資源簡(jiǎn)介

(共45張PPT)
3.1
重組DNA技術(shù)的基本工具
一、基因工程（P70）
1.概念
是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫重組DNA技術(shù)。
2原理：基因重組
①減Ⅰ前期：同源染色體的非姐妹染
色單體發(fā)生交叉互換
②減Ⅰ后期：非同源染色體自由組合
一、基因工程（P70）
3.發(fā)展過程
1944年，艾弗里等人通過肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，不僅證明了遺傳物質(zhì)是DNA，還證明了DNA可以在同種生物個(gè)體間轉(zhuǎn)移。
1961年，尼倫伯格和馬太破譯了第一個(gè)編碼氨基酸的密碼子。截至19666年，64個(gè)密碼子均被破譯成功。
1970年，科學(xué)家在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶（簡(jiǎn)稱限制酶）
1972年，伯格首先在體外進(jìn)行了DNA的改造，成功構(gòu)建了第一個(gè)體外重組DNA分子。
1982年，第一個(gè)基因工程藥物-重組人胰島素被批準(zhǔn)上市。基因工程藥物成為世界各國(guó)研究和投資開發(fā)的熱點(diǎn)。
1953年，沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型并提出了遺傳物質(zhì)自我復(fù)制的假說。
1967年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌擬核DNA之外的質(zhì)粒有自我復(fù)制能力，并可以在細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。
20世紀(jì)70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶被相繼發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。
1973年，科學(xué)家證明了質(zhì)粒可以作為基因工程的載體，構(gòu)建重組DNA，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使外源基因在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)了物種間的基因交流。至此，基因工程正式問世。
1985年，穆里斯等人發(fā)明PCR,為獲取目的基因提供了有效手段。
1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)
思考·討論：基因工程（P70）
理論基礎(chǔ)
1.DNA的基本組成單位相同（都是四種脫氧核苷酸）
2.都遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則
3.DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)
理論基礎(chǔ)
1.基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)與功能單位
2.遺傳信息傳遞都遵循中心法則
3.生物界幾乎共用一套遺傳密碼
重組DNA技術(shù)所需的三種工具
“分子手術(shù)刀”
準(zhǔn)確切割DNA分子
“分子縫合針”
“分子運(yùn)輸車”
將DNA片段連接起來
將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞
限制性內(nèi)切核酸酶
DNA連接酶
基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體
二、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”（P71）
1.概念
切割DNA分子的工具是限制性內(nèi)切核酸酶，簡(jiǎn)稱限制酶。
2.來源
主要從原核生物中分離純化出來。
3.種類
迄今分離的限制酶有數(shù)千種。（ps：是一類酶而不是一種酶）
二、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”（P71）
4.命名
EcoRⅠ
Escherichia coli
屬名(大寫)
種名 (小寫)
屬名的頭一個(gè)字母
種加詞的頭兩個(gè)字母
大腸桿菌的R型菌株分離來的
R型菌株中分離出來的第一種限制酶
二、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”（P71）
5.作用
⑴識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，
⑵并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。
還記得磷酸二酯鍵在哪嗎？
磷酸二酯鍵
磷酸二酯鍵
簡(jiǎn)化
簡(jiǎn)化
—AGTC—
—TCAG—
5’
3’
3’
5’
識(shí)別序列：
⑴概念：限制酶所識(shí)別的序列，呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱。 大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成。少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。
⑵特點(diǎn)：
①都可以找到一條中（心）軸線
②中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。
正向讀與另一條鏈反向讀的堿基順序完全一致
EcoRⅠ限制酶
5'
5'
3'
3'
SmaⅠ限制酶
5'
5'
3'
3'
5’
3’
5’
3’
中軸線
eg：EcoRⅠ限制酶的識(shí)別序列為
從5’→3’方向的識(shí)別序列均為GAATTC，并切斷G和A之間的磷酸二酯鍵。
eg：EcoRⅠ限制酶的識(shí)別序列為
從5’→3’方向的識(shí)別序列均為GAATTC，并切斷G和A之間的磷酸二酯鍵。
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
黏性末端
黏性末端
當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端。
ps：限制酶切割磷酸二酯鍵后氫鍵會(huì)自動(dòng)斷裂！
（從5’→3’讀）為________
AATT
Q1.推斷限制酶切一次可斷開 個(gè)磷酸二酯鍵，產(chǎn)生 個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，產(chǎn)生 個(gè)黏性末端，消耗 分子水。
Q2.限制酶能否切開RNA分子的磷酸二酯鍵嗎？
兩
2
2
兩
否，限制酶只能識(shí)別并切開雙鏈DNA分子（酶的專一性）
5’
3’
5’
3’
中軸線
eg：SmaⅠ限制酶的識(shí)別序列為
從5’→3’方向的識(shí)別序列均為CCCGGG，并切斷C和G之間的磷酸二酯鍵。
5’
3’
5’
3’
平末端
當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，產(chǎn)生的是平末端。
3’
5’
5’
3’
eg：SmaⅠ限制酶的識(shí)別序列為
從5’→3’方向的識(shí)別序列均為CCCGGG，并切斷C和G之間的磷酸二酯鍵。
二、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”（P71）
6.結(jié)果
產(chǎn)生黏性末端或平末端
Q1.推測(cè)限制酶存在于原核生物中的主要作用是？（P71）
限制酶是原核生物的一種防御工具，用來切割侵入細(xì)胞的外源DNA，以保證自身安全。
Q2.為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子？（P74）
原核細(xì)胞DNA中不存在限制酶的識(shí)別序列或能被識(shí)別的序列被修飾（甲基化）了。
1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)
思考·討論：分析限制酶和DNA連接酶（P71）
細(xì)菌
細(xì)菌
限制酶
Q3.有2個(gè)不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ進(jìn)行切割。各限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如下。
⑴請(qǐng)寫出限制酶SpeⅠ、HindⅢ、XbaⅠ和XhoⅠ切割形成的黏性末端。
1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)
思考·討論：分析限制酶和DNA連接酶（P71）
SpeⅠ： HindⅢ： XbaⅠ： XhoⅠ:
CTAG AGCT CTAG TCGA
Q3.有2個(gè)不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ進(jìn)行切割。各限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如下。
⑵哪種限制酶切割B片段產(chǎn)生的DNA片段能與限制酶SpeⅠ切割A(yù)片段產(chǎn)生的DNA片段相連接？為什么？（P75）
XbaⅠ。因?yàn)閄baⅠ與SpeⅠ切割產(chǎn)生了相同的黏性末端。
1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)
思考·討論：分析限制酶和DNA連接酶（P71）
Q3.有2個(gè)不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ進(jìn)行切割。各限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如下。
⑶同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同？
同種限制酶產(chǎn)生的黏性末端相同。
不同的限制酶可能會(huì)形成相同的黏性末端。
1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)
思考·討論：分析限制酶和DNA連接酶（P71）
Q3.有2個(gè)不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ進(jìn)行切割。各限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如下。
⑷不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端，這在基因工程操作中有什么意義？（P75）
識(shí)別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶。用同尾酶構(gòu)建載體時(shí)，切割位點(diǎn)的選擇范圍更大。例如，我們選擇了用某種限制酶切割載體，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有該限制酶的識(shí)別序列，那么用該限制酶切割含有目的基因的DNA片段時(shí)，目的基因就很可能被切斷，這時(shí)可以考慮用合適的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的識(shí)別序列）來獲取目的基因。
1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)
思考·討論：分析限制酶和DNA連接酶（P71）
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同種限制酶切割
（EcoRⅠ）
Q：把兩種來源不同的DNA進(jìn)行重組，應(yīng)該怎樣處理？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
Q：把兩種來源不同的DNA進(jìn)行重組，應(yīng)該怎樣處理？
完全互補(bǔ)的黏性末端能通過氫鍵暫時(shí)連接在一起，但并不穩(wěn)定。
而要形成重組DNA分子，還必須使基本骨架之間通過磷酸二酯鍵 “ 縫 ” 上，就像斷成兩截的梯子，不僅要把中間的踏板連接起來，還要把兩邊的扶手連接在一起。
2.DNA連接酶——“分子縫合針”
對(duì)所連接的DNA片段兩端的堿基序列沒有專一性要求
(1)作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的____________。
(2)種類
磷酸二酯鍵
T4噬菌體
黏性末端
P52
三、DNA連接酶——“分子縫合針”（P71）
1.概念
一種能夠?qū)蓚€(gè)DNA片段連接起來的酶。
（①作用位點(diǎn)：磷酸二酯鍵 ②作用底物：DNA片段）
2.種類
種類
來源 大腸桿菌 T4噬菌體
作用 差別 只連接____________ 縫合_________和____________________
E.coli DNA連接酶
T4 DNA連接酶
黏性末端
黏性末端
平末端（效率較低）
恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵
技巧：E諧音1；T為英文2的首字母
1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)
思考·討論：比較與DNA相關(guān)的幾種酶（P72）
DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？
DNA連接酶的作用示意圖
DNA聚合酶的作用示意圖
1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)
拓展：DNA連接酶和DNA聚合酶的比較（P72）
DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？
A A T T G
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
C
①作用位點(diǎn)：
磷酸二酯鍵
②作用底物：
脫氧核苷酸
1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)
拓展：DNA連接酶和DNA聚合酶的比較（P72）
DNA連接酶 DNA聚合酶
相同 作用實(shí)質(zhì) 化學(xué)本質(zhì) 不 同 點(diǎn) 模板
作用對(duì)象
作用結(jié)果
用途
都能催化形成磷酸二酯鍵
都是蛋白質(zhì)
不需要
需要DNA的一條鏈作模板
形成重組DNA分子
形成DNA的一條鏈
基因工程
DNA復(fù)制
在兩個(gè)DNA片段間形成磷酸二酯鍵
將單個(gè)核苷酸連接到已有DNA片段，形成磷酸二酯鍵
1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)
拓展：與DNA相關(guān)的幾種酶的比較
名稱 作用部位 作用結(jié)果
限制酶
DNA 連接酶
DNA 聚合酶
DNA （水解）酶
DNA 解旋酶
磷酸二酯鍵
堿基對(duì)之間
的氫鍵
將DNA切成兩個(gè)片段
磷酸二酯鍵
將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子
磷酸二酯鍵
將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端
磷酸二酯鍵
將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸
將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈
Q1.怎樣才能將外源基因送入細(xì)胞呢？
通常是利用質(zhì)粒作為載體，將基因送入細(xì)胞。
Q2.為什么不能直接將外源基因送入細(xì)胞呢？
游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會(huì)直接被分解，就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)、游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂而進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因。若將目的基因插入載體，由于載體可以在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，隨著細(xì)胞分裂，載體會(huì)帶著目的基因存在于每個(gè)子代細(xì)胞中。這樣，基因工程才有意義。
Q3.什么是質(zhì)粒？
四、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”
1.作用
作為運(yùn)輸工具，與外源/目的基因的DNA片段結(jié)合，將外源基因送入受體細(xì)胞中。
2.種類
質(zhì)粒（最常用的載體）、動(dòng)植物病毒、噬菌體
是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA。
真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。
擬核DNA
質(zhì)粒
大腸桿菌細(xì)胞
目的基因插入位點(diǎn)
復(fù)制原點(diǎn)
氨芐青霉素抗性基因
大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖
思考：分析歸納載體需要具備的條件：
Q1：載體要與外源基因連接，需要具備什么條件？
條件①：具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)
Q2：要使攜帶的外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，載體需要具備什么條件？
條件②：能在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制
Q3：我們用肉眼看不到載體是否進(jìn)入受體細(xì)胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件？
條件③：具有標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選
條件④：載體DNA必須是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害
三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”
3.載體需具備的條件
①穩(wěn)定存在并能自我復(fù)制或整合到受體DNA上
能使目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)增
②有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)
供外源DNA片段（基因）插入其中
③具有特殊的標(biāo)記基因
便于重組DNA分子的篩選
標(biāo)記基因通常有：
抗生素的抗性基因，如： 抗氨芐青霉素基因、抗四環(huán)素基因
熒光蛋白基因，如：綠色熒光蛋白基因、紅色熒光蛋白基因
④對(duì)受體細(xì)胞無害、易分離
對(duì)受體細(xì)胞無毒害作用，避免受體細(xì)胞受到損傷
1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)
拓展：標(biāo)記基因的篩選原理
載體上的標(biāo)記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細(xì)胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，受體細(xì)胞對(duì)該抗生素產(chǎn)生抗性。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導(dǎo)入了載體的受體細(xì)胞。
導(dǎo)入
受體細(xì)胞
培養(yǎng)
只有含有載體，并且載體上的抗性基因表達(dá)的大腸桿菌才能存活并增殖
含有氨芐青霉素抗性基因載體（如質(zhì)粒）
加入氨芐青霉素
1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)
拓展：關(guān)于限制酶的選擇
活動(dòng)：體驗(yàn)用限制酶切割和DNA連接酶連接及可能出現(xiàn)的結(jié)果
（ps：DNA連接酶無特異性，符合要求的DNA片段都能連接！）
第一步：如圖所示剪好兩個(gè)大小相同的紙條并寫上堿基序列
1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)
拓展：關(guān)于限制酶的選擇
活動(dòng)：體驗(yàn)用限制酶切割和DNA連接酶連接及可能出現(xiàn)的結(jié)果
（ps：DNA連接酶無特異性，符合要求的DNA片段都能連接！）
第二步：用EcoRⅠ酶切割這個(gè)DNA片段，展示結(jié)果
BamH Ⅰ
GGATCCAAGCTTGGG
CCTAGGTTCGAACCC
CCCAAGCTT
GGGTTCGAA
Hind Ⅲ
Hind Ⅲ
BamH Ⅰ
Bt基因
Hind Ⅲ
Xba Ⅰ
Sma Ⅰ
多
克
隆
位
點(diǎn)
動(dòng)
子
啟
終
子
止
標(biāo)
R
記
基
因
Kan
復(fù)制
原點(diǎn)
AGCTT
A
GGATCCA
CCTAGGTTCGA
Bt基因
A
T
G
C
A
A
C
G
T
T
A
T
DNA連接酶
同一種限制酶切（單酶切）
Bt基因
Bt基因
Bt基因
A
A
C
G
T
T
T
G
C
A
A
T
T
A
C
G
T
A
T
A
T
A
C
G
Bt基因
A
A
C
G
T
T
T
G
C
A
A
T
T
A
C
G
T
A
T
A
T
A
C
G
Bt基因
Bt基因
單酶切的問題：
目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化、
目的基因與質(zhì)粒反向連接
1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)
拓展：關(guān)于限制酶的選擇
活動(dòng)：體驗(yàn)用限制酶切割和DNA連接酶連接及可能出現(xiàn)的結(jié)果
（ps：DNA連接酶無特異性，符合要求的DNA片段都能連接！）
Q：哪些片段可以被DNA連接酶連接？環(huán)化DNA片段是怎樣的？
怎么避免該問題？
展示再用SpeⅠ限制酶切割后的片段←
Bt基因
A
A
C
G
T
T
C
T
A
G
G
C
C
A
C
G
T
A
T
G
C
G
A
T
A
C
T
A
G
A
C
G
T
T
G
C
AGCTT
A
G
CCTAG
Bt基因
同兩種限制酶切（雙酶切）
雙酶切：
①能避免反向連接
②避免自身環(huán)化，增大目的基因和運(yùn)載體連接的概率
DNA連接酶
練習(xí)與應(yīng)用
圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。
（1）在基因工程的操作中，不宜選用SmaI，原因是SmaI會(huì)破壞__________和_________________________。
（2）在基因工程的操作中，不宜選用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，__________________________________________________。
目的基因
質(zhì)粒上的抗生素抗性基因
目的基因只有一側(cè)含有黏性末端，不能插入到質(zhì)粒中
練習(xí)與應(yīng)用
（3）由于反應(yīng)體系中含有大量的外源DNA片段和質(zhì)粒，加入PstI一種限制酶后，會(huì)得到大量的目的基因片段和質(zhì)粒片段，再加入DNA連接酶后，除了會(huì)形成目的基因與質(zhì)粒連接的環(huán)狀產(chǎn)物外，還會(huì)形成_____________________連接的環(huán)狀產(chǎn)物以及_____________________連接的環(huán)狀產(chǎn)物。此外，目的基因與質(zhì)粒的連接既可以是正向連接，也可以是__________，后者可能會(huì)導(dǎo)致目的基因無法正常表達(dá)。
目的基因與目的基因
質(zhì)粒片段與質(zhì)粒片段
反向連接
練習(xí)與應(yīng)用
圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。
（4）為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接，可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，例如可選擇用_______和________這兩種限制酶。
PstⅠ
EcoRⅠ
課堂小結(jié)(共18張PPT)
3.1
重組DNA技術(shù)的基本工具
DNA 的粗提取與鑒定
五、DNA的粗提取與鑒定（P74）
1.基本思路
DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法去除其他成分，對(duì)DNA進(jìn)行提取。
2.提取生物大分子的提取原理與鑒定原理
⑴提取原理：
①DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。
②DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，
能溶于2mol/L NaCl溶液。
⑵鑒定原理：
在一定溫度下（沸水浴），DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色，因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑。
0
0.14
NaCI濃度（mol/L）
DNA溶解度
五、DNA的粗提取與鑒定（P74）
3.材料用具
⑴選材：
DNA含量相對(duì)較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。
Q：豬血和雞血，哪個(gè)適合用作提取DNA的材料？操作時(shí)如何防止血液凝固？
豬血（哺乳動(dòng)物的成熟紅細(xì)胞）無細(xì)胞核，不適合。
雞血中紅細(xì)胞有核DNA，且核DNA的量較多，適合。
雞血中加入檸檬酸鈉，可防止血液凝固。
五、DNA的粗提取與鑒定（P74）
3.材料用具
⑵試劑：
①研磨液
②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精→析出DNA
③2mol/L 的NaCl溶液→溶解DNA
④二苯胺試劑（現(xiàn)配現(xiàn)用，水浴加熱）→鑒定DNA
⑤蒸餾水
4.方法步驟
取上
清液
充分
研磨
紗布過濾
95%冷酒精
離心
離心
絲狀物
沉淀物
五、DNA的粗提取與鑒定（P74）
4.方法步驟
取材、研磨
過濾或離心
酒精析出或離心
溶解并鑒定
⑴取材、研磨：
稱取30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL 研磨液，充分研磨。
Q1.研磨的目的？
破壞細(xì)胞壁，裂解細(xì)胞，使核物質(zhì)易溶解在研磨液中。
Q2.充分研磨？
研磨不充分，會(huì)使DNA分子不能從細(xì)胞核中釋放出來，從而影響提取的DNA含量。
Q3.研磨時(shí)間不宜太長(zhǎng)？
防止研磨時(shí)產(chǎn)生的熱量影響DNA的提取量。
有條件的可在材料處理過程中加入纖維素酶、果膠酶。
若用雞血?jiǎng)游锛?xì)胞：加入清水，讓細(xì)胞吸水脹破，釋放DNA。
五、DNA的粗提取與鑒定（P74）
4.方法步驟
取材、研磨
過濾或離心
酒精析出或離心
溶解并鑒定
⑵過濾或離心取上清液：
在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。
Q1.過濾能用濾紙代替嗎？
不可以，因?yàn)镈NA會(huì)被吸附到濾紙上而大量損失。
Q2.上清液中除DNA之外，可能含有哪些雜質(zhì)？
可能含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。
Q3.低溫放置幾分鐘的作用：
①可抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解。
②抑制DNA分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成沉淀析出。
③低溫有利于增加DNA的柔韌性，減少其斷裂。
五、DNA的粗提取與鑒定（P74）
4.方法步驟
取材、研磨
過濾或離心
酒精析出或離心
溶解并鑒定
⑶預(yù)冷酒精析出DNA或離心收集沉淀中的DNA：
在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分。或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
Q1.攪拌時(shí)應(yīng)輕緩、并沿一個(gè)方向？
減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子
Q2.酒精預(yù)冷的作用？
同“低溫放置的作用”
五、DNA的粗提取與鑒定（P74）
4.方法步驟
取材、研磨
過濾或離心
酒精析出或離心
溶解并鑒定
⑷NaCl溶液溶解DNA并鑒定：
取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCI溶液中。向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。
加入2mol/L氯化鈉溶液
不加入絲狀物
加入4ml二苯胺試劑
加入2mol/L氯化鈉溶液
加入絲狀物
加入4ml二苯胺試劑
實(shí)驗(yàn)組
對(duì)照組
水浴加熱
五、DNA的粗提取與鑒定（P74）
5.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)
⑴你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結(jié)果如何？
觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)基本成功。如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實(shí)驗(yàn)操作過程中出現(xiàn)了失誤等。
⑵你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質(zhì)嗎？
可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。
⑶與其他同學(xué)提取的DNA進(jìn)行比較，看看實(shí)驗(yàn)結(jié)果有何不同，分析產(chǎn)生差異的原因。
對(duì)同種材料采用不同的方法，不同的材料等。
現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用
(1)充分研磨的目的是______________________。
(2)在研磨液過濾獲得的上清液中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液的目的是使DNA______ (填“溶解”或“析出”)，依據(jù)的原理是______________________________________________________。
(3)用玻璃棒攪拌時(shí)沿一個(gè)方向攪拌的目的是________________。
裂解細(xì)胞，釋放DNA
析出
DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精
防止DNA斷裂
P58
例1 下表關(guān)于“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的表述，錯(cuò)誤的是(　　)
選項(xiàng) 試劑 操作 作用
A 研磨液 與生物材料混合 提取溶解DNA
B 2(mol·L－1) NaCl溶液 與提取出的DNA混合 溶解DNA
C 預(yù)冷的酒精 加入離心后的上清液中 溶解DNA
D 二苯胺試劑 加入溶解有DNA的NaCl溶液中 鑒定DNA
例2 下列有關(guān)“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，正確的是(　　)
A.新鮮豬血、菜花等動(dòng)植物材料均可用于DNA的粗提取
C.DNA只能溶于2 mol/L的NaCl溶液
D.溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑后顏色呈紫色
B.植物材料需先研磨破碎細(xì)胞
練習(xí)與應(yīng)用
一、概念檢測(cè)
1. DNA連接酶是重組DNA技術(shù)常用的一種工具酶。下列相關(guān)敘述正確的是（ ）
A.能連接DNA分子雙鏈堿基對(duì)之間的氫鍵
B.能將單個(gè)脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵
C.能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段，重形成磷酸二酯鍵
D.只能連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，不能連接雙鏈DNA片段的平末端
2.在重組DNA技術(shù)中，將外源基因送入受體細(xì)胞的載體可以是
（ ）
A.大腸桿菌的質(zhì)粒 B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端 D.用來識(shí)別特定基因的DNA探針
C
A

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