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第二章 植物細(xì)胞工程
第二節(jié) 通過(guò)體細(xì)胞雜交可獲得新的植物體
素養(yǎng)目標(biāo)
生命觀念
基于植物體細(xì)胞雜交的定義，利用結(jié)構(gòu)與功能觀、生命的物質(zhì)觀和能量觀，理解植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的原理。
科學(xué)思維
根據(jù)植物組織培養(yǎng)和植物體細(xì)胞雜交的技術(shù)流程，利用比較與分析、歸納與概括的方法，理解兩者之間的區(qū)別和聯(lián)系。
科學(xué)探究
根據(jù)科學(xué)史，掌握植物體細(xì)胞雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)的過(guò)程，并能分析過(guò)程中使用的相關(guān)試劑及作用。
社會(huì)責(zé)任
根據(jù)科學(xué)史，掌握植物體細(xì)胞雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)的過(guò)程，并能分析過(guò)程中使用的相關(guān)試劑及作用。
教學(xué)重難點(diǎn)
植物體細(xì)胞雜交的過(guò)程和應(yīng)用價(jià)值。
01
植物體細(xì)胞雜交的過(guò)程。
02
課程導(dǎo)入
用傳統(tǒng)的有性雜交方法能得到這種后代嗎？
課程導(dǎo)入
番茄細(xì)胞
馬鈴薯細(xì)胞
＋
→
雜種細(xì)胞
成功培養(yǎng)原生質(zhì)體是植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的基礎(chǔ)
植物體細(xì)胞雜交技術(shù)
將不同種植物的體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新的植物體的方法。
原理
細(xì)胞膜的流動(dòng)性、植物細(xì)胞的全能性
可遺傳變異類型
染色體數(shù)目變異
育種類型
細(xì)胞工程育種
成功培養(yǎng)原生質(zhì)體是植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的基礎(chǔ)
原生質(zhì)體
利用酶解法去除植物細(xì)胞壁后的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，球形。
番茄細(xì)胞
馬鈴薯細(xì)胞
番茄原生質(zhì)體
馬鈴薯原生質(zhì)體
去除細(xì)胞壁
纖維素酶和果膠酶
顯微鏡下的球形原生質(zhì)體
成功培養(yǎng)原生質(zhì)體是植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的基礎(chǔ)
原生質(zhì)體與原生質(zhì)層
原生質(zhì)體
細(xì)胞壁
細(xì)胞膜
細(xì)胞質(zhì)
液泡
細(xì)胞核
原生質(zhì)層
細(xì)胞壁
細(xì)胞膜
細(xì)胞質(zhì)
液泡膜
細(xì)胞液
原生質(zhì)層不包括細(xì)胞液和細(xì)胞核。
原生質(zhì)體：指的是脫去細(xì)胞壁的細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞也可看做是原生質(zhì)體
原生質(zhì)層：成熟植物細(xì)胞的細(xì)胞膜、液泡膜和介于這兩層膜之間的細(xì)胞質(zhì)
成功培養(yǎng)原生質(zhì)體是植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的基礎(chǔ)
原生質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn)
沒(méi)有了堅(jiān)硬致密的細(xì)胞壁的阻礙，植物細(xì)胞之間的融合得以實(shí)現(xiàn)
01
原生質(zhì)體也更容易被導(dǎo)入外源基因，是植物基因工程的理想受體
02
與完整細(xì)胞一樣具有全能性，仍可產(chǎn)生細(xì)胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株
03
成功培養(yǎng)原生質(zhì)體是植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的基礎(chǔ)
原生質(zhì)體的獲取、培養(yǎng)
0.5~0.6mol/L的甘露醇
（或一定濃度的蔗糖）
（較高滲透壓）
纖維素酶、果膠酶
目的使細(xì)胞處于微弱的質(zhì)壁分離狀態(tài)，這樣有利于完整的原生質(zhì)體的釋放，防止原生質(zhì)體被破壞。
球形的
原生質(zhì)體
植物
細(xì)胞
材料選擇：分裂旺盛，再分化能力強(qiáng)的（植物的年齡、生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)等），如根尖、愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞等。
可用無(wú)菌的G6玻璃砂漏斗過(guò)濾滅菌。
純化方法：
沉降法（低速離心法）
原生質(zhì)體活力檢測(cè)：熒光標(biāo)記法、染色法、形態(tài)觀察法、胞質(zhì)環(huán)流法、氧攝入量評(píng)價(jià)法
成功培養(yǎng)原生質(zhì)體是植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的基礎(chǔ)
原生質(zhì)體活力檢測(cè)
活的原生質(zhì)體在光照下光合放氧，無(wú)光呼吸耗氧。
氧電極法測(cè)呼吸速率
活原生質(zhì)體會(huì)隨著外界滲透壓的變化體積變化。如放入高滲溶液，細(xì)胞皺縮。
滲透壓變化法
是否存在胞質(zhì)環(huán)流判斷原生質(zhì)體活力
胞質(zhì)環(huán)流法
FDA法：FDA（二乙酸熒光素）能穿越細(xì)胞質(zhì)膜，被活細(xì)胞內(nèi)的酯酶裂解，在熒光顯微鏡下發(fā)熒光（熒光素）。
伊凡藍(lán)法：伊凡藍(lán)不能穿過(guò)質(zhì)膜，但質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p壞使細(xì)胞被染色。
染色法
02
04
01
03
成功培養(yǎng)原生質(zhì)體是植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的基礎(chǔ)
植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的應(yīng)用
02
利用原生質(zhì)體進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)化
01
利用原生質(zhì)體融合獲得融合細(xì)胞
03
利用原生質(zhì)體再生植株
04
利用固定化原生質(zhì)體培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物
由雜種細(xì)胞培育出的新植物體可能會(huì)具有新的特性
科研實(shí)踐的一些成果
1960年英國(guó)植物生理學(xué)家科金用酶解法去除植物細(xì)胞壁，分離出了植物原生質(zhì)體。
1971年科研人員首次由原生質(zhì)體獲得了煙草再生植株。
據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，至少有400多種植物的原生質(zhì)體經(jīng)培養(yǎng)后成功再生植株。我國(guó)科研人員獲得50多種植物的原生質(zhì)體再生植株。
意義：原生質(zhì)體培養(yǎng)成功標(biāo)志著植物細(xì)胞工程技術(shù)又向前邁進(jìn)了一步，為植物細(xì)胞工程和基因工程的研究提供了先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)體系，具有重要的理論研究和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
由雜種細(xì)胞培育出的新植物體可能會(huì)具有新的特性
原生質(zhì)體的融合
番茄原生質(zhì)體
馬鈴薯原生質(zhì)體
正在融合的原生質(zhì)體
細(xì)胞膜的流動(dòng)性
原理
電刺激、離心、振蕩
物理手段
聚乙二醇（PEG）
化學(xué)手段
02
01
03
由雜種細(xì)胞培育出的新植物體可能會(huì)具有新的特性
正在融合的原生質(zhì)體
雜種細(xì)胞
再生出 細(xì)胞壁
誘導(dǎo)成功的標(biāo)志
融合的原生質(zhì)體經(jīng)培養(yǎng)后再生出新的細(xì)胞壁
影響原生質(zhì)體再生壁的因素
植物基因型、供體細(xì)胞的分化程度、培養(yǎng)基成分、滲透壓、有些植物加聚乙二醇有利于細(xì)胞壁發(fā)育
注意
再生出細(xì)胞壁是其能進(jìn)行有絲分裂的前提，且再生細(xì)胞壁之后，應(yīng)逐步降低滲透壓。
由雜種細(xì)胞培育出的新植物體可能會(huì)具有新的特性
重組細(xì)胞類型
番茄原生質(zhì)體(A)
馬鈴薯原生質(zhì)體(B)
在一定密度的細(xì)胞群體下進(jìn)行
可能是異種融合細(xì)胞
誘導(dǎo)融合后的產(chǎn)物是混合物：
①未融合的細(xì)胞： A、B
②兩兩融合的細(xì)胞：AA、BB、AB
③多細(xì)胞融合體
④部分融合
獲得雜種細(xì)胞需要進(jìn)行鑒定和篩選
由雜種細(xì)胞培育出的新植物體可能會(huì)具有新的特性
鑒定和篩選雜種細(xì)胞的常用方法（拓展）
機(jī)械選擇法：利用兩種原生質(zhì)體的某些可見(jiàn)標(biāo)志（如形態(tài)、顏色等差異），對(duì)融合產(chǎn)物進(jìn)行鑒別，篩選出雜種細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)。對(duì)于在形態(tài)、顏色上難以區(qū)分的原生質(zhì)體融合形成的異核體，可利用不同熒光素分別標(biāo)記兩親本的原生質(zhì)體，然后進(jìn)行誘導(dǎo)融合，在熒光顯微鏡下選擇同時(shí)帶有兩種熒光標(biāo)記的雜種細(xì)胞。
互補(bǔ)選擇法：這種方法的原理是利用現(xiàn)成的或誘發(fā)產(chǎn)生的各種缺陷型或抗性型的突變體細(xì)胞作為融合實(shí)驗(yàn)的材料。由于突變體均不能在特定的選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而能在該培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的是互補(bǔ)的雜種細(xì)胞，因此可將其篩選出來(lái)。
組織培養(yǎng)篩選法：根據(jù)植物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的要求與反應(yīng)不同，可作為選擇雜種細(xì)胞的依據(jù)。利用這種特性或人為地造成雜種細(xì)胞生長(zhǎng)和分化能力的差異來(lái)進(jìn)行雜種細(xì)胞的選擇。
由雜種細(xì)胞培育出的新植物體可能會(huì)具有新的特性
植物組織培養(yǎng)（雜種細(xì)胞具有全能性）
再生出細(xì)胞壁
的雜種細(xì)胞
愈傷組織
雜種植株
移栽后的植株
1978年梅爾徹斯等用植物體細(xì)胞雜交技術(shù)培育出的 “馬鈴薯-番茄”植株，外型傾向于番茄植株，花和葉具有雜種的特點(diǎn)，并結(jié)有畸形的小果實(shí)，但在根部沒(méi)有形成塊莖。
由雜種細(xì)胞培育出的新植物體可能會(huì)具有新的特性
植物體細(xì)胞雜交的成果
在此基礎(chǔ)上，科學(xué)家們利用植物體細(xì)胞雜交技術(shù)，又相繼培育出了白菜—甘藍(lán)、普通小麥—長(zhǎng)穗偃麥草等雜種。我國(guó)科學(xué)家還在木本植物的體細(xì)胞雜交方面培育出了多種柑橘屬不同種間的雜種植株。
白菜
甘藍(lán)
白菜—甘藍(lán)
由雜種細(xì)胞培育出的新植物體可能會(huì)具有新的特性
植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和局限性
打破生殖隔離，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙
優(yōu)點(diǎn)
①技術(shù)復(fù)雜、操作繁瑣、工作量大；
②不一定按人們需要表達(dá)優(yōu)良性狀
局限性
由雜種細(xì)胞培育出的新植物體可能會(huì)具有新的特性
植物體細(xì)胞雜交
A細(xì)胞
A原生質(zhì)體
B細(xì)胞
再生出細(xì)胞壁
愈傷組織
雜種植株
移栽后的植株
B原生質(zhì)體
正在融合的原生質(zhì)體
植物體細(xì)胞雜交
原生質(zhì)體獲取、融合
植物組織培養(yǎng)
由雜種細(xì)胞培育出的新植物體可能會(huì)具有新的特性
植物體細(xì)胞雜交
植物細(xì)胞
原生質(zhì)體
融合的原生質(zhì)體
去除細(xì)胞壁
雜種細(xì)胞
植株
融合
組培
再生細(xì)胞壁
纖維素酶果膠酶
PEG融合法
電融合法
離心法
植物體細(xì)胞雜交的結(jié)果是雜種植株；屬于可遺傳變異類型（染色體畸變）；
原理：細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性，植物細(xì)胞的全能性；
雜種細(xì)胞的鑒定和篩選以及雜種植株的鑒定和選育是獲得真正雜種的必要過(guò)程；
意義：克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙、培育新品種。
由雜種細(xì)胞培育出的新植物體可能會(huì)具有新的特性
項(xiàng)目 植物物組織培養(yǎng) 植物體細(xì)胞雜交技術(shù)
所屬范疇
原理
步驟
意義
聯(lián)系
保持優(yōu)良性狀,繁殖速度快、大規(guī)模生產(chǎn)提高經(jīng)濟(jì)效益
植物體細(xì)胞雜交技術(shù)應(yīng)用了植物組織培養(yǎng)技術(shù)
①去除細(xì)胞壁
②融合形成雜種細(xì)胞
③組織培養(yǎng)
細(xì)胞全能性
細(xì)胞膜一定的流動(dòng)性、細(xì)胞全能性
染色體變異、基因重組
無(wú)性繁殖
①脫分化
②再分化
克服不同種生物遠(yuǎn)緣雜交的障礙
課堂練習(xí)
1.紫花苜蓿營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，百脈根耐酸性強(qiáng)。研究者欲通過(guò)植物體細(xì)胞雜交的方法培育兼具二者優(yōu)良性狀的雜交種，下列相關(guān)分析正確的是（ ）
A.加入胰蛋白酶酶解以制備原生質(zhì)體
B.用滅活病毒誘導(dǎo)法可促進(jìn)原生質(zhì)體融合
C.融合的細(xì)胞即為雜種細(xì)胞
D.雜種細(xì)胞不一定具備雙親的優(yōu)良性狀
D
解析：紫花苜蓿細(xì)胞細(xì)胞壁的主要成分是纖維素和果膠，在制備原生質(zhì)體時(shí)，需要使用纖維素酶和果膠酶，A錯(cuò)誤；滅活病毒誘導(dǎo)法是誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的常用方法，不能用于誘導(dǎo)植物細(xì)胞原生質(zhì)體融合，B錯(cuò)誤；融合的細(xì)胞不一定為雜種細(xì)胞，可能是融合了同種原生質(zhì)體的細(xì)胞，C錯(cuò)誤；雜種細(xì)胞中基因的表達(dá)可能會(huì)相互干擾，故雜種細(xì)胞不一定具備雙親的優(yōu)良性狀，D正確。
課堂練習(xí)
2.實(shí)驗(yàn)人員利用矮牽牛（2n=14）的紅色花瓣細(xì)胞（液泡呈紅色）與枸杞（4n=48）的葉肉細(xì)胞，制備了相應(yīng)的原生質(zhì)體，并誘導(dǎo)其融合，經(jīng)篩選、培養(yǎng)獲得雜種植株。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（ ）
A.獲得該雜種植株時(shí)不用考慮兩種高等植物間的生殖隔離問(wèn)題
B.可利用聚乙二醇、滅活的病毒等方法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合
C.可利用光學(xué)顯微鏡觀察，篩選出雜種原生質(zhì)體
D.若原生質(zhì)體均為兩兩融合，則融合后的細(xì)胞中染色體數(shù)目不都為62條
B
解析：植物體細(xì)胞雜交獲得雜種植株克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，故獲得題述雜種植株時(shí)不用考慮兩種高等植物間的生殖隔離問(wèn)題，A正確；誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合時(shí)，可以采用物理方法（電融合、離心等）和化學(xué)方法（聚乙二醇等），而滅活的病毒是誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的方法之一，B錯(cuò)誤；雜種原生質(zhì)體含有紅色液泡和葉綠體，所以可利用光學(xué)顯微鏡觀察，篩選得到融合后的雜種原生質(zhì)體，C正確；若原生質(zhì)體均為兩兩融合，則會(huì)形成3種細(xì)胞，即矮牽牛紅色花瓣細(xì)胞自身融合的細(xì)胞、枸杞葉肉細(xì)胞自身融合的細(xì)胞以及雜種細(xì)胞，所以融合后的細(xì)胞中染色體數(shù)目為28條或96條或62條，D正確。
課堂練習(xí)
3.現(xiàn)有甲、乙兩種二倍體純種植物，甲植物的光合作用產(chǎn)量高于乙植物，但乙植物更適宜在鹽堿地種植，相關(guān)性狀均由核基因控制。現(xiàn)要利用甲、乙兩種植物培育出高產(chǎn)、耐鹽的植株。下列技術(shù)不可行的是（ ）
A.利用植物體細(xì)胞雜交技術(shù)，可以獲得符合要求的四倍體雜種植株
B.將乙種植物耐鹽基因?qū)爰追N植物的體細(xì)胞中，可培育出所需植株
C.兩種植物雜交后得到F1，再利用單倍體育種，可較快獲得所需植株
D.誘導(dǎo)兩種植物的花粉融合后培育成幼苗，再用秋水仙素處理可培育出所需植株
解析：利用植物體細(xì)胞雜交技術(shù)，獲得的雜種植株理論上具有兩個(gè)親本的遺傳特性，A正確；將乙種植物耐鹽基因?qū)爰追N植物的體細(xì)胞中，再利用組織培養(yǎng)技術(shù)可培育出所需植株，B正確；甲、乙為不同物種，存在生殖隔離，一般不能雜交，即使能雜交，形成的后代也是不可育的，C錯(cuò)誤；誘導(dǎo)兩種植物的花粉融合后培育成幼苗，再用秋水仙素處理，可得到符合要求的四倍體純種植株，D正確。
C
課堂練習(xí)
4.20世紀(jì)60年代，科學(xué)家嘗試將番茄和馬鈴薯雜交，希望培育出一種地上結(jié)番茄，地下結(jié)馬鈴薯的超級(jí)作物，傳統(tǒng)的雜交方法很難實(shí)現(xiàn)，科學(xué)家利用體細(xì)胞雜交技術(shù)得到了“番茄—馬鈴薯”雜種植株，但是沒(méi)有出現(xiàn)地上結(jié)番茄，地下結(jié)馬鈴薯的現(xiàn)象。下列關(guān)于該技術(shù)的敘述，錯(cuò)誤的是（ ）
A.培育“番茄—馬鈴薯”雜種植株的原理是植物細(xì)胞具有全能性和細(xì)胞膜的流動(dòng)性
B.“番茄—馬鈴薯”雜種植株，沒(méi)有出現(xiàn)地上結(jié)番茄，地下結(jié)馬鈴薯的原因是存在生殖隔離
C.利用纖維素酶和果膠酶去除細(xì)胞壁得到原生質(zhì)體，以免影響細(xì)胞間雜交
D.原生質(zhì)體融合是體細(xì)胞雜交的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可借助物理法、化學(xué)法進(jìn)行融合
B
解析：A、植物體細(xì)胞雜交技術(shù)是指將不同來(lái)源的植物體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新植物體的技術(shù)，所以培育“番茄—馬鈴薯”雜種植株的原理是植物細(xì)胞具有全能性和細(xì)胞膜的流動(dòng)性，A正確；B、“番茄—馬鈴薯”雜種植株沒(méi)有出現(xiàn)地上結(jié)番茄，地下結(jié)馬鈴薯的原因是生物體內(nèi)基因的表達(dá)相互干擾，B錯(cuò)誤；C、植物細(xì)胞只有在去除細(xì)胞壁成為原生質(zhì)體后才能融合，需用纖維素酶和果膠酶去除細(xì)胞壁，以免影響細(xì)胞間雜交，去除細(xì)胞壁后可得到原生質(zhì)體，C正確；D、原生質(zhì)體融合是體細(xì)胞雜交的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可借助物理法（電融合法、離心法）、化學(xué)法（PEG融合法、高Ca2+—高pH融合法）進(jìn)行融合，D正確。故選B。
課堂練習(xí)
5.某科研人員利用番茄（2n=24）和馬鈴薯（4n=48）進(jìn)行體細(xì)胞雜交。下列有關(guān)敘述正確的是（ ）
A.用酶解法去除細(xì)胞壁時(shí)，應(yīng)在低滲溶液中進(jìn)行
B.誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合時(shí)，常使用的化學(xué)誘導(dǎo)劑是聚乙二醇
C.雜種植株的所有體細(xì)胞均能進(jìn)行減數(shù)分裂產(chǎn)生可育配子
D.此項(xiàng)技術(shù)可以打破生殖隔離，定向改造生物性狀
B
解析：用酶解法去除細(xì)胞壁時(shí)，為維持細(xì)胞形態(tài)，應(yīng)在等滲溶液中進(jìn)行，在低滲溶液中原生質(zhì)體會(huì)吸水漲破，A錯(cuò)誤；誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的過(guò)程中常采用的化學(xué)誘導(dǎo)劑是聚乙二醇，B正確；雜種植株的體細(xì)胞都不能進(jìn)行減數(shù)分裂，C錯(cuò)誤；植物體細(xì)胞雜交技術(shù)可以打破生殖隔離，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙，但不能達(dá)到定向改造生物性狀的目的，D錯(cuò)誤。
總結(jié)歸納
概念
植物細(xì)胞融合
原生質(zhì)體制備
過(guò)程
變異類型
植物體細(xì)胞雜交
優(yōu)缺點(diǎn)
植物組織培養(yǎng)
原生質(zhì)體融合
原理
育種類型

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