資源簡介

(共39張PPT)
第三節 動物細胞工程及其應用
第二章 細胞工程
第2課時
在治療大面積燒傷時，通常采用的方法是取燒傷病人的健康皮膚進行自體移植。但對這樣的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且會產生免疫排斥反應。
動物細胞培養
動物細胞核移植
動物細胞融合
動物細胞工程
→是最基礎的技術
問題:什么是干細胞技術？
情境導入
植物體細胞雜交
植物細胞融合
植物組織培養
打破生殖隔離，克服遠緣雜交不親和障礙，培育出新的作物類型。
溫故知新：植物體細胞雜交技術
動物細胞融合技術及其應用
運用植物體細胞雜交技術，可培育新的作物類型
那么，能不能讓不同種動物的體細胞進行雜交，培育出集不同細胞優勢于一身的動物細胞呢？
動物細胞融合技術及其應用
實例：1970年，人—鼠細胞熒光標記融合實驗
人細胞
鼠細胞
紅色熒光染料標記的膜蛋白
綠色熒光染料標記的膜蛋白
細胞融合
人鼠雜交細胞
37°
培養40min
細胞融合
實驗表明：細胞膜具有流動性
動物細胞融合技術及其應用
動物細胞融合
概念
原理
誘導方法
使兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術。
細胞膜具有一定的流動性
物理法：電融合法
化學法：聚乙二醇（PEG)
生物法：滅活病毒誘導法
思考：滅活病毒誘導細胞融合的原理是什么呢？
動物細胞融合技術及其應用
問題2:滅活病毒誘導細胞融合的原理是什么呢？
滅活：是指用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結構。
原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發生作用，使細胞相互凝集，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合。
動物細胞融合技術及其應用
動物細胞融合
結果
意義
運用
形成具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息的雜交細胞
突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交成為可能。
第一
第二
第三
為制造單克隆抗體開辟了新途徑。
研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。
至今，種間、屬間、科間，甚至動物和植物之間的細胞融合都已獲得成功。
比較植物體細胞雜交和動物細胞融合的異同。
動物細胞融合技術及其應用
植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較
比較 植物體細胞雜交 動物細胞融合
原理
步驟 酶解法去掉 后，誘導 融合，形成 ，再經植物組織培養形成 。 分散成 后誘導細胞融合，形成 。
方法 聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2＋—高pH融合法、電融合法、離心法 PEG融合法、電融合法、
誘導法
結果 形成____________ 形成 ，以生產細胞產品
意義 打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種 突破有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能
細胞膜的流動性
細胞的全能性
細胞膜的流動性
細胞壁
原生質體
雜種細胞
雜種植株
單個細胞
雜交細胞
滅活病毒
雜種植株
雜交細胞
血清
（抗體主要分布部位）
傳統抗體制備方法:
向動物體內反復注射某種抗原，使動物產生抗體，然后從動物血清中分離所需抗體。
缺陷：
產量低、純度低，特異性差
血清含量有限
傳統抗體制作方法及缺陷：
抗體1
抗體2
抗體3
抗體4
…….
動物體內產生的特異性抗體的種類超過百萬種
抗原1
抗原2
抗原3
抗原4
B細胞1
B細胞2
B細胞3
B細胞4
…….
每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體
刺激
刺激
刺激
刺激
傳統抗體制作方法及缺陷：
抗體1
抗體2
抗體3
抗體4
…….
動物體內產生的特異性抗體的種類超過百萬種
抗原1
抗原2
抗原3
抗原4
B細胞1
B細胞2
B細胞3
B細胞4
…….
每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體
刺激
刺激
刺激
刺激
血清中獲取
純度低
特異性差
需要
得到
若能得到大量的B細胞4就可以
若我們只需要大量的抗體4有什么辦法嗎？
傳統抗體制作方法及缺陷：
為了增強人體的免疫力，臨床上常常需要大量的特定抗免疫體。由于用傳統方法制備的是含有多種抗體的混合抗體，不能說出用嗎專一性地對付某一類病原體，因而治療效果不佳。若采取單個漿細胞進行無性繁殖形成細胞群，這樣的細胞群就能產生化學性質單一、特異性強的抗體，即單克隆抗體。
每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體
單一B淋巴細胞
細胞群
選擇
克隆
產生
大量純度高特異性強的抗體
B淋巴細胞不可能無限增殖
科學家針對漿細胞在體外培養條件下不能無限增殖的問題，利用腫瘤細胞如骨髓瘤細胞）具有無限增殖的特性，成功地設計出一個制備方案。
傳統抗體制作方法及缺陷：
一個極富創造力的方案：
動物細胞融合
雜交細胞
動物細胞培養
單克隆抗體
骨髓瘤細胞（癌細胞）能無限增殖
一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體
雜交瘤細胞
既能迅速大量增殖，又能產生專一抗體
1975年，米爾斯坦和柯勒
1984年，諾貝爾生理學或醫學獎
傳統抗體制作方法及缺陷：
從患骨髓瘤的小鼠體內取骨髓瘤細胞的培養
多種已免疫B淋巴細胞
骨髓瘤細胞
誘導融合
小鼠的脾臟中獲取
注射特定的抗原,小鼠脾產生特定抗體的淋巴B細胞
單克隆抗體的制備過程：
B細胞1
B細胞2
B細胞3
B細胞4
B細胞2
B細胞3
B細胞4
骨髓瘤細胞
B細胞1
雜交1
雜交2
雜交3
雜交4
動物細胞融合
融合的細胞
B細胞2
B細胞3
B細胞4
骨髓瘤細胞
B細胞1
雜交1
雜交2
雜交3
雜交4
置于選擇性培養基上培養
第一次篩選
雜交1
雜交2
雜交3
雜交4
雜交瘤細胞(多種)
第一次篩選：用特定的選擇培養基在該培養基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長
動物細胞培養
單克隆抗體的制備過程：
①細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。
②人淋巴細胞中有這兩種DNA的合成途徑，但不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤細胞中只有D途徑，沒有S途徑，但能不斷分裂增殖。
篩選出雜交瘤細胞方法？
培養基中加入氨基嘌呤
B淋巴細胞及同型融合細胞
不能無限增殖，死亡
骨髓瘤細胞及同型融合細胞
不能無限增殖，死亡
雜交瘤細胞
能無限增殖，生長
拓展延伸：【第一次篩選】獲得雜交瘤細胞
克隆化培養
拓展延伸：【第二次篩選】得到能產生所需抗體的雜交瘤細胞
克隆化培養
拓展延伸：【第二次篩選】得到能產生所需抗體的雜交瘤細胞
抗原4
抗體檢測
拓展延伸：【第二次篩選】得到能產生所需抗體的雜交瘤細胞
抗體檢測呈陽性
抗體檢測
拓展延伸：【第二次篩選】得到能產生所需抗體的雜交瘤細胞
使用96孔板培養和篩選雜交瘤細胞，每一個孔盡量只接種一個雜交瘤細胞，即將單個雜交瘤細胞單獨培養，通過克隆化培養和抗體檢測，即可獲得大量能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。
拓展延伸：【第二次篩選】得到能產生所需抗體的雜交瘤細胞
抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞
體外培養
單克隆抗體
體內或體外培養
注射到小鼠腹腔
腹內培養相對于體外培養的優點：不需要特定的培養基，不需要嚴格控制環境條件。
單克隆抗體的制備過程：
單克隆抗體
雜交細胞
雜交瘤細胞
體外或體內培養
第一次篩選
骨髓瘤細胞
誘導融合
分泌特異抗體的雜交瘤細胞
雜交瘤細胞群
提取
已免疫的B淋巴細胞
動物細胞融合技術
動物細胞培養技術
特異性強
靈敏度高
可大量制備
注射抗原
選擇性培養基上培養
第二次篩選
克隆化培養抗體檢測
既能大量繁殖又能產生專一抗體
單克隆抗體的制備過程：
（1）雜交瘤細胞的特點__________________________________
（2）第二次篩選的目的________________________________________________
如何篩選_______________________________________ ____________
選擇抗體檢測呈___性的雜交瘤細胞，即_____________ _____________
（3）抗體檢測原理_______________________________________
獲得足夠數量的能分泌所需抗體的雜交瘤細胞
進行克隆化培養和抗體檢測（進行多次篩選）
分泌的抗體能與特定的抗原結合
抗原和抗體能夠特異性結合(分子水平的鑒定）
既能迅速大量增殖，又能產生抗體
（4）如何獲取大量所需雜交瘤細胞__________________________________________
（5）如何獲取單克隆抗體
①體外培養___________________________
②小鼠腹腔內培養_________________________
（6）單克隆抗體的優點_____________________________
_________________________________________________
在體外條件下大規模培養（接種于培養液中）或注射到小鼠腹腔內增殖
從細胞培養液中獲取
從小鼠腹水中獲取
能準確地識別抗原的細微差異，
與特定抗原發生特異性結合，并且可以大量制備
陽
單克隆抗體的制備過程：
1.作為診斷試劑——最廣泛的應用
抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體
比原來診斷方法提前了10d左右，準確率在90﹪以上。
具有準確、高效、簡易、快速特點
診斷優點：
單克隆抗體的應用
2.用于治療疾病和運載藥物
(主要用于癌癥治療)如：單克隆抗體+藥物 =“生物導彈”
優點：位置準確、療效高、副作用小
結合同位素的單抗
(“生物導彈” —單抗導向，藥物為彈頭)
單克隆抗體的應用
2.用于治療疾病和運載藥物
細胞凋亡
ADC的作用機制示意圖
①
ADC被細胞吞噬
②
⑤
ADC
抗體
藥物
接頭
單克隆抗體+接頭+藥物（如細胞毒素）=ADC
實現了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。
單克隆抗體的應用
2.用于治療疾病和運載藥物
脂質體給藥
高效 低毒 靶向
抗腫瘤藥物載體：阿霉素脂質體和順鉑脂質體已在國外上市。
單克隆抗體的應用
2.用于治療疾病和運載藥物
單克隆抗體不僅可以運載藥物，而且自身也能用于治療疾病。單克隆抗體藥物占有非常重要的地位。
排名 藥物 中文名 銷售額(億美元) 適應癥 類型
1 Humria 修美樂 199.36 自身免疫疾病 單抗
6 Herceptin 赫賽汀 70.32 乳腺癌等多種癌癥 單抗
7 Avastin 安維汀 68.98 結腸癌等多中癌癥 單抗
8 Rituxan 美羅華 68.01 白血病 單抗
9 Opdivo 納武單抗 67.35 多種腫瘤 單抗
2018年全球藥物銷售額排名前10的單抗藥物
修美樂已連續8年蟬聯榜首,2021年新冠疫苗(mRNA疫苗)位居榜首，修美樂位居第二位。
單克隆抗體的應用
神奇的干細胞—干細胞的種類（視頻）
干細胞技術應用于疾病治療
來源或存在 功能、特點 局限性
胚胎干細胞(ES細胞)
成體干細胞
誘導多能干細胞(iPS細胞)
早期胚胎，體積小，細胞核大、核仁明顯
能夠分化成為動物體內的任何細胞，并進一步形成組織、器官甚至生物個體
成體組織或器官，如造血干細胞、神經干細胞和精原干細胞等
體外誘導體細胞產生
能分化成為具有特定功能的細胞來治療疾病。無須破壞胚胎，且避免免疫排斥反應。
具有組織特異性，能分化成特定的細胞或組織
不具有發育成完整個體的能力
需從胚胎中獲取，涉及倫理問題，限制了它在醫學上的應用
技術不成熟。
面臨的問題:存在著導致腫瘤發生的風險。
干細胞技術應用于疾病治療
移植
取成纖維細胞等
iPS細胞
轉入相關因子
細胞發生轉化
分化
胰島細胞
神經元
血細胞
腸上皮細胞
心肌細胞
肝細胞
病人
iPS細胞用于治療人類疾病示意圖
誘導多能干細胞
（iPS細胞）
多種體細胞
定向誘導分化
體外誘導成纖維細胞
臨床治療疾病如：
白血病、帕金森病、阿而茨海默病等
iPS細胞
治療糖尿病疾病
治療神經疾病
治療心血管疾病
治療消化道疾病
干細胞技術應用于疾病治療
概述
應用
動物細胞融合
技術
過程
結果
意義
原理
融合方法
原理
應用
單克隆抗體的制備
免疫處理
第一次篩選
誘導融合
第二次篩選
大規模培養
診斷試劑
運載藥物
治療疾病
克隆化培養
抗體檢測
體外培養
小鼠腹腔
課堂小結
隨堂訓練
1.用小鼠經免疫的B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合形成的雜交瘤細胞生產的鼠源性單克隆抗體可用于分子檢測，但用于人類疾病治療時往往有一定的副作用。如果對小鼠進行基因改造，使其表達人類抗體，從而將鼠源性單克隆抗體改造成人源性單克隆抗體，則更適用于疾病治療。下列相關敘述正確的是( )
A.制備單克隆抗體時，首先要從小鼠體內分離出能分泌所需抗體的漿細胞
B.骨髓瘤細胞中沒有指導抗體合成的相關基因，但可讓融合細胞大量增殖
C.將產生相應抗體的雜交瘤細胞注入小鼠體內，然后從其血漿中分離抗體
D.將鼠源性單克隆抗體改造成人源性，可能降低人體發生免疫排斥的風險
答案：D
解析：A、制備單克隆抗體時，首先要從小鼠體內分離出經免疫的B淋巴細胞，A錯誤；B、骨髓瘤細胞中沒有指導抗體合成的相關基因，但具有自身在適宜條件下無限增殖的能力，B錯誤；C、將雜交瘤細胞進行克隆化培養后，將產生相應抗體的雜交瘤細胞注入小鼠體內，從小鼠的腹水中分離抗體，C錯誤；D、不同生物體的組織相容性抗原不同，若將鼠源性單克隆抗體直接用于人，會產生免疫排斥反應，對小鼠進行基因改造，使其表達人類抗體，從而將鼠源性單克隆抗體改造成人源性單克隆抗體，可減少人對鼠源性單克隆抗體的免疫排斥反應，D正確。故選D。
隨堂訓練
2.乳腺癌化療的藥物在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害，為降低藥物對患者的副作用，科研人員嘗試在單克隆抗體技術的基礎上，構建抗體一藥物偶聯物（ADC），過程如圖所示。下列相關說法正確的是( )
A.對①過程形成的雜交細胞進行克隆化培養和抗體檢測，經多次篩選，就可以獲得能分泌所需抗體的細胞
B.ADC通常由抗體、接頭和藥物三部分組成，ADC起作用時會被細胞吞噬，并在溶酶體內被分解后釋放藥物
C.經步驟③篩選得到的雜交瘤細胞具有的特點是能準確識別抗原的細微差異并能大量制備
D.ADC能降低乳腺癌治療藥物的副作用，原因是藥物能特異性地作用于乳腺癌細胞，避免其他細胞受損
答案：B
解析：A、經過程①形成的融合細胞有同種核兩兩融合和不同核融合細胞，需要經過特定的選擇性培養基篩選，A錯誤；B、抗體一藥物偶聯物（ADC）通常由負責選擇性識別癌細胞表面抗原的抗體，負責殺死癌細胞的藥物有效載荷，以及連接抗體和有效載荷的連接子三個部分組成，ADC起作用時會被細胞吞噬，并在溶酶體內被分解后釋放藥物，B正確；C、步驟③是抗體檢測，得到的雜交瘤細胞既能大量增殖又能產生專一性抗體，C錯誤；D、ADC能降低乳腺癌治療藥物的副作用，原因是抗體能特異性地作用于乳腺癌（靶）細胞，避免其他細胞受損，D錯誤。故選B。
3.正常情況下，機體中細胞分化往往不可逆轉。然而，在特定的實驗條件下，已分化的細胞被逆轉后可恢復全能性狀態，或者形成胚胎干細胞系，或者進一步發育成一個新個體。科學家已嘗試采用多種方法來制備誘導多能干細胞（iPS細胞）。下列敘述錯誤的是( )
A.iPS細胞可分化形成多種組織細胞，說明iPS細胞在分裂時很容易發生突變
B.iPS細胞最初是由成纖維細胞轉化而來的，后來發現已分化的T細胞、B細胞等也能被誘導為iPS細胞
C.由iPS細胞產生的特定細胞，可以在新藥的測試中發揮重要作用，但用于臨床治療中可能存在導致腫瘤發生的風險
D.iPS細胞具有細胞周期，它分化形成的神經細胞一般不具有細胞周期
答案：A
解析：iPS細胞是多能干細胞，可分化形成多種組織細胞，細胞分化的本質是基因選擇性表達，與突變的概率沒有直接關系，A錯誤；科學家已嘗試采用多種方法來制備iPS細胞，包括借助載體將特定基因導入細胞中，直接將特定蛋白導入細胞中或者用小分子化合物等來誘導形成iPS細胞，最初是由成纖維細胞轉化而來的，后來發現已分化的T細胞、B細胞等也能被誘導為iPS細胞，B正確；由iPS細胞產生的特定細胞，可以在新藥的測試中發揮重要作用，由于iPS細胞是干細胞，容易分裂，因此用于臨床治療中可能存在導致腫瘤發生的風險，C正確；iPS細胞是胚胎干細胞，因此具有細胞周期，神經細胞是高度分化細胞，不會進行連續分裂，一般不具有細胞周期，D正確。
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