
5′
DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有鏈的3′-端，即子鏈的延伸方向是5 ′→3 ′。
由于DNA聚合酶不能將單個的核苷酸鏈連接成鏈，因此子鏈合成需要引物（最初的已有鏈）。
DNA聚合酶
3′
5′
模板鏈
DNA復制 參與的組分 PCR技術 參與的組分 在DNA復制中的作用
DNA母鏈 模板：2條DNA母鏈 提供DNA復制的模板
4種脫氧核苷酸 原料：dNTP（4種脫氧核苷酸） 合成DNA子鏈的原料
能量：ATP 能量：dNTP 為合成DNA子鏈供能
解旋酶 解旋酶：體外用高溫代替 打開DNA雙鏈
DNA聚合酶 DNA聚合酶：耐高溫（Taq酶） 催化合成DNA子鏈
引物：2種小分子單鏈核酸片段 使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸
一定的緩沖液（Mg2＋） 真核細胞和細菌的DNA聚合酶需要Mg2＋激活
PCR技術所需的基本條件：
在PCR過程中實際加入的為dNTP（實質加入的是4種脫氧核苷三磷酸，即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。
ATP結構中的五碳糖為核糖，而dATP結構中的五碳糖為脫氧核糖。 ATP轉移掉兩個磷酸基團后剩下的結構就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是轉錄的底物。同理，dATP轉移掉兩個磷酸基團后剩下的結構就是腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA復制的底物。
一、第一步：目的基因的篩選與獲取（P76）
3.獲取目的基因的方法
⑶利用PCR獲取和擴增目的基因
②條件：
微量離心管
緩沖液
（Mg2＋）
DNA模板
4種脫氧核苷酸（dNTP）
2種引物
耐高溫的DNA聚合酶
一、第一步：目的基因的篩選與獲取（P76）
3.獲取目的基因的方法
⑶利用PCR獲取和擴增目的基因
②條件：
微量離心管
離心處理后
一、第一步：目的基因的篩選與獲取（P76）
3.獲取目的基因的方法
⑶利用PCR獲取和擴增目的基因
②條件：
一、第一步：目的基因的篩選與獲取（P76）
3.獲取目的基因的方法
⑶利用PCR獲取和擴增目的基因
③反應過程：變性→復性→延伸
90
50
72
℃
延伸
90
50
72
℃
變性
90
50
72
℃
復性
PCR反應過程：
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.變性
當溫度超過90℃時，雙鏈DNA解聚為單鏈。
B.復性
當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。
C.延伸
當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
PCR反應過程：
第一輪循環的產物作為第二輪反應的模板，經過變性、復性和延伸三步產生第二輪循環的產物。
第二輪循環的產物作為第三輪反應的模板，經過變性、復性和延伸三步產生第三輪的產物。
第二輪循環的產物
第三輪循環的產物
第一輪循環
第二輪循環
第三輪循環
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
Q1：n次循環后，DNA分子數為 。
（或DNA鏈有 條。
Q2：n代后，共消耗引物
個。
（或 對）
2n
2n+1
2n+1-2
2n-1
非目的基因序列
目的基因序列
引物
Q3：在第幾次循環產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段（即完整的目的基因）？
5’
3’
5’
5’
第一次循環
第二次循環
3’
5’
第三次循環
3’
3’
目的基因
目的基因
在第三次循環產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段（即完整的目的基因）。n代后，等長目的基因有 個。
2n-2n
一、第一步：目的基因的篩選與獲取（P76）
3.獲取目的基因的方法
⑶利用PCR獲取和擴增目的基因
④結果：
1個模板DNA分子經過n輪PCR，以指數方式擴增，可以擴增出2n個DNA片段。
⑤PCR產物的鑒定：
瓊脂糖凝膠電泳　
變性
90℃以上
延伸
72℃左右
復性
50℃左右
基本過程
100bp
200bp
300bp
400bp
500bp
600bp
700bp
800bp
1,200bp
1,000bp
900bp
標準
樣品1
樣品2
樣品3
Q4.利用PCR可以擴增mRNA嗎？
mRNA不可以直接擴增，需逆轉錄成cDNA再進行擴增，稱為逆轉錄PCR，簡稱RT-PCR。
1.3 傳統發酵技術
思考·討論：目的基因的篩選與獲取（P79）
單鏈RNA
DNA-RNA
雜交分子
單鏈DNA
雙鏈DNA
逆轉錄酶
核酸酶H
降解RNA鏈
DNA聚合酶
思考·討論：基因表達載體的構建（P79）
Q.獲得了足量的Bt基因后，是否能直接將Bt基因導入棉花細胞呢？
就算可以進行轉錄和翻譯成蛋白質，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂進行復制，導致子代細胞不再含有目的基因
游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解
不能原因
那怎樣才能讓基因在受體細胞中穩定存在，并且遺傳給下一代呢？
培育轉基因抗蟲棉的四個步驟：
與載體拼接
普通棉花
（無抗蟲特性）
棉花細胞
抗蟲棉
（有抗蟲特性）
導入
抗蟲基因
重組DNA分子
1.目的基因的篩選與獲取
2.基因表達載體的構建
3.將目的基因導入受體細胞
4.目的基因的 檢測與鑒定
二、第二步：基因表達載體的構建（P80）
1.構建目的
⑴使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且遺傳給下一代。
⑵使目的基因能夠在受體細胞中表達和發揮作用。
2.基因表達載體的組成
基因工程的核心工作
位置：基因的上游（一段有特殊結構的DNA片段）
功能：RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA
目的基因必須插入到啟動子與終止子之間
位置：基因的下游（一段特殊的DNA片斷）
功能：終止轉錄
鑒別和篩選出受體細胞中是否含有目的基因
DNA復制的起始位點，DNA聚合酶識別和結合位點
拓展延伸
啟動子的類型：
①組成型啟動子：每種組織器官中均發揮作用。
②組織特異性啟動子：特定組織器官中才能發揮作用。
③誘導型啟動子：特定條件下（光、溫度、化學物質等）刺激才能發揮作用。
誘導型啟動子
誘導物
作用
激活或抑制
目的基因表達
誘導型啟動子：
拓展延伸
啟動子與終止子：
位于DNA分子中，
作用：起始和終止轉錄過程。
起始密碼子與終止密碼子：
位于mRNA分子中，
作用：起始和終止翻譯過程。
“啟動子與終止子”VS“起始密碼子與終止密碼子”
二、第二步：基因表達載體的構建（P80）
3.構建過程
① 用一定的限制酶切割載體，使其出現一個切口。
② 用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③ 將切下的Bt基因片段拼接到載體的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子。
Q1.“載體”＝“基因表達載體”？
思考·討論：目的基因的篩選與獲取（P79）
載體 ≠ 基因表達載體
二者都有：標記基因和復制原點兩部分DNA片段。
基因表達載體：在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子。
Q2.構建基因表達載體時目的基因插入的位置應該在哪里？為什么？
思考·討論：目的基因的篩選與獲取（P79）
啟動子下游和終止子上游。
因為只有插入在啟動子和終止子之間，目的基因才可以正常表達。
標記基因
啟動子
插入目的基因
終止子
復制原點
限制酶切割位點
Q3.使用一種DNA限制酶切割，有幾種連接情況？如何解決？
思考·討論：目的基因的篩選與獲取（P79）
載體
目的基因
自連
片段間的連接
目的基因自連
質粒自連
目的基因與質粒連接
目的基因與目的基因連接
質粒與質粒連接
正向連接 反向連接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
1’
1
雙酶切：①可以防止目的基因與載體的反向連接
②還可以防止質粒、目的基因的自身環化連接
二、第二步：基因表達載體的構建（P80）
4.限制酶的選擇原則
①不破壞目的基因原則
②保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則
③確保出現相同黏性末端原則（善用“雙酶切”，注意方向性，巧用“同尾酶”）
拓展延伸
1.原核基因的結構和表達
翻 譯
轉 錄
mRNA
蛋白質
拓展延伸
加 工
轉 錄
mRNA前體
成熟mRNA
外顯子
內含子
翻 譯
蛋白質
2.真核基因的結構和表達
外顯子： 能夠編碼蛋白質的序列
內含子： 不能夠編碼蛋白質的序列(共53張PPT)
3.2
基因工程的基本操作程序
培育轉基因抗蟲棉的四個步驟：
與載體拼接
普通棉花
（無抗蟲特性）
棉花細胞
抗蟲棉
（有抗蟲特性）
導入
抗蟲基因
重組DNA分子
1.目的基因的篩選與獲取
2.基因表達載體的構建
3.將目的基因導入受體細胞
4.目的基因的 檢測與鑒定
受體細胞類型
植物細胞
動物細胞
微生物細胞
農桿菌轉化法
花粉管通道法
我國科學家獨創
常用
顯微注射法
Ca2+處理法
三、第三步：將目的基因導入受體細胞（P80）
1.目的基因導入植物細胞
⑴花粉管通道法
①操作方式：
Ⅰ.用微量注射器
將含目的基因的
DNA 溶液直接
注入子房中
含目的基因的DNA 溶液
三、第三步：將目的基因導入受體細胞（P80）
1.目的基因導入植物細胞
⑴花粉管通道法
①操作方式：
Ⅱ.在植物受粉后的
一定時間內，剪去
柱頭，將DNA溶液
滴加在花柱切面上，
使目的基因借助花
粉管通道進入胚囊。
1.目的基因導入植物細胞
⑴花粉管通道法
②原理：
利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，將外源基因攜帶進入胚囊，此時的受精卵未形成細胞壁，且正在進行活躍的DNA復制，容易將外源DNA片段整合到受體基因組中。
③優點：
操作簡單、技術成本低，免去了組織培養及誘導再生植株的全套人工培養過程。
三、第三步：將目的基因導入受體細胞（P80）
轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。實質是基因重組。
農桿菌：是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有侵染能力。
農桿菌
挑食
三、第三步：將目的基因導入受體細胞（P80）
1.目的基因導入植物細胞
⑵農桿菌轉化法
①原理：
農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T-DNA（可轉移的DNA）轉移到被侵染的細胞、并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。
雙子葉、裸子植物
受損
傷口分泌酚類物質和糖類物質
吸引農桿菌向受傷組織集中
將Ti質粒上的T-DNA（可轉移的DNA）轉移到被侵染的細胞中，并且將其整合到該細胞染色體DNA上
激活Vir區基因，導致T-DNA加工和轉移
三、第三步：將目的基因導入受體細胞（P80）
1.目的基因導入植物細胞
⑵農桿菌轉化法
②過程：
構建
表達載體
導入
目的基因
插入
植物細胞染色體DNA上
表達
新性狀
轉入
農桿菌
Ti質粒
目的基因
植物細胞
拓展延伸
構建
表達載體
導入
目的基因
插入
植物細胞染色體DNA上
表達
新性狀
轉入
農桿菌
Ti質粒
目的基因
植物細胞
⑴兩次拼接
第一次：目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上
第二次（非人工操作）：被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上
⑵兩次導入
第一次：將含目的基因的重組Ti質粒導入農桿菌（Ca2＋處理法）
第二次（非人工操作）：含目的基因的T-DNA導入受體細胞
三、第三步：將目的基因導入受體細胞（P80）
1.目的基因導入植物細胞
⑵農桿菌轉化法
③受體細胞：
體細胞或受精卵
④具體轉化方法：
a.可以將從新鮮的葉片上取下的圓形小片與農桿菌共培養，然后篩選轉化細胞，并再生成植株。
b.可以將花序直接浸沒在含有農桿菌的溶液中一段時間，然后培養植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定等。
三、第三步：將目的基因導入受體細胞（P80）
2.目的基因導入動物細胞
⑴方法：顯微注射法
⑵受體細胞：受精卵
⑶過程：
構建基因表達載體并提純
利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中
早期胚胎培養
胚胎移植
獲得具有新性狀的動物
Q：為什么選受精卵作為受體細胞？
①體積大，易操作
②易表現出全能性
3.目的基因導入微生物細胞
⑴方法：Ca2+處理法
⑵受體細胞：原核細胞（常選擇大腸桿菌）
三、第三步：將目的基因導入受體細胞（P80）
Ca2+的作用：增加細胞壁的通透性，可使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態（感受態細胞）。
優點：繁殖快，多為單細胞，遺傳物質相對較少，易于培養。
Ca2+
感受態細胞
吸收
3.目的基因導入微生物細胞
⑶實例：利用轉基因大腸桿菌生產藥物
三、第三步：將目的基因導入受體細胞（P80）
Q：為何導入的不是胰島素基因而是cDNA？大腸桿菌生產出的胰島素具有生物活性？
①原核生物細胞里沒有相應的酶來去除內含子
②原核生物沒有真核的蛋白質加工系統（如內質網、高爾基體等）
ps：在生產需要加工和分泌的蛋白質時，酵母菌比大腸桿菌更有優勢。
拓展延伸
1.原核基因的結構和表達
翻 譯
轉 錄
mRNA
蛋白質
拓展延伸
加 工
轉 錄
mRNA前體
成熟mRNA
外顯子
內含子
翻 譯
蛋白質
2.真核基因的結構和表達
外顯子： 能夠編碼蛋白質的序列
內含子： 不能夠編碼蛋白質的序列
受體細胞 植物細胞 動物細胞 微生物細胞
常用方法
受體細胞
轉化過程 以農桿菌轉化法為例： 將目的基因插入Ti質粒的T-DNA上 ↓ 轉入農桿菌中 ↓ 導入植物細胞 ↓ 整合到受體細胞的DNA上 提純含目的基 因的表達載體 ↓ 顯微注射 ↓ 受精卵發育 ↓ 具有新性 狀的個體 Ca2＋處理細胞
↓
感受態細胞
↓
基因表達載體與
感受態細胞混合
↓
感受態細胞
吸收DNA分子
花粉管通道法、農桿菌轉化法、基因槍法
體細胞或受精卵
顯微注射技術
受精卵
Ca2＋處理法
原核細胞
按前面三個步驟進行了操作，是否可以確定Bt基因進入了受體細胞并能維持穩定？是否表達出Bt蛋白？表達出的Bt蛋白是否具有殺蟲的功效？
如何判斷？
培育轉基因抗蟲棉的四個步驟：
與載體拼接
普通棉花
（無抗蟲特性）
棉花細胞
抗蟲棉
（有抗蟲特性）
導入
抗蟲基因
重組DNA分子
1.目的基因的篩選與獲取
2.基因表達載體的構建
3.將目的基因導入受體細胞
4.目的基因的 檢測與鑒定
之前我們使用過標記基因檢測目的基因是否插入，還記得嗎？
拓展延伸
β-半乳糖苷酶可分解無色的X-gal并產生藍色的產物，使菌落呈現藍色，否則菌落為白色。將大腸桿菌與基因表達載體混合培養一段時間后，將大腸桿菌接種到添加____________________的培養基上培養，待長出菌落后，應挑選______的菌落作為工程菌生產人胰島素。
氨芐青霉素和X-gal
白色
目的基因插入位點
標記基因
目的基因插入位點
導入重組質粒
導入原質粒
導入目的基因
未導入成功
在加入氨芐青霉素和X-gal 的培養基中
白色活菌
藍色活菌
死亡
死亡
白色
Q1.基因表達載體中已經具備標記基因（如抗生素抗性基因），對受體細胞進行了篩選，為什么基因工程的第四步還要對目的基因進行檢測和鑒定？
在含抗生素的選擇培養基上能生長的是導入了載體的細胞，載體可能是基因表達載體，也可能是未插入目的基因的空載體。因此，需要對目的基因是否導入進行進一步的檢測。此外，即便在選擇培養基上能生長的細胞中導入的是基因表達載體，但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正確，能否正確表達，因此也需要在轉錄和翻譯以及個體水平上進行檢測和鑒定。
思考·討論：目的基因的檢測與鑒定（P82）
1.檢測目的
檢測目的基因進入受體細胞后，是否穩定維持和表達其遺傳特性。
2.檢測內容及方法
四、第四步：目的基因的檢測與鑒定（P82）
類型 檢測內容 方法
分子水平的檢測 受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否轉錄出了mRNA 目的基因是否翻譯成蛋白質
個體生物學水平的鑒定 個體是否具有相應性狀
PCR等技術、
DNA分子雜交技術
抗原-抗體雜交技術
抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等
2.檢測內容及方法——分子水平
⑴檢測目的基因是否導入（穩定遺傳的關鍵）
檢測方法：
①PCR擴增
四、第四步：目的基因的檢測與鑒定（P82）
轉基因生物
提取DNA
根據目的基因的序列設計PCR引物
PCR操作
是否擴增出目的基因
電泳
能否擴增出不含目的基因的DNA？為什么？什么是電泳？
電泳：
在電場的作用下，DNA、RNA、蛋白質等這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
正極
負極
電場力
正極
負極
電場力
正極
負極
瓊脂糖凝膠：
是以瓊脂糖為支持介質制備的凝膠。瓊脂糖的熔點在62 65℃之間，融化后在37℃下可維持液態數小時，30℃時凝固成膠。
DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。
電泳常用緩沖液pH8.0～8.3，
DNA分子在此pH條件下帶負電荷！
正極
負極
電場力
若此時電場里沒有任何障礙物，所有DNA片段會以同樣的速度向正極移動，怎么讓它們移動速度不相同呢？
電泳：
正極
負極
電場力
瓊脂糖凝膠
瓊脂糖凝膠是以瓊脂糖為支持介質制備的凝膠。瓊脂糖的熔點在62 65°C之間，融化后在37°C下可維持液態數小時，30°C時凝固成膠。
加樣孔
（加入待測DNA樣本）
電泳：
正極
負極
電場力
瓊脂糖凝膠
瓊脂糖凝膠是以瓊脂糖為支持介質制備的凝膠。瓊脂糖的熔點在62 65°C之間，融化后在37°C下可維持液態數小時，30°C時凝固成膠。
片段短，遷移速率快
片段長，遷移速率慢
在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關
凝膠的濃度越大，遷移速率越慢
DNA分子越大，遷移速率越慢
DNA分子構像有環狀、鏈狀等
怎么知道這些DNA片段的大小呢？
2.檢測內容及方法——分子水平
⑴檢測目的基因是否導入（穩定遺傳的關鍵）
檢測方法：
②DNA分子雜交技術
Ⅰ.檢測工具：基因探針是指帶有標記（放射性同位素標記、熒光標記等）的目的基因片段——單鏈。
Ⅱ.檢測原理：將轉基因生物的基因組DNA提取出來，用標記了的目的基因作為基因探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示出雜交帶，就表明目的基因已插入染色體DNA中。
四、第四步：目的基因的檢測與鑒定（P82）
2.檢測內容及方法——分子水平
⑴檢測目的基因是否導入（穩定遺傳的關鍵）
檢測方法：
②DNA分子雜交技術
四、第四步：目的基因的檢測與鑒定（P82）
硝酸纖維素膜
含目的基因的DNA片段
基因探針
硝酸纖維素膜
含目的基因的DNA片段
洗去未結合的探針
顯影裝置
出現雜交帶
2.檢測內容及方法——分子水平
⑵檢測目的基因是否轉錄出了mRNA
檢測方法：
①PCR擴增
②分子雜交技術
四、第四步：目的基因的檢測與鑒定（P82）
轉基因生物
PCR操作
是否擴增出目的基因
逆轉錄
cDNA
（互補DNA）
提取RNA
mRNA作為模板
轉基因生物
2.檢測內容及方法——分子水平
⑶檢測目的基因是否翻譯出相應蛋白質
檢測方法：抗原— 抗體雜交
檢測原理：抗原與抗體的特異性結合
四、第四步：目的基因的檢測與鑒定（P82）
蘇云金芽孢桿菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠體內
抗體
標記抗體
提取蛋白
電泳分離
抗原
抗體
雜交
2.檢測內容及方法——個體水平
抗性鑒定、活性鑒定等
四、第四步：目的基因的檢測與鑒定（P82）
轉基因生物 鑒定方法 成功標志
抗蟲植物
抗病毒（菌）植物
抗鹽植物
抗除草劑植物
獲取目的基因產物的轉基因生物
飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）
害蟲死亡
病毒（菌）接種實驗
未染病
鹽水澆灌
正常生長
噴灑除草劑
正常生長
提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較
功能、活性正常
總結
用限制酶切割載體和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA連接酶連接，構建基因表達載體
將含有目的基因的表達載體導入受體細胞
檢測和鑒定目的基因是否穩定維持和表達其遺傳特性
獲取質粒、噬菌體等載體
篩選和獲取目的基因
基因工程的基本操作程序
課堂小結
練習與應用
一、概念檢測
1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因afp整合到土壤農桿菌的Ti質粒上，然后用它侵染番茄細胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關表述是否正確。
（1）afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。（ ）
（2）構建含有afp基因的Ti質粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶。 （ ）
（3）只要檢測出番茄細胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功。 （ ）



練習與應用
一、概念檢測
2.利用PCR既可以快速擴增特定基因，也可以檢測基因的表達。下列有關PCR的敘述錯誤的是（ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶
B. 變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶
C. 復性過程中引物與模板鏈的結合遵循堿基
互補配對原則
D. 延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和 4種
核糖核苷酸
D
（一）實驗原理
1.利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理：
①PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器。
②PCR擴增DNA片段還利用了DNA半保留復制的原理。一次PCR一般要經歷30次循環。
探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（P84）
變性
90℃以上
延伸
72℃左右
復性
50℃左右
基本過程
（一）實驗原理
2.DNA片段電泳鑒定的原理：
①DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
②PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來
鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠
的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。
③凝膠中的DNA分子通過染色，可以在
波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。
探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（P84）
100bp
200bp
300bp
400bp
500bp
600bp
700bp
800bp
1,200bp
1,000bp
900bp
標準
樣品1
樣品2
樣品3
（二）目的要求
1.了解PCR和電泳鑒定的基本原理。
2.嘗試進行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產物。
（三）材料用具
探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（P84）
PCR儀（自動控溫，實現DNA的擴增）
微量離心管（進行PCR反應的場所）
微量移液器（用于向微量離心管轉移PCR配方中的液體）
離心機（使反應液集中在管的底部）
電泳儀
電泳槽
梳子
（四）方法步驟
1.PCR步驟
①移液：用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。
探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（P84）
（四）方法步驟
1.PCR步驟
②離心：待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）。
探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（P84）
（四）方法步驟
1.PCR步驟
③反應：參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。
探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（P84）
預變性：
使DNA充分變性，利于引物更好地和模板結合。
（四）方法步驟
2.電泳步驟
①配制瓊脂糖溶液：
根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料（溴化乙錠：EB）混勻。
探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（P84）
（四）方法步驟
2.電泳步驟
②制備凝膠：
Ⅰ.將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。（梳子孔為加樣孔，加樣孔側連電極負極）
Ⅱ.待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。
Ⅲ.將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。（電泳緩沖液：維持PH值，使DNA帶負電荷）
探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（P84）
（四）方法步驟
2.電泳步驟
③加樣：
將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。
④電泳：
接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。
⑤觀察記錄：
取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（P84）
（五）注意
1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
5.PCR擴增不能隨意加大試劑用量。
探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（P84）
（六）結果分析與評價
1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？
可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。
探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（P84）
①條帶的有無：
（無：無DNA模板或引物設計不合適）
②條帶的位置：常代表DNA的大小
③條帶的亮度：代表DNA擴增的數量
（六）結果分析與評價
2.你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因。
①擴增不成功，原因：
漏加了PCR的反應成分；各
反應成分的用量不當；PCR程序
設置不當等。
②擴增結果不止一條條帶：
引物設計不合理；退火溫度
過低；DNA聚合酶的質量不好。
探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（P84）

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