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第2節 微生物的培養技術與應用（一)微生物的基本培養技術（2）
(1)培養物：
(3)純培養：
(2)純培養物：
在微生物學中，將接種于培養基內，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體。
由單一個體繁殖所獲得的微生物群體。
獲得純培養物的過程就是純培養。
（1）配制培養基
（2）滅菌(培養基和器具）
（3）接種
（4）分離
（5）培養(恒溫箱）
（三）微生物的純培養
1 有關概念
2純培養步驟：
【探究 實踐】酵母菌的純培養
分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體，這就是菌落。
(1)菌落：
1. 原理：
微生物群
分散或稀釋
單個細胞
單個菌落
繁殖
念珠菌顯色培養基
大腸桿菌培養基
酵母菌培養基
金黃色葡萄球菌和
枯草桿菌培養基
(2)單菌落：
一般是由單個微生物繁殖形成的純培養物。
鑒別菌種：菌落的大小、形狀、顏色、透明度、光澤度等是鑒定菌種的重要依據。
(3)獲得單菌落的方法：
平板劃線法和稀釋涂布平板法
稀釋涂布平板法
平板劃線法
2. 實驗目的
① 學會配制培養酵母菌的培養基并倒平板
② 學會進行無菌操作
③ 嘗試通過平板劃線操作來獲得純化的酵母菌菌落
3. 材料用具
①酵母菌培養液、馬鈴薯、葡萄糖(或蔗糖)、瓊脂、蒸餾水
②天平，小刀，紗布，燒杯，錐形瓶，棉塞、牛皮紙（或報紙）
③皮筋，培養皿，接種環，酒精燈，超凈工作臺
④高壓蒸汽滅菌鍋，干熱滅菌箱和恒溫培養箱等
4.方法步驟
（1）制備培養基
① 配制培養基
去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000mL，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過濾。向濾液中加入20g葡萄糖、15-20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000mL。
② 滅菌：
培養基——高壓蒸汽滅菌
高壓蒸汽滅菌鍋
轉移
滅菌15~30min
皮筋勒緊
包牛皮紙
放入高壓蒸汽滅菌鍋中（100kPa、121℃）
酵母菌培養基
錐形瓶
加棉塞
② 滅菌：
培養皿——干熱滅菌
干熱滅菌箱
將5-8套培養皿包成一包，用幾層牛皮紙包緊，放入干熱滅菌箱內，在160～170℃滅菌2h。
培養基冷卻到50℃左右，在酒精燈火焰附近倒平板。
1
拔出錐形瓶的棉塞。
3
用拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養基倒入培養皿（10～20mL），立即蓋上皿蓋。
4
等待培養基冷卻凝固后，將培養皿倒過來放置。
2
將瓶口迅速通過火焰。
通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基
不能完全打開，以免雜菌污染培養基
防止皿蓋上冷凝水落入培養基
；避免培養基的水分過快揮發。
③倒平板
配制培養基
滅菌
倒平板
（1）制備培養基
應該在定容完成后，滅菌之前進行調pH
1. 培養基pH要適宜，調pH是在滅菌前還是滅菌后？
問題思考與分析：
4. 怎樣檢測培養基滅菌是否合格(或培養基是否被雜菌污染）？
將所倒平板放入37℃的恒溫箱中培養12h～24h，觀察是否有菌落產生
3. 在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？
最好不要用。空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生
2.培養基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。用什么辦法來估計培養基的溫度？
用手觸摸錐形瓶，剛剛不燙手即可
【例】倒平板是制備牛肉膏蛋白胨固體培養基的重要環節，如圖為倒平板的操作示意圖。
（1）請用文字和箭頭寫出正確的倒平板操作流程： 。
（2）甲、乙、丙中的滅菌方法是 。
（3）丁中的操作需要等待 才能進行。
丙→乙→甲→丁
灼燒滅菌
平板冷卻凝固
（2）接種和分離酵母菌
——平板劃線法
通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。經過數次劃線后培養，可以分離得到單菌落。
連續劃線法
分區劃線法
平板劃線法
1
將接種環放在火焰上灼燒，直到接種環的金屬絲燒紅。
2
在火焰旁冷卻接種環。同時，拔出裝有酵母菌培養液的試管的棉塞。
將試管口通過火焰。
3
4
在火焰附近用接種環蘸取一環菌液。
5
將試管口通過火焰，并塞上棉塞。
在火焰附近將皿蓋打開一條縫隙，用接種環在培養基表面基表面迅速劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。
6
灼燒接種環，待其冷卻后，從第一次劃線的末端開始作第二次劃線。重復以上操作，作第三、四、五次劃線。注意不要將最后一次的劃線與第一次的劃線相連。
7
平板劃線法
第1次劃線
灼燒接種環滅菌
第2次劃線
灼燒接種環滅菌
第3次劃線
灼燒接種環滅菌
灼燒接種環滅菌
1
2
3
4
5
①接種環只蘸一次菌液，但要在培養基不同位置連續劃線多次；
②劃線首尾不能相接；
③每次劃線前灼燒接種環進行滅菌；
④劃線操作結束后，仍需灼燒接種環，培養皿倒置培養。
分區劃線法
【平板劃線法注意事項】
灼燒時期 目的
取菌種前
每次劃線前
接種結束后
【問題探究1】為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？
殺死接種環上殘留的菌種，避免污染環境和感染操作者
殺死上次劃線后接種環上殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數目逐漸減少，直至得到單個細胞
殺死接種環可能存在的微生物，避免污染培養物
接種環共需灼燒幾次？
6次
灼燒次數=劃線次數+1
【問題探究2】在第二次以及其后的劃線操作時，總是從上一次劃線的末端開始劃線的原因是？
劃線后，線條末端酵母菌的數目最少，從末端劃，能使酵母菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個酵母菌繁殖而來的菌落。
【問題探究3】為什么最后一次劃線與第一次的劃線不能相連？
最后一次劃線已經將酵母菌稀釋成單個的細胞，如果與第一次劃線相連則增加了酵母菌的數目，達不到純化的效果。
待菌液被培養基吸收，
將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，
放入28℃左右的恒溫培養箱中培養24-28h。
劃3個平板（重復實驗）1個不劃線（空白對照）
若該培養基無菌落，說明培養基沒有污染；若有菌落生長，則說明培養基被污染或者滅菌不徹底。
（3）培養酵母菌
在實驗室中，切不可吃東西、喝水，離開實驗室時一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培養基在丟棄前一定要進行滅菌處理，以免污染環境。
警示
（1）倒平板后，待平板冷凝之后需將其倒置 （　 　）
（2）倒平板時，應將打開的皿蓋放到一邊，以免培養基濺到皿蓋上 （　 　）
（3）若皿蓋和皿底之間濺上培養基，這個培養基不可再用 （ 　　）
（4）為了防止污染，接種環經火焰滅菌后應趁熱快速挑取菌落 （ 　 ）
（5）平板劃線法中每一次劃線后要將接種環灼燒 （　 　）
（6）培養微生物的溫度因菌種不同而稍有差異 （　 　）
1.易錯辨析
課堂鞏固
2.下列關于平板劃線的操作，正確的是（ ）
A. 每次劃線前都要蘸取菌液
B. 灼燒接種環后，要立即用接種環接種
C. 平板劃線操作時劃出了五個區域菌落數逐漸增多
D. 接種前，要將菌種試管口通過火焰
D
酵母菌的純培養
2.接種和分離酵母菌
1.制備培養基
3.培養酵母菌
①配制培養基（馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、水）
②滅菌
③倒平板（在酒精燈火焰附近操作）
培養基：濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌鍋）
培養皿：干熱滅菌（干熱滅菌鍋）
用接種環在固體培養基上用平板劃線法接種
平板倒置，放入28℃左右的恒溫培養箱培養
酵母菌純培養小結
有一段時間，水果“酵素”風靡各地。水果“酵素”制作的大致過程是：將洗凈、切成塊狀的水果放入潔凈的容器，再加入糖和水，密封，置于陰涼處發酵一至兩周。有人說，吃水果“酵素”可以美容、減肥、促進消化和提高免疫力。請評估這一論點是否可信。追問以下問題可以幫助你分析。
酶的另一種說法。
其制作是利用微生物進行無氧呼吸的原理，進行像制作泡菜一樣的發酵。
其中可能有糖類（包括一些簡單的糖和膳食纖維等）、蛋白質（包括多種酶）、有機酸等成分。
不存在它獨有的、特殊的營養物質。
其中甚至可能含有微生物發酵產生的有毒物質，食用后可能會危害人體健康。
評估論點的可信程度
水果“酵素”是什么？
其制作原理是什么？
其中可能含有哪些成分？
其是否含有人們無法從其他食品中獲取但又是維護健康所必需的成分？
其中的所有成分都有益于人體健康嗎？
思維訓練
練習與應用
一、概念檢測
1.判斷下列相關表述是否正確。
（1）培養基中的營養物質濃度越高，對微生物的生長越有利。（ ）
（2）消毒和滅菌的殺菌程度存在差異。 （ ）
（3）微生物的純培養物就是不含有代謝廢物的微生物培養物。（ ）
×
√
×
①干制：降低食品的含水量；
②腌制：食鹽、糖等制造高滲環境，抑制微生物的生長和繁殖；
③低溫儲存：降低微生物的代謝速率從而抑制微生物的生長和繁殖。
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？這些方法是如何阻止或抑制微生物生長的？
1.某同學將5個手指尖在貼有“洗手前”標簽的培養基上輕輕按一下。然后用肥皂將該手洗干凈，再將5個指尖在貼有“洗手后”標簽的同種培養基上輕輕按一下。將這兩個培養皿放入37℃恒溫培養箱中培養24h后，發現貼有“洗手后”標簽的培養皿中菌落較少。請回答：
（1）這個實驗中需要進行滅菌處理的材料用具有________________。
（2）“將指尖在培養基上輕輕按一下”相當于哪一步操作？
（3）洗手后我們就能進行無菌操作了嗎？
操作時，我們可以采用什么方法來避免手上微生物的污染？
培養皿和培養基
接種
洗手后手上還有一些微生物
通過用酒精棉球擦拭雙手，或戴消過毒的手套等方法來避免手上微生物的污染。
二、拓展應用
2. 將野生酵母菌分別接種于3個盛有等量同種液體培養基的錐形瓶中，并放置在搖床上培養，搖床轉速分別為 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培養時間與酵母菌種群密度的關系如圖。請分析：
（1）搖床轉速不同，意味著培養條件有什么不同？
培養液中02含量不同。
（2）從圖中數據你可以得出什么結論 其原因是什么
培養液中02含量越高，酵母菌種群密度越大。
（3）為什么培養8h后，其中2個錐形瓶中酵母菌的種群密度基本達到穩定
這時候已經達到了環境容納量。

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