資源簡介

(共42張PPT)
自然界中微生物數量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當要分離的微生物在混合的菌群中不是優勢種群時，僅通過一般的平板劃線法或稀釋涂布平板法很難實現。該怎么辦呢？
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1.2
微生物的培養技術及應用
（二）微生物的選擇培養和計數
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1973年，科學家從美國黃石國家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌
水生棲熱菌
耐高溫的DNA聚合酶
耐高溫的DNA聚合酶
耐高溫的DNA聚合酶
這種酶目前已被廣泛用于體外擴增DNA片段的聚合酶鏈式反應（PCR）
水生棲熱菌
根據這個原理，我們能不能從許多微生物中篩選出我們需要的一種呢？
實驗室中微生物的篩選，也可以應用同樣的原理，即人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養、溫度和pH等），同時抑制或阻止其他微生物的生長。
一、選擇培養基（P16）
1.概念
在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基，稱為選擇培養基。
2.原理
人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養、溫度和PH等），同時抑制或阻止其他微生物的生長。
一、選擇培養基（P16）
3.類型
類型 條件 分離得到的菌種
改變培養條件 70～80℃的高溫 水生棲熱菌
添加某種化學物質 加入青霉素 酵母菌、霉菌等真菌
高濃度食鹽 金黃色葡萄球菌
特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物
尿素是唯一氮源 能夠分解尿素的微生物
改變培養基的營養成分 不加碳源 自養型微生物
不加氮源 固氮菌
選擇培養基 vs 鑒別培養基
項目 選擇培養基 鑒別培養基
特殊成分 加入某種化學物質 加入某種指示劑或化學藥品
目的 抑制或阻止其他微生物生長，促進目的微生物生長 與微生物的代謝物或培養基中的成分發生特定反應
用途 培養、分離出特定微生物 鑒別不同的微生物
舉例 培養酵母菌和霉菌，可在培養基中加入青霉素，抑制細菌生長；用以尿素作為唯一氮源的培養基來培養尿素分解菌 可用伊紅美藍培養基鑒定飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌（若有，菌落呈黑色）
CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3
脲酶
NO3-、NH4＋
被植物吸收
1. 如果讓你配制一種培養基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養基的配方該如何設計？
用尿素作為唯一氮源,可以將分解尿素的細菌分離出來。
2. 該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點？
只是用尿素作為唯一氮源，培養基的其他營養成分基本相同。
二、微生物的選擇培養（P17）
1.稀釋涂布平板法
（1）概念：
將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到固體培養基表面，進行培養。
在稀釋度足夠高的菌液里，
聚集在一起的微生物將被分散
成單個細胞，從而能在培養基
表面形成單個菌落。
二、微生物的選擇培養（P17）
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 無菌水
90mL無菌水
10g
②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。
①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中。
1.稀釋涂布平板法
（2）操作過程：
二、微生物的選擇培養（P17）
1.稀釋涂布平板法
（2）操作過程：
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
微量移液槍
③取0.1mL菌液，滴加到培養基表面。
二、微生物的選擇培養（P17）
1.稀釋涂布平板法
（2）操作過程：
④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。
⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。
⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。
二、微生物的選擇培養（P17）
1.稀釋涂布平板法
（2）操作過程：
恒溫培養箱
待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入30 37 ℃的恒溫培養箱中培養1 2 d。
①等比稀釋操作→②涂布平板操作→③培養
聯系
【注意事項】
①各操作細節要保證“無菌”。如移液管要經過滅菌，梯度稀釋時，試管口和移液管在離火焰1~2cm處，涂布器要經過灼燒滅菌等。
②將涂布器浸在盛有質量分數為70%的酒精的燒杯中。取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼燒。
③操作中要注意防火。不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。
④涂布結束后，應將一個未接種的培養基和已接種的培養基放在一起培養，以檢測培養基是否滅菌徹底。
聯系
平板劃線法（分區）
稀釋涂布平板法
平板劃線法 稀釋涂布平板法
主要步驟
接種工具
單菌落的獲得
用途
培養結果
相同點 接種環在固體培養基表面連續劃線
系列梯度稀釋操作
和涂布平板操作
接種環
涂布器
從最后劃線的區域挑取
稀釋度合適
整個平板上都可找到單菌落
分離純化菌種，獲得單菌落
①分離純化菌種，獲單菌落
②用于計數
都能分離菌種；都在固體培養基上進行；都能觀察菌落
兩種純培養方法的比較
兩種純培養方法的比較
平板劃線法
不能達到對細菌進行計數的目的，因為平板劃線法最開始的劃線很可能菌類會長成一片，導致無法計數，此外灼燒接種環的時候也會殺死一部分菌類。
稀釋涂布平板法
進行等比稀釋，在合適的稀釋倍數下，均勻涂布得到的菌落互不接觸，可以確定菌類的密度，再通過計算可以得知原液的菌落數。
三、微生物的數量測定（P18）
1.稀釋涂布平板法（間接計數法）
除可以用于分離微生物外，也常用來統計樣品中活菌的數目。
102
103
104
105
106
已接種的稀釋不同倍數的的選擇培養基
三、微生物的數量測定（P18）
1.稀釋涂布平板法（間接計數法）
（1）計數原則：
選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養，以保證獲得菌落數為30 300、適于計數的平板。
在同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數，然后求出平均值。（減少實驗誤差,保證實驗結果更準確）
未接種的牛肉膏蛋白胨培養基平板一個
未接種的選擇培養基平板一個
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不同稀釋倍數的已接種的牛肉膏蛋白胨培養基各一個
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不同稀釋倍數的已接種的選擇培養基每種稀釋倍數至少3個
一組對照
一組對照
三、微生物的數量測定（P18）
1.稀釋涂布平板法（間接計數法）
（2）計算公式：
每g樣品中的菌落數＝（C÷V）×M
C：代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數
V：代表涂布平板時所用的稀釋液的體積（mL）
M：代表稀釋倍數
4號試管的結果表明每g土壤中的活菌數約為__________個
1.1×108
三、微生物的數量測定（P18）
1.稀釋涂布平板法（間接計數法）
（3）缺點：
統計的菌落數往往比活菌的實際數目少。
原因：當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，因此，統計結果一般用菌落數而不是用活菌數表示。
102
103
104
105
106
當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。
三、微生物的數量測定（P18）
2.顯微鏡直接計數法（直接計數法）
（1）原理：
利用細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數量。
（2）優點：
快速、直觀
（3）缺點：
不能區分死菌與活菌
不適于對運動細菌的計數
個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察
→偏大
兩者計數原理相同
對細菌等較小的細胞進行觀察和計數
用于相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等的計數
計數
①計數工具：血細胞計數板
②計數步驟：
計數一個小方格分的酵母菌數量
先將蓋玻片放在血細胞計數板的計數上
01
02
用吸管吸取培養液，滴于蓋玻片邊緣，讓培養液自行滲入
03
多余的培養液用濾紙吸去，稍待片刻
04
待酵母菌全部沉降到計數室底部，將計數板放在載物臺的中央
05
兩種不同計數室的取樣方法不同
規格一（25×16）：
1 mL培養液中細胞個數＝中方格中酵母菌數量的平均值×25×104 ×稀釋倍數
規格二（16×25）：
1 mL培養液中細胞個數＝中方格中酵母菌數量的平均值×16×104 ×稀釋倍數
計數
③計算公式：
（1）提出問題：
1.3 傳統發酵技術
探究·實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數（P18）
（2）基礎知識：
1.3 傳統發酵技術
探究·實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
選擇培養基配方
組分 含量
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
瓊脂 15.0g
蒸餾水 定容到1000ml
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
瓊脂 20.0g
蒸餾水 定容到1000ml
固體、天然培養基
通用培養基
（能分解尿素的細菌可存活）
（能分解尿素的細菌+不能分解尿素的細菌都能存活）
固體、
合成培養基
Q：如何確定該選擇培養基具有選擇作用呢？
配一種起對照作用的培養基（牛肉膏蛋白胨培養基）
（2）基礎知識：
1.3 傳統發酵技術
探究·實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
通用培養基
選擇培養基
滅菌
（高壓蒸汽滅菌）
倒平板
（3）實驗設計：
1.土壤取樣
1.3 傳統發酵技術
探究·實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數（P18）
取樣地點要求：
細菌適宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長。
取樣過程：
鏟去表層土（一般3cm左右）。
細菌絕大部分分布在距地表3～8cm的土壤層。
注意事項：
取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。
操作完成后一定要洗手。
（3）實驗設計：
2.樣品的稀釋與涂布平板
1.3 傳統發酵技術
探究·實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數（P18）
測細菌時，一般選用1×104、1×105、1×106倍稀釋的稀釋液進行平板培養。
在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，應選擇一個比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養，以保證能從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數。
（3）實驗設計：
2.樣品的稀釋與涂布平板
1.3 傳統發酵技術
探究·實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數（P18）
①每個濃度至少設置4個平板，1、2、3平板是選擇培養基（實驗組，三個重復），4為牛肉膏蛋白胨培養基。
（用以判斷選擇培養基是否具有選擇作用）
②如何驗證培養基中是否含有雜菌？
設置2個平板作為對照：
不涂布稀釋液的選擇培養基和牛肉膏蛋白胨培養基。
若對照的培養基中無菌落生長，則說明未被雜菌污染。
若牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落數目大于選擇培養基上的數目，則說明選擇培養基具有篩選作用。
（3）實驗設計：
3.微生物的培養與觀察
1.3 傳統發酵技術
探究·實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數（P18）
培養條件：
不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間。
觀察：
每隔24h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作 為結果。
（一般來說，在相同的培養條件下，同種微生物表現出穩定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等）
（4）操作提示：
①無菌操作：
取土樣的用具在使用前都需要滅菌。
②做好標記：
本實驗使用的平板和試管較多，為避免混淆，最好在使用前做好標記。
③規劃時間：
對于耗時較長的生物實驗，需要事先規劃時間，以便提高實驗效率，在操作時有條不紊。
1.3 傳統發酵技術
探究·實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數（P18）
如
在標記培養皿時應該注明組別、培養日期和平板上培養樣品的稀釋度等。
案例：兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數。從對應稀釋倍數為106的培養基中，得到以下兩種統計結果。
1.甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統計的菌落數為230。
2.乙同學在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統計的菌落數分別為21、212、256，該同學以這三個平板上菌落數的平均值163作為統計結果。
你認為這兩位同學的做法正確嗎？ 如果有問題，錯在哪？ 如何改進？
練習與應用
甲：沒有重復實驗（至少涂布3個平板）。為增加實驗的說服力與準確性，應設置重復實驗，在同一稀釋度下至少涂布3個平板，統計結果后計算平均值。
乙：其中一個平板計數結果與其他兩個相差太大，操作過程可能出現了錯誤。微生物計數時，如果實驗中出現重復實驗的結果差別很大的情況，應分析實驗過程中可能的影響因素，找出差異的原因，而不能簡單地將結果舍棄后進行計數。
利用尿素作為唯一氮源的培養基分離出的微生物不一定都是能分解尿素的微生物，因為有些微生物可以利用能分解尿素的細菌的代謝物進行生長繁殖。對分離的菌種進行鑒定還需要借助生物化學的方法。你可以查閱相關資料,進一步設計實驗來鑒定自己分離的菌種。
練習與應用
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
呈堿性，遇酚紅指示劑呈 紅 色。
方法：在培養基中加入酚紅指示劑——鑒別培養基
①液體培養基可以直接看液體的變色情況；
②固體培養基上可以觀察菌落周圍是否出現紅色環帶。
課堂總結
一、概念檢測
1. 研究人員用無機鹽、瓊脂和石油配制的培養基從被石油污染的土壤中篩選出了一種石油降解菌，判斷下列相關表述是否正確。
（1）這種培養基是一種選擇培養基。 （ ）
（2）利用這種石油降解菌可以降解石油，修復土壤。
（ ）
（3）相對于未被污染的土壤，從被石油污染的土壤中更容易分離到石油降解菌。 （ ）
練習與應用



一、概念檢測
2.用稀釋涂布平板法來統計樣品中的活菌數時，通過統計平板上的菌落數就能推測出樣品中的活菌數，原因是 （ ）
A. 菌落中的細菌數目是固定的
B. 平板上的一個菌落就是一個細菌
C. 通過此方法統計的菌落數與活菌的實際數目相同
D. 平板上的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌
練習與應用
D
二、拓展應用
2. 地球上的植物每年產生的纖維素超過70 億噸，其中40%～60%能被土壤中某些微生物分解利用，這是因為它們能夠產生纖維素酶。對這些微生物的研究與應用，使人們能夠利用秸稈等生產酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。已知剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不與水解后的纖維二糖、葡萄糖等發生這種反應。當我們在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅與纖維素形成紅色復合物；而當纖維素被纖維素分解菌分解后，復合物就無法形成，培養基中會出現以這些菌為中心的透明圈（如下圖所示）。請回答下列問題。
練習與應用
二、拓展應用
（1）你打算到什么環境中去尋找纖維素分解菌？為什么？
可以選擇纖維素豐富的環境，如樹林中多年落葉形成的腐殖土等。
（2）有同學說，可以把濾紙埋在土壤中，經過一段時間后，再從已腐爛的濾紙上篩選纖維素分解菌。請你評價這一做法。
可行，這是人工設置適合纖維素分解菌生存的環境，腐爛的濾紙上很可能有纖維素分解菌。
練習與應用

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