資源簡介

第38講　基因工程
考情研讀·備考定位
課標要求 核心素養
闡明基因工程的原理及技術(含PCR技術)。 舉例說明基因工程在農牧、食品及醫藥等行業的應用。 概述蛋白質工程的原理及應用。 實驗：DNA的粗提取與鑒定。 生命觀念：舉例說出植物基因工程、動物基因工程成果及其給人類帶來的影響；說明基因的堿基排列順序—蛋白質的結構—蛋白質功能的關系。 科學思維：結合生產實例，舉例說出基因工程的基本操作程序。 社會責任：認同蛋白質工程的重要意義。
必備知識·夯實基礎
一、重組DNA技術的基本工具
1．基因工程的概念
操作技術： 等技術。
操作結果：賦予生物新的 ，創造出更符合人們需要的新的 和生物產品。
操作水平： 水平。
2．基因工程的誕生與發展(選擇對應的序號)
A．基礎理論 。
B．技術支持 。
①DNA是遺傳物質的證明 ②基因轉移載體的發現 ③工具酶的發現 ④DNA雙螺旋結構和中心法則的確立
⑤DNA體外重組的實現 ⑥重組 DNA表達實驗的成功 ⑦PCR技術的發明 ⑧遺傳密碼的破譯
3．限制性內切核酸酶——“分子手術刀”
來源：主要來自 。
特點：具有 ，表現在兩個方面：
識別——雙鏈DNA分子的某種特定 序列。
切割——特定核苷酸序列中的 。
作用：斷裂 的兩個核苷酸之間的 。
結果：產生 _或 。
4．DNA連接酶——“分子縫合針”
種類 E.coli DNA連接酶 T4DNA連接酶
來源 _ __ T4噬菌體
特點 縫合黏性末端 縫合黏性末端和平末端
作用 縫合雙鏈DNA片段，恢復兩個核苷酸之間的
5．基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
(1) 種類
質粒：分子質量較小的、環狀的、裸露的 ，獨立于原核細胞的擬核或真核細胞細胞核之外。
噬菌體和 等。
目的
① 將目的基因 到宿主細胞中去。
② 在受體細胞內對目的基因進行大量 。
(3) 必備條件
① 在宿主細胞中保存下來并大量 。
② 有一個至多個 。
③ 有一定的 ，便于篩選。
④ 對 無害。
6．DNA的粗提取與鑒定
提取思路：利用DNA、RNA、蛋白質和脂質等在__物理和化學性質__方面的差異，提取DNA，去除其他成分。
提取原理
① DNA的溶解性
DNA和蛋白質等其他成分在不同濃度的 中溶解度不同，利用這一特點，選擇適當的 就能使DNA充分溶解，而使雜質沉淀，或者相反，以達到分離目的；DNA不溶于 溶液，但是細胞中的某些蛋白質則可溶于其中。
② DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性
對酶的耐受性： 能水解蛋白質，但對DNA沒有影響；
對高溫的耐受性：大多數蛋白質不能忍受60～80℃的高溫，易發生變性，而DNA在 以上才會變性；
對洗滌劑的耐受性：洗滌劑能夠瓦解 ，但對DNA沒有影響。
(3) 鑒定原理：DNA＋ _藍色。
二、基因工程的基本操作程序
1．目的基因的篩選與獲取
(1) 目的基因：主要是指 的基因。
(2) 獲取方法：利用 擴增目的基因。
①含義：是一項在生物體外 的核酸合成技術。
②原理： 。
③條件： 、DNA模板、 、四種脫氧核苷酸。
④過程。
變性：目的基因DNA受熱 后解鏈為單鏈(90 ℃以上)。
↓
復性： 與單鏈相應互補序列結合(50 ℃左右)。
↓
延伸：在 作用下進行 (72 ℃左右)。
↓
重復循環多次。
⑤結果：每次循環后目的基因的量增加一倍，即成 形式擴增(約為2n)。
2．基因表達載體的構建——核心
基因表達載體的組成
基因表達載體的功能
①使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以 給下一代。
②使目的基因 和發揮作用。
3．將目的基因導入受體細胞
轉化的含義： 進入受體細胞內，并且在受體細胞內_ 和 的過程。
轉化的方法：
①導入植物細胞：花粉管通道法和 。
②導入動物細胞：
③導入微生物細胞：用 處理大腸桿菌，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態。
4．目的基因的檢測與鑒定
(1) 分子水平檢測
方法 內容
_ _技術 檢測轉基因生物 DNA上是否 或檢測目的基因是否
__ _雜交技術 檢測目的基因是否 __
個體水平鑒定
通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。
5．DNA片段的擴增及電泳鑒定
PCR的產物一般通過 來鑒定。
三、基因工程的應用
1．基因工程在農牧業方面的應用
轉基因抗蟲植物
從某些生物中分離出具有 _，將它導入作物中培育出具有抗蟲性作物。
轉基因抗病植物
科學家將來源于某些病毒、真菌等的 導入植物中，培育出 ，如轉基因抗病毒甜椒等。
轉基因抗除草劑植物
將降解或抵抗某種除草劑的基因導入作物，可以培育出 ，如抗除草劑玉米等。
改良植物的品質
我國科學家成功地將與植物 導入矮牽牛，呈現出自然界中沒有的顏色變異，大大提高了觀賞價值。
提高動物的生長速率
由于 可以使轉基因動物生長得更快，科學家將這類基因導入動物體內，以提高
改善畜產品的品質
如科學家將 基因導入奶?；蚪M，使獲得的轉基因牛分泌的乳汁中， 的含量大大降低，其他成分不受影響。
2．基因工程在醫藥衛生領域的應用
生產的 、 、促紅細胞生成素和粒細胞集落刺激因子等基因工程藥物均已投放市場。
3．基因工程在食品工業方面的應用
生產食品工業用酶、氨基酸和 等。
四、基因工程的延伸——蛋白質工程
1．原理：由預期的蛋白質找到相對應的 。
2．流程
預期_ _→設計預期的 __→推測應有的 →找到并改變相對應的 或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質。
3．蛋白質工程的應用
研發速效胰島素類似物。
干擾素的改進。
改進酶的性能。
易錯整合，判斷正誤。
E.coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端 (　 　)
載體質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因 (　 　)
抗蟲基因即使成功地插入植物細胞染色體上也未必能正常表達 (　 　)
PCR反應中溫度的周期性改變是為了使DNA聚合酶催化不同的反應 (　 　)
利用乳腺生物反應器能夠獲得一些重要的醫藥產品，如人的血清白蛋白，這是因為將人的血清白蛋白基因導入了動物的乳腺細胞中 (　 　)
蛋白質工程以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系為基礎 (　 　)
1．限制酶主要來源于原核生物，為什么不能切割自身DNA分子？
2．構建基因表達載體的目的是什么？
3．蛋白質工程為什么通過對基因進行操作來實現對天然蛋白質的改造？
關鍵能力·考點突破
知識點一　重組DNA技術的基本工具
考向?　基因工程工具酶的應用
例1 某科學家從細菌中分離出耐高溫淀粉酶(Amy)基因a，通過基因工程的方法，將基因a與載體結合后導入馬鈴薯植株中，經檢測發現Amy在成熟塊莖細胞中存在。結合圖形分析下列有關這一過程的敘述，正確的是 (　 　)
A．獲取基因a的限制酶的作用部位是圖中的①
B．基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA連接酶、質粒
C．連接基因a與載體的DNA連接酶的作用部位是圖中的②
D．一種限制酶只能識別一種特定的核糖核苷酸序列，并在特定的切點上切割DNA分子
與DNA有關的酶的比較
名稱 作用部位 作用底物 作用結果
限制酶 磷酸二酯鍵 DNA 將DNA切成兩個片段
DNA連接酶 磷酸二酯鍵 DNA片段 將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯鍵 脫氧核苷酸 將單個脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯鍵 DNA 將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
解旋酶 堿基對之 間的氫鍵 DNA 將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈
RNA聚合酶 磷酸二酯鍵 核糖核苷酸 將單個核糖核苷酸依次連接到RNA單鏈末端
〔變式訓練〕
1．(2022·福州模擬)下列關于DNA分子片段示意圖的敘述，正確的是(　 　)
某種限制性內切核酸酶可作用于①處
解旋酶可作用于②處
C．DNA 連接酶可作用于③處
D．某種限制性內切核酸酶作用于②處得到的黏性末端序列是GAATTC
考向?　載體的作用及特點
例2 下列有關基因工程中載體的說法，正確的是 (　 　)
A．在進行基因工程操作中，被用作載體的質粒都是天然質粒
B．所有的質粒都可以作為基因工程中的載體
C．質粒是一種獨立于細菌染色體外的鏈狀DNA分子
D．作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因
方法點撥
載體上標記基因的標記原理
載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵抗相關抗生素的能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，所以在受體細胞的培養體系中加入該種抗生素就可以只保留轉入載體的受體細胞，原理如下圖所示：
〔變式訓練〕
2．質粒是基因工程最常用的載體，下列有關質粒的說法正確的是 (　 　)
A．質粒不僅存在于細菌中，也存在于某些病毒中
B．細菌的基因只存在于質粒上
C．質粒為小型環狀DNA分子，存在于細菌擬核DNA之外的細胞質中
D．質粒是基因工程中的重要工具酶之一
考向?　DNA的粗提取與鑒定
例3 關于“DNA粗提取與鑒定”的實驗原理的敘述中，正確的是 (　 　)
A．用豬血為實驗材料的原因是豬血的紅細胞有細胞核，DNA含量多
B．利用DNA在2 mol/L的氯化鈉溶液中溶解度最低，易析出的特性提取DNA
C．利用DNA不溶于酒精，而細胞中的其他物質可溶于酒精的特性提純DNA
D．利用DNA與二苯胺作用而顯現紫色的特性鑒定DNA
取材原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。
過濾含DNA的研磨液時不能用濾紙代替紗布，否則會因DNA被吸附到濾紙上，而導致DNA大量損失。
鑒定DNA用的二苯胺試劑要現配現用，否則會影響鑒定的效果。
在DNA進一步提純時，選用預冷的95%的酒精的作用是溶解雜質和析出DNA。
本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核(無DNA)?？蛇x用雞血細胞作為材料。
〔變式訓練〕
3．(不定項) 如圖是“DNA 的粗提取與鑒定”實驗中幾個重要操作的示意圖，下列敘述正確的是 (　 　)
A．通過①操作使NaCl 溶液濃度降至0.014 mol/L，析出DNA
B．經①②操作，DNA留在紗布上；經③②操作，則DNA留在濾液中
C．圖④是用預冷的體積分數為95%的酒精來進一步純化粗提取的DNA
D．圖①③④都需要玻璃棒沿一個方向輕緩攪拌，以防止破壞DNA
知識點二　基因工程的基本操作程序
考向?　DNA片段的擴增及電泳鑒定
例4 (2022·北京模擬)如圖是快速RT—PCR過程示意圖，①和②為逆轉錄酶催化的逆轉錄過程，③是PCR過程。據圖分析下列敘述錯誤的是 (　 　)
A．逆轉錄酶具有DNA聚合酶能力
B．③PCR過程只需要引物b
C．RT—PCR可檢測基因表達水平
D．RT—PCR可檢測新冠病毒等RNA病毒
1．PCR技術和DNA復制的比較
2．DNA片段的電泳鑒定
根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。
將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。
待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。
將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1 mm為宜。
將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液(內含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。
接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5 V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。
取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
3．PCR產物的分析
(1) PCR產物的種類：主要看其DNA片段上的引物種類。
若只有一種引物，則是原始模板復制的產物，在每次循環中均有。
若含有兩種引物，則最早出現在第二次循環，以后每次循環中均有。
PCR產物的數量(以1個DNA分子經n次循環擴增的產物分析)。
① PCR產物的總數量：2n。
② PCR擴增的特異性片段的數量：2n－2。
〔變式訓練〕
4．(2021·天津模擬)PCR技術是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，使目的DNA得以迅速擴增。其簡要過程如圖所示。下列關于PCR技術敘述錯誤的是 (　 　)
A．PCR反應中新合成的DNA又可以作為下一輪反應的模板
B．PCR技術制備大量DNA時引物要被不斷消耗
C．DNA的合成方向總是從子鏈的3′端向5′端延伸
D．應用PCR技術與探針雜交技術可以檢測特定的基因
考向?　基因工程的操作程序
例5 北極比目魚中有抗凍基因，該基因編碼的抗凍蛋白具有11個氨基酸的重復序列，該序列重復次數越多，抗凍能力越強。下圖是獲取轉基因抗凍番茄植株的過程示意圖，下列有關敘述正確的是 (　 　)
A．過程①是獲取抗凍基因的過程，用到的酶只有限制酶
B．在重組質粒上，抗凍基因首端和末端一定具有啟動子和終止子，啟動和終止翻譯的進程
C．過程②用到的質粒是農桿菌的Ti質粒，要將重組質粒轉入農桿菌才能進行篩選
D．根據抗凍基因制作的DNA探針，可以用來檢測轉基因抗凍番茄植株中目的基因的存在
1．獲取目的基因方法的選擇
如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通過構建基因文庫的方法，即通過受體菌儲存并擴增目的基因后，從基因文庫中獲取目的基因。
如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比較小，可以通過DNA合成儀利用化學方法直接人工合成。
如果知道要擴增的目的基因及兩端的核苷酸序列，而且基因又比較大，可以通過PCR技術擴增目的基因。
2．啟動子、終止子與起始密碼子、終止密碼子的區別
位置 作用
啟動子 位于DNA分子上 RNA聚合酶識別和結合位點，啟動轉錄過程
起始密碼子 位于mRNA分子上 決定翻譯的開始
終止子 位于DNA分子上 決定轉錄的結束
終止密碼子 位于mRNA分子上 決定翻譯的結束
3．如何篩選出含有目的基因的受體細胞
原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環素抗性基因內部，則四環素抗性基因失活。
被轉化的細菌有三種：含環狀目的基因的細菌、含重組質粒的細菌、含自身環化質粒的細菌。
篩選方法：將混合處理后的細菌先放在含氨芐青霉素的培養基上培養，能生長的是含重組質粒的細菌和含自身環化質粒的細菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用無菌的絨布影印到含有四環素的培養基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環素培養基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。
〔變式訓練〕
5．(不定項)(2021·1月八省聯考遼寧卷)菊花是一種雙子葉植物，易感桃蚜，桃蚜不但直接影響植物生長，還是多種植物病毒的傳播媒介。雪花蓮凝集素基因GNA的表達產物能有效抑制桃蚜生長。某科研團隊運用農桿菌轉化法獲得了轉GNA基因菊花，下列有關敘述正確的是 (　 　)
A．受體細胞可以選擇菊花葉片細胞或桃蚜細胞
B．將目的基因GNA插入到Ti質粒的T—DNA上構建表達載體
C．菊花外植體產生的酚類化合物能吸引農桿菌移向受體細胞
D．應用抗蟲接種實驗，檢測轉基因菊花對桃蚜的抗性及抗性的程度
知識點三　基因工程的應用及蛋白質工程
考向?　基因工程的應用
例6 (2022·遼寧模擬)目前基因工程碩果累累，下列敘述錯誤的是 (　 　)
A．我國科學家將Bt毒蛋白基因導入棉花細胞，培育出的棉花既能抗蟲也能抗病毒
B．科學家可以把健康的外源基因導入有基因缺陷的細胞中，達到治療疾病的目的
C．可將藥用蛋白基因與乳腺蛋白基因的啟動子重組在一起，用來生產乳腺生物反應器
D．科學家試圖利用基因工程的方法改造豬的器官，解決器官移植中的免疫排斥問題
乳腺生物反應器與工程菌生產藥物的區別
比較內容 乳腺生物反應器 工程菌
含義 指讓外源基因在哺乳動物的乳腺中特異表達，利用動物的乳腺組織生產藥物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類細胞株系
受體基因結構與人類基因結構差異 動物基因結構與人類的基因結構基本相同 細菌合成的藥物蛋白可能沒有活性
基因表達 合成的藥物蛋白質與天然蛋白質相同 細菌和酵母菌的基因結構與人類有較大差異
受體細胞 動物受精卵 微生物細胞
目的基因導入方法 顯微注射法 感受態細胞法
生產條件 不需嚴格滅菌；溫度等外界條件對其影響不大 需嚴格滅菌，嚴格控制工程菌所需的溫度、pH、營養物質濃度等外界條件
藥物提取 從動物乳汁中提取 從微生物細胞或其培養液中提取
生產設備 畜牧業生產、提取設備 工業生產，設備精良
〔變式訓練〕
6．(不定項)(2021·山東濰坊期中)復合型免疫缺陷癥(SCID)患者缺失腺苷酸脫氨酶(ADA)基因，科學家將ADA基因通過X病毒轉入患者的T細胞中，再將攜帶ADA基因的T細胞注入患者體內，可改善患者的免疫功能。下列敘述正確的是 (　 )
A．可直接利用PCR 技術選擇性地將 ADA 基因擴增出來
B．X屬于動物病毒，是將ADA基因導入T細胞的載體
C．T細胞需在體外培養至一定數量后再注入患者體內
D．用正常ADA基因替換缺陷基因進行治療的方法屬于基因治療
考向?　蛋白質工程
例7 (不定項)下圖表示蛋白質工程的操作過程，相關說法正確的是 (　 )
A．蛋白質工程只能生產自然界已經存在的蛋白質
B．蛋白質工程中對蛋白質分子結構的了解是非常關鍵的工作
C．蛋白質工程是以基因工程為基礎的生物工程技術
D．蛋白質工程可以制造一種新的蛋白質也可以對現有的蛋白質進行改造
蛋白質工程與基因工程比較
項目 蛋白質工程 基因工程
區 別 過程 預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到對應的脫氧核苷酸序列 獲取目的基因→構建基因表達載體→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定
實質 定向改造或生產人類所需蛋白質 定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產品
結果 生產自然界沒有的蛋白質 一般是生產自然界已有的蛋白質
聯系 蛋白質工程是在基因工程的基礎上延伸出來的第二代基因工程。對現有蛋白質的改造或制造新的蛋白質，必須通過基因修飾或基因合成實現
〔變式訓練〕
7．已知生物體內有一種蛋白質(P)，該蛋白質是一種轉運蛋白，由305個氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。
回答下列問題。
從上述資料可知，若要改變蛋白質的功能，可以考慮對蛋白質的 進行改造。
以P基因序列為基礎，獲得P1基因的途徑有修飾 基因或合成 基因。所獲得的基因表達時是遵循中心法則的，中心法則的全部內容包括 復制；以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即： _。
蛋白質工程也被稱為第二代基因工程，其基本途徑是從預期蛋白質功能出發，通過 和
，進而確定相對應的脫氧核苷酸序列，據此獲得基因，再經表達、純化獲得蛋白質，之后還需要對蛋白質的生物 進行鑒定。
素養提升·強化思維
1．(2020·海南卷 )下列關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是 (　 　)
A．羊的成熟紅細胞可作為提取DNA的材料
B．提取植物細胞的DNA時，需要加入一定量的洗滌劑和食鹽
C．預冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解
D．在沸水浴條件下，DNA與二苯胺反應呈現藍色
2． (2020·北京卷)為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中(如圖)。
為檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因，同時避免內源HMA3基因的干擾，在進行PCR擴增時，應選擇的引物組合是 (　 　)
A．①＋③　　　　　B．①＋② C．③＋② D．③＋④
3．(2020·浙江7月選考)下列關于基因工程的敘述，正確的是 (　　)
若受體大腸桿菌含有構建重組質粒時用到的限制性內切核酸酶，則一定有利于該重組質粒進入受體并保持結構穩定
抗除草劑基因轉入某抗鹽植物獲得2個穩定遺傳轉基因品系，抗性鑒定為抗除草劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽。 表明一定是抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉入無關
抗除草劑基因轉入某植物獲得轉基因植株，其DNA檢測均含目的基因，抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑。表明一定是前者表達了抗性蛋白而后者只表達抗性基因RNA
已知不同分子量DNA可分開成不同條帶，相同分子量的為一條帶。用某種限制性內切核酸酶完全酶切環狀質粒后，出現3條帶。表明該質粒上一定至少有3個被該酶切開的位置
(2020·山東等級考)水稻胚乳中含直鏈淀粉和支鏈淀粉，直鏈淀粉所占比例越小糯性越強?？蒲腥藛T將能表達出基因編輯系統的DNA序列轉入水稻，實現了對直鏈淀粉合成酶基因(Wx基因)啟動子序列的定點編輯，從而獲得了3個突變品系。
將能表達出基因編輯系統的DNA序列插入Ti質粒構建重組載體時，所需的酶是 ，重組載體進入水稻細胞并在細胞內維持穩定和表達的過程稱為 。
根據啟動子的作用推測，Wx基因啟動子序列的改變影響了 ，從而改變了Wx基因的轉錄水平。與野生型水稻相比，3個突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列 (填“發生”或“不發生”)改變，原因是 。
為檢測啟動子變化對Wx基因表達的影響，科研人員需要檢測Wx基因轉錄產生的mRNA(Wx mRNA)的量。檢測時分別提取各品系胚乳中的總RNA，經 過程獲得總 cDNA。通過 PCR 技術可在總cDNA中專一性地擴增出Wx基因的cDNA，原因是
各品系Wx mRNA量的檢測結果如圖所示，據圖推測糯性最強的品系為 ，原因是
(2020·江蘇卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側的序列，具體流程如下圖(以EcoR Ⅰ酶切為例)：
請據圖回答問題：
步驟Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一種 酶，它通過識別特定的 切割特定位點。
步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′—羥基與5′—磷酸間形成 ；PCR循環中，升溫到95 ℃是為了獲得 ；Taq DNA聚合酶的作用是催化 。
若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是 (從引物①②③④中選擇，填編號)。
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5′—AACTATGCGCTCATGA—3′ ②5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′ ③5′—AGAGGCTACGCATTGC—3′ ④5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′
對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結果正確的是 。
A. 5′—AACTATGCG－－－－－－－AGCCCTT—3′
B. 5′—AATTCCATG－－－－－－－－CTGAATT—3′
C. 5′—GCAATGCGT－－－－－－－TCGGGAA—3′
D. 5′—TTGATACGC－－－－－－－－CGAGTAC—3′
微專題　限制酶的選擇方法　
1．限制酶選擇的依據
根據目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類
應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。
不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaI。
為避免目的基因和質粒的自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用PstI和EcoRI兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切點)。
2．根據質粒的特點確定限制酶的種類
3．根據Ti質粒的T DNA片段選擇限制酶，圖中甲、乙、丁Ti質粒均不宜選取，而丙Ti質粒宜選取(設切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)。
1．(2020·和平區二模)用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分別降解一個1 000 bp(1 bp即1個堿基對)的DNA分子，降解產物分別進行凝膠電泳，在電場的作用下，降解產物分開，凝膠電泳結果如下圖所示。該DNA分子的酶切圖譜(單位：bp)正確的是 ( 　)
圖甲、乙中標注了相關限制酶的酶切位點。培育轉基因大腸桿菌的敘述錯誤的是 ( )
A．若通過PCR技術提取該目的基因，應該選用引物甲和引物丙
B．圖中質粒和目的基因構建表達載體，應選用BclⅠ和HindⅢ剪切
C．若將基因表達載體導入受體細胞中，需選用感受態的大腸桿菌
D．在受體細胞中，氨芐青霉素抗性基因和目的基因可同時表達
3．用限制酶EcoRV單獨切割某普通質粒，可產生14 kb(1 kb 即1 000個堿基對)的長鏈，而同時用限制酶EcoR V、Mbo Ⅰ聯合切割該質粒，可得到三種長度的DNA片段，見下圖(其中*表示EcoR V限制酶切割后的一個黏性末端)。
若用MboⅠ限制酶單獨切割該普通質粒，則產生的DNA片段的長度為 (　 　)
A．2.5和5.5　　　　B．2.5和6 C．5.5和8 D．6和8
4． (不定項)(2021·湖北期末)下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中箭頭表示相關限制酶的酶切位點。下列說法正確的是 (　 　)
限制酶 BamH Ⅰ Hind Ⅲ EcoRⅠ Sma Ⅰ
識別序列 切割位點 G↓GATCC CCTAG↑G A↓AGCTT TTCGA↑A G↓AATTC CTTAA↑G CCC↓GGG GGG↑CCC
A．一個圖1所示的質粒分子經SmaⅠ切割后，含有4個游離的磷酸基團
B．用圖1中的質粒和圖2中的目的基因構建重組質粒，不能使用SmaⅠ切割
C．圖2中為防止酶切后單個含目的基因的DNA片段自身連接成環狀，不能使用EcoRⅠ
D．為了獲取重組質粒，最好用BamHⅠ和HindⅢ同時切割質粒和外源DNA
5．圖(a)中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamH Ⅰ和Sau3AⅠ三種限制性內切核酸酶的識別序列與切割位點，圖(b)為某種表達載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。
根據基因工程的有關知識，回答下列問題：
經BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被 酶切后的產物連接，理由是 。
若某人利用圖(b)所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖(c)所示。這三種重組子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產物的有 ，不能表達的原因是
。
DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有 和 ，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是_ 。
(2019·江蘇卷)圖1是某基因工程中構建重組質粒的過程示意圖，載體質粒P0具有四環素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。請回答下列問題：
圖1
EcoR V酶切位點為，EcoR V酶切出來的線性載體P1為 末端。
用Taq DNA聚合酶進行PCR擴增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個堿基為 的脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在 酶作用下，形成重組質粒P3。
為篩選出含有重組質粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板進行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長情況如下表(“＋”代表生長，“－”代表不生長)。根據表中結果判斷，應選擇的菌落是 (填表中字母)類，另外兩類菌落質粒導入情況分別是 、 。
菌落類型 平板類型　　　　　　 A B C
無抗生素 ＋ ＋ ＋
氨芐青霉素 ＋ ＋ －
四環素 ＋ － －
氨芐青霉素＋四環素 ＋ － －
為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR鑒定時應選擇的一對引物是 。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質粒中擴增出了400 bp片段，原因是 。
圖2
1．(全國卷Ⅰ)某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌。結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}：
質粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有______________________________(答出兩點即可)，而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。
如果用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含環狀目的基因的細胞是不能區分的，其原因是______________________________________；并且_________________和______________的細胞也是不能區分的，其原因是____________________________________。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有__________的固體培養基。
基因工程中，某些噬菌體經改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自于________________。
3．幾丁質是許多真菌細胞壁的重要成分，幾丁質酶可催化幾丁質水解。通過基因工程將幾丁質酶基因轉入植物體內，可增強其抗真菌病的能力。回答下列問題：
在進行基因工程操作時，若要從植物體中提取幾丁質酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實驗材料，原因是________________。提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是________________。
以mRNA為材料可以獲得cDNA，其原理是____________________________________________________。
若要使目的基因在受體細胞中表達，需要通過質粒載體而不能直接將目的基因導入受體細胞，原因是____________________________________(答出兩點即可)。
當幾丁質酶基因和質粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學鍵是____________。
若獲得的轉基因植株(幾丁質酶基因已經整合到植物的基因組中)抗真菌病的能力沒有提高，根據中心法則分析，其可能的原因是________________________。
4．真核生物基因中通常有內含子，而原核生物基因中沒有，原核生物沒有真核生物所具有的切除內含子對應的RNA序列的機制。已知在人體中基因A(有內含子)可以表達出某種特定蛋白(簡稱蛋白A)?；卮鹣铝袉栴}：
某同學從人的基因組文庫中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細胞卻未得到蛋白A，其原因是_______________________________________________________________。
若用家蠶作為表達基因A的受體，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用________作為載體，其原因是__________________________________。
若要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。因為與家蠶相比，大腸桿菌具有____________________________________(答出兩點即可)等優點。
若要檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用的檢測物質是______________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗體”)。
艾弗里等人的肺炎雙球菌轉化實驗為證明DNA是遺傳物質做出了重要貢獻，也可以說是基因工程的先導，如果說他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是______________________。
5．下圖是科學家利用大腸桿菌生產人胰島素的部分過程。請結合相關知識回答問題：
除圖示方法獲得目的基因(人胰島素基因)外，還可通過__________的方法獲得目的基因。
圖示所獲得的人胰島素基因在大腸桿菌中不能表達，需要質粒為其提供________________等調控因子；質粒含有一個或多個__________切割位點，供目的基因插入其中；質粒上還含有______，供重組DNA的鑒定和選擇。
圖中切割人胰島素基因和質粒的酶(酶A)相同，其目的是________________。將重組DNA分子導入大腸桿菌前，常需用________處理大腸桿菌，使其成為感受態細胞。
(4)由于大腸桿菌中沒有________________________等結構，其內合成的人胰島素沒有活性，需要經過再加工。
4．血清白蛋白具有維持血液膠體滲透壓、清除自由基、抑制血小板聚集和抗凝血等生理功能，科學家利用基因工程技術成功培育出了轉基因羊，從其分泌的乳汁中可提取血清白蛋白。請回答下列問題：
目前獲得目的基因常用方法之一是從____________中獲取，進而用________技術擴增，此技術應滿足的條件有：適宜的溫度和pH、原料、模板、能量、_____________、______________酶。
將血清白蛋白基因與乳腺蛋白基因的________等調控組件重組在一起，構建基因表達載體，該過程需要用__________________酶，然后通過________技術，導入羊的受精卵中。通過早期胚胎培養發育成桑椹胚或囊胚后移植到受體母羊子宮內，最終獲得分泌的乳汁中含有血清白蛋白的乳腺生物反應器。
可利用________________技術檢測轉基因羊的乳汁中是否含有血清白蛋白。
如圖表示抗蟲棉的培育過程，請據圖回答下列問題：
圖中所示的目的基因是________，構建重組Ti質粒時應該將基因插入質粒中的TDNA上，原因是______________________________________________。
構建重組Ti質粒需要的酶有____________________，重組質粒除了目的基因和標記基因外，還有__________________。
圖中顯示將目的基因導入棉花細胞的方法是________法，可以將該重組質粒導入棉花細胞，而一般不能導入小麥或玉米等單子葉作物的細胞中，原因是________________________。
圖中過程③是________，過程④的實質是__________________。

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