資源簡介

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第三節 動物細胞工程及其應用
第二章 細胞工程
第1課時
1890年，希普將安哥拉兔的胚胎移入比利時兔的輸卵管內，得到了兩只安哥拉兔，這是世界上胚胎移植成功的首例
1907年，哈里森用一滴淋巴液成功培養了蝌蚪的神經元，首創了動物組織體外培養法
1951年，張明覺等發現了哺乳動物精子的獲能現象
1959年，試管家兔誕生，之后，多種試管動物相繼出生
1975年，米爾斯坦和科勒等創立了單克隆抗體技術
1978年，小鼠的桑椹胚被成功分割，次年，科學家分割綿羊胚胎獲得了同卵羔羊
1981年，埃文斯等成功分離和培養了小鼠的胚胎干細胞
1996年，世界上第一只體細胞克隆羊多莉在英國誕生，隨后多種克隆動物相繼問世
2006年，山中伸彌等獲得了誘導多能干細胞，我國科學家用這種細胞培育出了小鼠
2014年，世界上第一個用單細胞基因組測序進行遺傳病篩查的試管嬰兒在我國誕生
1958年，格登用非洲爪蟾進行體細胞核移植實驗，成功培育出性成熟個體，同一時期，我國科學家童第周等開展了魚類細胞核移植工作
2017年，我國科學家首次培育了體細胞克隆猴
細胞工程的發展歷程
積極思維
為什么克隆羊多莉會轟動全世界？
事實：
1996年7月，英國科學家韋爾穆特等人采用成年綿羊的乳腺細胞（動物體細胞）進行核移植，成功培育出世界上首例體細胞核移植克隆羊多莉，由此翻開了動物克隆史上嶄新的一頁。
思考
解釋 試分析克隆羊多莉的性狀與芬蘭白面母羊相似的原因。
哺乳動物體細胞核在卵母細胞細胞質的支持下，也和植物細胞一樣具有全能性。
提問：我們能否利用類似植物組織培養獲得完整植物體的方法培養動物細胞，使其發育成一個完整的個體？
不能，高度分化的植物細胞仍保持著全能性，而動物細胞的全能性會隨細胞分化程度的提高逐漸受到限制，分化潛能逐漸變弱。因此，目前還不能用類似植物組織培養的方法獲得完整的動物個體。
積極思維
為什么克隆羊多莉會轟動全世界？
實現方法：動物體細胞核移植技術
1.動物細胞核移植技術概念
移入
動物細胞
取核
卵母細胞
去核
重組細胞
發育
新胚胎
發育
克隆動物
用核移植方法得到的動物稱為克隆動物
2.原理：
動物細胞核的全能性
3. 生殖方式：無性生殖
動物細胞核移植技術
把動物的一個細胞的細胞核，移植到已經去除細胞核的卵母細胞中，并使這個重新組合的細胞發育成新胚胎，繼而發育成動物新個體的技術。
類型
分為 細胞核移植和 細胞核移植。
胚胎
體
胚胎細胞核移植 體細胞核移植
分化程度
全能性強度
核移植難度
低
高
高
低
容易
困難
動物細胞核移植技術
動物細胞核移植技術
動物細胞核移植技術也是一種克隆技術。克隆不僅僅是指無性繁殖，還包括遺傳上完全相同的分子、細胞或來自同一祖先的生物個體的無性繁殖群體。世界上已經培育出的克隆羊、克隆牛等克隆動物大多是通過動物細胞核移植技術實現的。用體細胞核移植技術進行的克隆就是體細胞克隆。這一過程需要利用顯微操作的方法，將供體的體細胞核注入受體的去核卵母細胞中，重組細胞經過培養后生長發育成胚胎。
一般指DNA分子擴增，如PCR技術，還包括單克隆抗體技術。
由一個細胞分裂所形成的細胞群體，如動物細胞培養技術、植物細胞培養技術。
分子水平：
細胞水平：
個體水平：
在生物學上，克隆是無性繁殖，具體地說，是指一個共同的祖先，通過無性繁殖的方法產生出來的一群遺傳特性相同的分子、細胞或個體。
克隆技術：是一個很廣的概念，凡指新形成的事、物與親本一致的現象均可稱為“克隆”。
指基因型完全相同的個體或群體，如植物組織培養技術、核移植技術。
動物細胞核移植技術
動物細胞核移植技術
動物細胞核移植技術的過程
屠宰場收集牛卵巢，采集卵母細胞，在體外培養到MⅡ期
“去核”的卵母細胞
供體細胞培養
通過顯微操作去核
高產奶牛
（供體）
從供體身體的某一部位（如耳）上取體細胞
①細胞質內存在激發細胞核全能性表達的物質；
②細胞體積大，便于操作；
③卵黃多，營養物質豐富。
卵母細胞的特點：
卵母細胞為什么要“去核”？
保證核移植的胚胎或動物的核遺傳物質全部來自供體細胞。
為什么要培養到MⅡ期？
正常排出的卵子即處于MⅡ期，此時卵母細胞已發育成熟，細胞質中具有激活重構胚以及早期胚胎發育的必需因子。
①對卵母細胞損傷較小；
②保證供體細胞的細胞核不被破壞，操作方便。
電融合法
激活方法：①物理方法②化學方法
形成重構胚
為什么將整個供體細胞注入卵母細胞中？
激活重構胚目的是什么？
用物理或化學方法(如電刺激、Ca2+載體、乙醇、蛋白酶合成抑制劑等)激活重構胚胎，使其完成細胞分裂和發育進程。
早期胚胎
去核的卵母細胞
供體細胞
將供體細胞注入去核的卵母細胞
問題1 整個過程用了哪些技術？
問題2 新生牛的性別？性狀表現與三個親本都相關嗎？
問題3 繁殖方式？
早期胚胎
(代孕)母牛體內
生出與供體奶牛遺傳物質基本相同的犢牛
克隆牛
動物細胞培養、動物體細胞核移植、早期胚胎培養、胚胎移植
與供體相同，性狀與代孕母牛無關
無性繁殖
動物細胞核移植技術
動物體細胞核移植技術的應用非常廣泛，對促進畜牧業的發展、培育優良畜種、生產實驗動物和轉基因動物、拯救顏危動物、保護動物資源都具有一定的應用價值。
動物細胞核移植技術的應用
①通過建立轉基因體細胞系，再利用體細胞核移植技術培育的轉基因克隆動物可以作為生物反應器，生產許多珍貴的醫用蛋白；
乳腺生物反應器
換成核移植過程相關細胞
動物細胞核移植技術的應用——醫藥領域
②在治療人類疾病時，轉基因克隆動物的細胞、組織或器官可以作為異種移植的供體；
③以患者作為供體培育的人核移植胚胎干細胞，經過誘導分化能形成相應的細胞、組織或器官，將它們一直給患者時可以避免免疫排斥反應。
動物細胞核移植技術的應用——醫藥領域
誘導
治療性克隆 vs iPS細胞治療
病人
取核
去核卵母細胞
重構胚胎
各種細胞組織或器官
誘導
取出
體細胞
核移植
移植
成纖維細胞
取出
轉入相關因子
iPS細胞
各種細胞組織或器官
胚胎干細胞
取出
移植
治療性克隆
iPS細胞治療
細胞發生轉化
動物細胞核移植技術的應用——科研領域
①研究克隆動物可以使人類更深入地了解胚胎發育及衰老過程；
②克隆一批遺傳背景相同的動物，可以通過它們之間的對比來分析致病基因；
③克隆特定疾病模型的動物，還能為研究該疾病的致病機制和開發相應的藥物提供幫助。
動物細胞核移植技術的應用——科研領域
在保護瀕危物種領域：增加動物數量。
黑草黃弄蝶
白鰭豚
金絲猴
動物細胞核移植技術的應用
問題與討論
大熊貓被譽為“活化石”和“中國國寶”，它是世界自然基金會的形象大使，也是世界生物多樣性保護的物種之一。2008年，我國宣布世界首張大熊貓基因組圖譜繪制完成。
我們能不能設計一個運用動物體細胞核移植技術繁殖大熊貓的方案呢？
在畜牧業生產中，利用體細胞核移植技術可以加速家畜遺傳改良的進程，促進優良畜群的繁育；在保護顏危物種方面，利用體細胞核移植技術增加動物數量的工作也已經初見成效。
動物細胞核移植技術的應用
概念：
從動物體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后在適當的培養條件下，讓這些細胞生長和增殖的技術。
目的：
獲得細胞或細胞產物；不能獲得完整動物個體。
原理：
細胞增殖（有絲分裂）
那么，動物細胞的培養需要哪些條件呢？
細胞生長和增殖
適宜條件
動物體
組織
取出
單個細胞
分散
動物細胞培養技術
無菌、無毒的環境
動物細胞培養的條件
營養物質
穩定的
內環境
<
<
糖類
氨基酸
無機鹽
維生素
……
適宜的溫度、pH和滲透壓
適宜的氣體環境
將細胞所需的營養物質按種類和所需量嚴格配制而成的培養基
含人類未知、細胞生長增殖所必需的物質，滿足細胞對未知營養成分的需求。
合成培養基 + 血清等天然成分
無菌：
無毒：
①培養液、用具：滅菌處理；
②無菌操作；
③適量添加抗生素
定期更換培養液，
以便清除代謝物。
液體培養基：
動物細胞培養技術
血清中含有蛋白質、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中，蛋白質主要為白蛋白和球蛋白；氨基酸有多種，是細胞合成蛋白質的基本原料，且有些氨基酸是動物細胞本身不能合成的（稱為必需氨基酸），必須由培養液提供；激素有胰島素、生長激素等。血清還含有多種未知的促細胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質，它們能促進細胞的生長、增殖和貼附。因此，在培養動物細胞時，為保證細胞能夠順利生長和增殖，一般需在培養基中添加10%~20％的血清等天然成分。
動物細胞培養通常要添加血清的原因
知識延伸
①適宜的溫度：
②適宜的pH：
③適宜的滲透壓：
動物細胞培養的
條件
營養物質
穩定的
內環境
<
<
糖類
氨基酸
無機鹽
維生素
……
無菌、無毒的環境
適宜的溫度、pH和滲透壓
適宜的氣體環境
維持細胞正常的形態和功能。
36.5±0.5℃
7.2-7.4
維持培養液的pH
95%空氣 + 5%CO2 的CO2 培養箱
O2：細胞代謝所必需
動物細胞培養技術
動物和人體的免疫系統可抵御各種微生物對機體的入侵，因此體內細胞生活的內環境幾乎是無菌、無毒的。而離體培養的細胞對微生物和有毒物質的防御能力極低，所以其培養環境中一旦有細菌、真菌或病毒等微生物的污染，培養的細胞就會死亡。
動物細胞培養技術
取動物組織
制成細胞懸液
轉入培養液進行原代培養
放入CO2培養箱中培養
傳代培養
放入CO2
培養箱中培養
用機械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理的方法，將組織分散成單個細胞
動物細胞培養技術的應用
傳代培養
原代培養
新鮮取樣的動物組織
單個細胞
細胞懸液
機械方法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理
加入培養液
貼壁細胞生長到接觸抑制
細胞懸液
胰蛋白酶或膠原蛋白酶等處理，分散成單個細胞，離心法收集后，將收集的細胞加入培養液
分瓶繼續培養
貼壁細胞生長到接觸抑制
放入CO2
培養箱中培養
動物細胞培養流程圖
動物細胞培養技術的應用
需分瓶進行傳代培養的原因：
懸浮細胞會因細胞密度過大、有害代謝物積累和培養液中營養物質減少等因素而分裂受阻
貼壁細胞在生長增殖時，除受上述因素影響外，還會發生接觸抑制現象
原代培養
從供體獲取細胞或組織后進行的初次培養。
傳代培養
將原代培養的細胞繼續轉接到新的培養基上繼續培養。
動物細胞培養技術的應用
進行傳代培養(分瓶培養)時，如何處理？
懸浮細胞
離心法收集
制成細胞懸液
貼壁細胞
胰蛋白酶處理
分瓶培養
動物細胞培養技術的應用
區分兩種“培養”的關鍵是看用胰蛋白酶處理的對象
第一次
用胰蛋白酶對剪碎的動物組織進行處理，使其分散成單個細胞后進行培養，為原代培養。
細胞培養過程中出現接觸抑制，用胰蛋白酶使其從瓶壁上脫離下來，然后，將其分散到多個培養瓶中繼續培養，為傳代培養。
第二次
問題:請列表比較動物細胞培養和植物組織培養。
動物細胞培養技術的應用
比較項目 植物組織培養 動物細胞培養
原理
培養基性質
培養基特有成分
培養結果
培養目的
相同點
植物組織培養和動物細胞培養的比較
獲得細胞或細胞產物
常用固體培養基
植物體
葡萄糖、動物血清
常用液體培養基
細胞增殖
細胞的全能性
許多細胞
快速繁殖等
蔗糖、植物激素
1.培養過程中細胞都進行有絲分裂，不涉及減數分裂；
2.均需無菌操作，需要適宜的溫度、pH等條件
動物細胞培養技術的應用
無菌、無毒
營養
溫度、pH和滲透壓
氣體環境
制備細胞懸液
原代培養
傳代培養
動物細胞培養
動物細胞培養的條件
動物細胞培養的過程
動物細胞核移植技術
動物細胞核移植過程及原理
動物細胞核移植技術的應用
課堂小結
隨堂訓練
1.下列關于動物細胞培養的敘述正確的是( )
A.動物細胞培養與植物組織培養依據的原理都是細胞的全能性
B.動物細胞培養時，定期更換培養液的目的是防止雜菌污染
C.在將組織分散成單個細胞時，可采用機械法，或利用胃蛋白酶進行的酶解法
D.在進行傳代培養時，懸浮培養的細胞一般采用離心法收集
答案：D
解析：A、植物組織培養依據的原理是植物細胞的全能性，而動物細胞培養的原理是細胞的增殖，A錯誤；
B、動物細胞培養時定期更換培養液的主要目的是清除代謝產物，防止代謝產物積累對細胞自身造成危害，而不是防止雜菌污染，B錯誤；
C、用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理剪碎的動物組織，可使其分散成單個細胞，也可采用機械方法獲得單個細胞，胃蛋白酶作用的適宜pH約為2，當pH大于6時，胃蛋白酶就會失去活性。而多數動物細胞培養的適宜pH為7.2～7.4，因此胃蛋白酶并不適用于此過程，C錯誤；
D、進行傳代培養時，懸浮培養的細胞處于游離狀態，因而可直接用離心法收集，D正確。
隨堂訓練
2.核移植技術除了研究生物學的基本問題外，在藥物生產、優良種畜的培育和繁殖、拯救瀕危動物、治療性克隆等方面，具有重要的實際應用價值。下列關于動物細胞核移植技術應用的敘述，錯誤的是( )
A.細胞核移植技術可用于優良種畜的培育
B.細胞核移植技術可用于人的生殖性克隆
C.核移植技術與干細胞誘導技術結合，可用于修補人體損傷的器官
D.核移植技術可用于轉基因動物的克隆，以保持轉基因動物的性狀
答案：B
解析：A、動物細胞核移植技術是將動物一個細胞的細胞核移入去核的卵母細胞中，使這個重新組合的細胞發育成新胚胎，繼而發育成動物個體的技術，因此利用細胞核移植技術可培育優良種畜，A正確；B、利用細胞核移植技術可用于人的治療性克隆，禁止用于生殖性克隆，B錯誤；C、核移植技術與干細胞誘導技術結合，可克隆出人體相應的器官，用于修補人體損傷的器官，C正確；D、利用核移植技術克隆轉基因動物，獲得的克隆動物遺傳物質主要來自細胞核供體，可以保持轉基因動物的性狀，D正確。故選B。
隨堂訓練
3.利用核移植克隆人體器官有望最終解決供體器官的短缺和器官移植出現的排異反應。下圖表示利用核移植克隆人體器官的過程。下列有關敘述錯誤的是( )
A.從病人體內取出的健康體細胞不會攜帶任何致病基因
B.上述過程不能夠說明離體的動物體細胞具有全能性
C.重構胚具有發育成完整個體的能力
D.圖中①②過程都發生了細胞增殖和分化
答案：A
解析：A、從病人體內取出的健康體細胞可能攜帶隱性致病基因，A錯誤；B、細胞全能性指高度分化的細胞離體后能發育成完整的生物個體或各種細胞的潛能，上述過程是將人體細胞的細胞核移入去核的卵母細胞中，重新組合的細胞發育成新胚胎，再分裂和分化出各種細胞，因此上述過程不能說明離體的動物體細胞具有全能性，B正確；C、重構胚能分裂和分化，具有發育成完整個體的能力，C正確；D、圖中①是由胚胎干細胞分裂分化成臟器組織干細胞和神經組織干細胞，此過程存在細胞增殖和細胞分化，②過程由臟器組織干細胞和神經組織干細胞分裂分化成臟器組織細胞和神經細胞，也存在細胞增殖和分化，D正確。故選A。
隨堂訓練
4.如圖為動物細胞培養的基本過程示意圖。下列相關敘述錯誤的是( )
A.容器甲中放入的一般是健康幼齡動物的組織，原因是其細胞分裂能力強
B.圖中丙和丁分別表示的是原代培養和傳代培養，其培養原理相同
C.制備乙可用胰蛋白酶處理，且處理時間越長越好
D.動物細胞培養需要提供O2和CO2等氣體環境，CO2的主要作用是維持培養液的pH
答案：C
解析：幼齡動物的細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛，易于培養，A正確；圖中丙和丁分別表示的是原代培養和傳代培養，其培養原理都是細胞增殖，B正確；制備乙可用胰蛋白酶處理，但是處理時間要適當，不是越長越好，C錯誤；動物細胞培養需要提供95%的空氣和5%的CO2等氣體環境，其中氧氣的作用是動物細胞有氧呼吸需要消耗的，而CO2的主要作用是維持培養液的pH，D正確。
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