資源簡介

難點(diǎn)突破練75　基因工程的綜合考查
一、選擇題
1．(2023·深圳市高級(jí)中學(xué)高三模擬)紅細(xì)胞生成素(EPO)是人體內(nèi)促進(jìn)紅細(xì)胞生成的一種糖蛋白，可用于治療腎衰性貧血等疾病。由于天然 EPO來源極為有限，某科研團(tuán)隊(duì)采用基因工程培育轉(zhuǎn)基因羊作為乳腺生物反應(yīng)器，使其能合成EPO。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)需將EPO基因插入乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子的上游
B．一般情況下，該轉(zhuǎn)基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺細(xì)胞中表達(dá)
C．可用顯微注射技術(shù)將含有EPO基因的表達(dá)載體導(dǎo)入羊的受精卵中
D．用PCR擴(kuò)增人EPO基因，需要一段已知的EPO基因核苷酸序列
2．為提高紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇的產(chǎn)量，研究人員構(gòu)建紫杉醇合成關(guān)鍵酶基因(Bapt)的超表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入紅豆杉細(xì)胞，具體流程如圖。下列相關(guān)說法不正確的是(　　)
A．p1301載體上應(yīng)含有增強(qiáng)Bapt基因表達(dá)的序列
B．超表達(dá)載體中應(yīng)含有潮霉素抗性基因作為標(biāo)記基因
C．可使用Bapt基因制成的探針檢測(cè)過程⑤是否成功
D．工廠化生產(chǎn)紫杉醇需將改造后的紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)至愈傷組織
3．(2023·通州高三三模)為增加油菜種子含油量，科研人員嘗試將酶D基因與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(引導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入葉綠體)基因連接(圖甲)，導(dǎo)入Ti質(zhì)粒(圖乙)，最終獲得轉(zhuǎn)基因油菜品種，下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．用Cla Ⅰ切割酶D基因和轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因，再利用DNA連接酶連接獲得目的基因
B．用Xba Ⅰ和Sac Ⅰ同時(shí)切割目的基因和載體片段，連接后獲得重組Ti質(zhì)粒
C．相對(duì)于將酶D基因插入受體細(xì)胞染色體DNA中，將其插入葉綠體DNA中可防止基因污染
D．轉(zhuǎn)基因油菜的酶D基因只表達(dá)于含葉綠體的細(xì)胞，并在葉綠體內(nèi)轉(zhuǎn)錄、翻譯
4．(2024·錦州高三質(zhì)檢)實(shí)時(shí)熒光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸檢測(cè)，其原理：在PCR復(fù)性過程中探針和引物一起與模板結(jié)合，探針兩側(cè)分別帶有熒光基團(tuán)和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團(tuán)，新鏈延伸過程中，DNA聚合酶會(huì)破壞探針，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而發(fā)出熒光。利用RT－PCR進(jìn)行核酸檢測(cè)的相關(guān)過程如圖所示。下列說法不正確的是(　　)
A．做RT－PCR之前，需要先根據(jù)cDNA的核苷酸序列合成引物和探針
B．RNA不能作為PCR擴(kuò)增的模板，故需要將樣本中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA后再進(jìn)行擴(kuò)增
C．若檢測(cè)結(jié)果有強(qiáng)烈熒光信號(hào)發(fā)出，說明被檢測(cè)者沒有感染病毒
D．病毒的檢測(cè)還可以檢測(cè)病毒表面的物質(zhì)或病毒引發(fā)產(chǎn)生的抗體，其原理都是抗原—抗體雜交
5．研究表明，服用α—干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。人參是一種名貴藥材，具有較好的滋補(bǔ)作用。如圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細(xì)胞的流程，①～④表示相關(guān)的操作。若限制酶EcoRⅠ識(shí)別序列為G↓AATTC，BamHⅠ識(shí)別序列為G↓GATCC。下列選項(xiàng)不正確的是(　　)
A．步驟①中，利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，設(shè)計(jì)引物序列的主要依據(jù)是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列
B．在過程③中T—DNA 整合到受體細(xì)胞的染色體 DNA 上
C．科研人員在兩種引物的一端分別加上了 GAATTC 和 GGATCC 序列，目的是方便后續(xù)的剪切和連接
D．過程④中，科研人員最終未能檢測(cè)出干擾素基因，其原因可能是干擾素基因未能導(dǎo)入人參愈傷組織細(xì)胞
6．(2023·長沙高三二模)載體是基因工程中攜帶外源DNA片段(目的基因)進(jìn)入受體細(xì)胞的重要運(yùn)載工具，常見的載體類型主要有基因克隆載體和基因表達(dá)載體。如圖是利用細(xì)菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程示意圖，下列相關(guān)敘述正確的是(　　)
A．重組載體a、重組載體b分別是基因表達(dá)載體和基因克隆載體
B．載體a和載體b都必須含有限制酶切割位點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因
C．必須把目的基因插入重組載體a的啟動(dòng)子和終止子之間
D．培養(yǎng)細(xì)菌a和細(xì)菌b的培養(yǎng)基在營養(yǎng)成分和功能上沒有明顯差異
7．(2024·成都高三檢測(cè))研究人員利用綠色熒光蛋白基因(sGFP)轉(zhuǎn)染大麗輪枝菌，培育表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因菌株，主要過程如圖所示(圖中a鏈和b鏈分別是相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈)。下列說法正確的是(　　)
A．利用PCR擴(kuò)增sGFP時(shí)需解旋酶打開DNA雙鏈，b鏈的黏性末端堿基序列(5′→3′)為AGCT
B．應(yīng)將目的基因插入到復(fù)制原點(diǎn)，以保證sGFP基因可以在大麗輪枝菌細(xì)胞中表達(dá)
C．先將目的基因?qū)朕r(nóng)桿菌，再將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌放置于含有潮霉素的培養(yǎng)基上，篩選出含有目的基因的農(nóng)桿菌
D．最終通過抗原－抗體雜交技術(shù)檢測(cè)綠色熒光以篩選出綠色熒光蛋白旺盛表達(dá)的大麗輪枝菌
8．(2023·韶關(guān)高三聯(lián)考)真菌AFPs基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能提高細(xì)胞的抗凍能力，將AFPs基因?qū)敕阎信嘤箖龇哑贩N，延長番茄果實(shí)的儲(chǔ)存期。AFPs基因及基因表達(dá)載體的元件組成情況如圖所示，圖中的EcoR Ⅰ、HindⅢ、BamHⅠ、SmaⅠ均表示限制性內(nèi)切核酸酶，相關(guān)酶的切割位點(diǎn)分布如圖所示，基因經(jīng)所有酶切割后均會(huì)產(chǎn)生不同的黏性末端。下列分析正確的是(　　)
A．用限制性內(nèi)切核酸酶可從真菌細(xì)胞內(nèi)獲取大量的AFPs基因
B．構(gòu)建基因表達(dá)載體宜選擇BamHⅠ、HindⅢ與E.coli DNA連接酶
C．需用顯微注射技術(shù)將重組質(zhì)粒注入番茄胚細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)基因植株
D．含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上正常生長
9．如圖為質(zhì)粒pUC18，為生產(chǎn)出滿足需求的質(zhì)粒載體，利用定點(diǎn)誘變技術(shù)，通過設(shè)計(jì)具有誘變位點(diǎn)的引物P1和引物P2進(jìn)行PCR，來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)載體的單堿基突變，目的是使質(zhì)粒pUC18不能被限制酶Eam1105Ⅰ識(shí)別，但依然具有氨芐青霉素抗性。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．誘變位點(diǎn)位于限制酶Eam1105Ⅰ識(shí)別序列中
B．PCR反應(yīng)體系由P1、P2兩種引物、脫氧核苷酸、TaqDNA聚合酶及含Mg2＋的緩沖液組成
C．誘變成功的質(zhì)粒依然具有氨芐青霉素抗性，利用了密碼子具有簡并性的原理
D．誘變成功的質(zhì)粒pUC18經(jīng)過EcoRⅠ、Eam1105Ⅰ雙酶切后進(jìn)行電泳，只能產(chǎn)生1條條帶
10．(2024·丹東第二中學(xué)高三期末)為提高大豆對(duì)磷元素的吸收能力，研究人員利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將水稻的耐低磷基因OsPTF轉(zhuǎn)移到大豆植株中，如圖為重組Ti質(zhì)粒上T－DNA的序列結(jié)構(gòu)示意圖。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．以水稻RNA為模板通過逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增可獲得大量OsPTF基因
B．RNA聚合酶與啟動(dòng)子1識(shí)別并結(jié)合后，啟動(dòng)抗除草劑基因的轉(zhuǎn)錄
C．可通過含除草劑的選擇培養(yǎng)基篩選含有目的基因的大豆愈傷組織
D．用EcoRⅠ、BamHⅠ酶同時(shí)切割重組Ti質(zhì)粒后，經(jīng)電泳分離至少得到兩個(gè)不同長度的條帶
二、非選擇題
11．(2024·珠海實(shí)驗(yàn)中學(xué)高三月考)土壤鹽漬化影響水稻生長發(fā)育。科研人員將水稻耐鹽堿基因OsMYB56導(dǎo)入不耐鹽堿水稻品種吉粳88中，培育出了耐鹽堿水稻新品種。其操作流程及可能用到的限制酶如圖所示，圖中Bar為抗除草劑基因，AmpR為氨芐青霉素抗性基因，TetR為四環(huán)素抗性基因。請(qǐng)分析回答：
限制酶 識(shí)別序列和切割位點(diǎn)
Sac Ⅰ －GAGCT↓C－
Sma Ⅰ －CCC↓GGG－
BamH Ⅰ －G↓GATCC－
Bcl Ⅰ －T↓GATCA－
(1)過程①利用PCR技術(shù)擴(kuò)增并改造OsMYB56基因需要添加引物，為了構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)用相同限制酶切割后的質(zhì)粒和OsMYB56基因能正確連接，應(yīng)選用的引物組合為______________。
A．5′－CCCGGG…－3′和5′－GGATCC…－3′
B．5′－GAGCTC…－3′和5′－GGATCC…－3′
C．5′－GAGCTC…－3′和5′－TGATCA…－3′
D．5′－CCCGGG…－3′和5′－TGATCA…－3′
(2)根據(jù)基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)組成分析，Ti質(zhì)粒中的CaMV 53S是__________。
(3)為篩選出含重組T－DNA的水稻愈傷組織細(xì)胞，應(yīng)在添加__________的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。誘導(dǎo)水稻愈傷組織細(xì)胞再分化發(fā)育成植株的培養(yǎng)過程中，__________(填“需要”或“不需要”)給予光照。
(4)為確定轉(zhuǎn)基因耐鹽堿水稻是否培育成功，可用________________方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽堿性。經(jīng)檢測(cè)，科研人員發(fā)現(xiàn)部分獲得耐鹽堿基因OsMYB56的水稻幼苗不具有耐鹽堿能力，原因可能是_________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
12．(2024·黃岡高三統(tǒng)考)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的原理如下：一條單鏈向?qū)NA(sgRNA)引導(dǎo)核酸酶Cas9到一個(gè)特定的基因位點(diǎn)進(jìn)行切割，如圖1所示。研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的發(fā)生與TDO2基因編碼的色氨酸2,3－雙加氧酶(TDO2)有關(guān)，某研究所采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除TDO2基因的部分外顯子，從而構(gòu)建TDO2基因敲除(TDO2－KO)純合模型小鼠(2n)，以期進(jìn)一步探究TDO2基因的調(diào)控作用，相關(guān)過程如圖2所示。
(1)為獲取TDO2－KO小鼠，研究者利用顯微注射技術(shù)將Cas9蛋白、sgRNA等混合液注入小鼠受精卵，其中sgRNA是以TDO2基因第______號(hào)外顯子的部分堿基序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，Cas9蛋白可催化________鍵水解。
(2)通過基因編輯及相關(guān)技術(shù)獲得4只小鼠，標(biāo)記為1～4號(hào)，1、2為雌鼠，3、4為雄鼠。利用PCR等技術(shù)檢測(cè)小鼠TDO2基因敲除情況。
①分別提取野生型和4只小鼠體細(xì)胞的________作為PCR模板，進(jìn)行PCR時(shí)應(yīng)選擇圖中引物__________，鑒定時(shí)才能區(qū)分各小鼠TDO2基因的敲除情況。
②PCR產(chǎn)物常采用________________(填技術(shù))鑒定，鑒定結(jié)果如圖3。據(jù)圖判斷，4號(hào)小鼠有____個(gè)TDO2基因被敲除，判斷依據(jù)是_____________________________________________
______________________________________________________________________________。
(3)利用已有小鼠設(shè)計(jì)雜交實(shí)驗(yàn)，選擇并獲得TDO2－KO純合小鼠，請(qǐng)寫出實(shí)驗(yàn)思路。
難點(diǎn)突破練75　基因工程的綜合考查（解析版）
一、選擇題
1．(2023·深圳市高級(jí)中學(xué)高三模擬)紅細(xì)胞生成素(EPO)是人體內(nèi)促進(jìn)紅細(xì)胞生成的一種糖蛋白，可用于治療腎衰性貧血等疾病。由于天然 EPO來源極為有限，某科研團(tuán)隊(duì)采用基因工程培育轉(zhuǎn)基因羊作為乳腺生物反應(yīng)器，使其能合成EPO。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)需將EPO基因插入乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子的上游
B．一般情況下，該轉(zhuǎn)基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺細(xì)胞中表達(dá)
C．可用顯微注射技術(shù)將含有EPO基因的表達(dá)載體導(dǎo)入羊的受精卵中
D．用PCR擴(kuò)增人EPO基因，需要一段已知的EPO基因核苷酸序列
答案　A
解析　啟動(dòng)子是一段具有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，故構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)需將EPO基因(目的基因)插入乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子的下游，A錯(cuò)誤。
2．為提高紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇的產(chǎn)量，研究人員構(gòu)建紫杉醇合成關(guān)鍵酶基因(Bapt)的超表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入紅豆杉細(xì)胞，具體流程如圖。下列相關(guān)說法不正確的是(　　)
A．p1301載體上應(yīng)含有增強(qiáng)Bapt基因表達(dá)的序列
B．超表達(dá)載體中應(yīng)含有潮霉素抗性基因作為標(biāo)記基因
C．可使用Bapt基因制成的探針檢測(cè)過程⑤是否成功
D．工廠化生產(chǎn)紫杉醇需將改造后的紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)至愈傷組織
答案　C
解析　超表達(dá)載體中應(yīng)含有潮霉素抗性基因作為標(biāo)記基因，在含有潮霉素的培養(yǎng)基上，超表達(dá)載體能夠存活，從而起到篩選作用，B正確；由于紅豆杉細(xì)胞中本身存在Bapt基因，無論超表達(dá)載體是否成功導(dǎo)入，都能與Bapt基因探針形成雜交分子，因此不能通過Bapt基因探針來檢測(cè)步驟⑤是否成功，C錯(cuò)誤；工廠化生產(chǎn)紫杉醇屬于細(xì)胞產(chǎn)物的獲得，只需要培養(yǎng)到愈傷組織階段即可，D正確。
3．(2023·通州高三三模)為增加油菜種子含油量，科研人員嘗試將酶D基因與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(引導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入葉綠體)基因連接(圖甲)，導(dǎo)入Ti質(zhì)粒(圖乙)，最終獲得轉(zhuǎn)基因油菜品種，下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．用Cla Ⅰ切割酶D基因和轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因，再利用DNA連接酶連接獲得目的基因
B．用Xba Ⅰ和Sac Ⅰ同時(shí)切割目的基因和載體片段，連接后獲得重組Ti質(zhì)粒
C．相對(duì)于將酶D基因插入受體細(xì)胞染色體DNA中，將其插入葉綠體DNA中可防止基因污染
D．轉(zhuǎn)基因油菜的酶D基因只表達(dá)于含葉綠體的細(xì)胞，并在葉綠體內(nèi)轉(zhuǎn)錄、翻譯
答案　D
解析　酶D基因和轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因上都有限制酶Cla Ⅰ切割位點(diǎn)，用Cla Ⅰ切割酶D基因和轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因，會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，再利用DNA連接酶連接獲得重組目的基因，A正確；獲得的重組目的基因上，含有Xba Ⅰ和Sac Ⅰ兩種限制酶的切割位點(diǎn)，結(jié)合圖乙，目的基因必須插在啟動(dòng)子和終止子之間，用Xba Ⅰ和Sac Ⅰ同時(shí)切割目的基因和載體片段，連接后可獲得重組Ti質(zhì)粒，B正確；葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽引導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入葉綠體，由于酶D基因與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因重組形成新的目的基因，轉(zhuǎn)基因油菜的酶D基因可以在其他細(xì)胞中表達(dá)，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽會(huì)引導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入葉綠體，D錯(cuò)誤。
4．(2024·錦州高三質(zhì)檢)實(shí)時(shí)熒光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸檢測(cè)，其原理：在PCR復(fù)性過程中探針和引物一起與模板結(jié)合，探針兩側(cè)分別帶有熒光基團(tuán)和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團(tuán)，新鏈延伸過程中，DNA聚合酶會(huì)破壞探針，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而發(fā)出熒光。利用RT－PCR進(jìn)行核酸檢測(cè)的相關(guān)過程如圖所示。下列說法不正確的是(　　)
A．做RT－PCR之前，需要先根據(jù)cDNA的核苷酸序列合成引物和探針
B．RNA不能作為PCR擴(kuò)增的模板，故需要將樣本中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA后再進(jìn)行擴(kuò)增
C．若檢測(cè)結(jié)果有強(qiáng)烈熒光信號(hào)發(fā)出，說明被檢測(cè)者沒有感染病毒
D．病毒的檢測(cè)還可以檢測(cè)病毒表面的物質(zhì)或病毒引發(fā)產(chǎn)生的抗體，其原理都是抗原—抗體雜交
答案　C
解析　PCR擴(kuò)增必須以DNA為模板，RNA不能作為PCR擴(kuò)增的模板，所以需要將樣本中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA后再進(jìn)行擴(kuò)增，B正確；若檢測(cè)結(jié)果有強(qiáng)烈熒光信號(hào)發(fā)出，說明被檢測(cè)者極有可能感染了病毒，C錯(cuò)誤。
5．研究表明，服用α—干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。人參是一種名貴藥材，具有較好的滋補(bǔ)作用。如圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細(xì)胞的流程，①～④表示相關(guān)的操作。若限制酶EcoRⅠ識(shí)別序列為G↓AATTC，BamHⅠ識(shí)別序列為G↓GATCC。下列選項(xiàng)不正確的是(　　)
A．步驟①中，利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，設(shè)計(jì)引物序列的主要依據(jù)是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列
B．在過程③中T—DNA 整合到受體細(xì)胞的染色體 DNA 上
C．科研人員在兩種引物的一端分別加上了 GAATTC 和 GGATCC 序列，目的是方便后續(xù)的剪切和連接
D．過程④中，科研人員最終未能檢測(cè)出干擾素基因，其原因可能是干擾素基因未能導(dǎo)入人參愈傷組織細(xì)胞
答案　B
解析　在過程③將重組質(zhì)粒導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌，而在侵染人參愈傷組織細(xì)胞時(shí)，T－DNA才被整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，B錯(cuò)誤；由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ兩種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，因此科研人員還在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后續(xù)的剪切和連接，C正確；干擾素基因未能導(dǎo)入人參愈傷組織細(xì)胞或?qū)肴藚⒂鷤M織細(xì)胞的干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄，都會(huì)導(dǎo)致通過該方法不能檢測(cè)出干擾素基因，D正確。
6．(2023·長沙高三二模)載體是基因工程中攜帶外源DNA片段(目的基因)進(jìn)入受體細(xì)胞的重要運(yùn)載工具，常見的載體類型主要有基因克隆載體和基因表達(dá)載體。如圖是利用細(xì)菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程示意圖，下列相關(guān)敘述正確的是(　　)
A．重組載體a、重組載體b分別是基因表達(dá)載體和基因克隆載體
B．載體a和載體b都必須含有限制酶切割位點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因
C．必須把目的基因插入重組載體a的啟動(dòng)子和終止子之間
D．培養(yǎng)細(xì)菌a和細(xì)菌b的培養(yǎng)基在營養(yǎng)成分和功能上沒有明顯差異
答案　B
解析　重組載體a導(dǎo)入受體菌后隨著受體菌的繁殖而擴(kuò)增，因此是基因克隆載體，而重組載體b導(dǎo)入受體菌后，表達(dá)產(chǎn)生胰島素，因此是基因表達(dá)載體，A錯(cuò)誤；培養(yǎng)細(xì)菌a的目的是擴(kuò)增目的基因，不需要獲得表達(dá)產(chǎn)物，因此目的基因不一定要插入重組載體a的啟動(dòng)子和終止子之間，C錯(cuò)誤；培養(yǎng)細(xì)菌a的目的是擴(kuò)增目的基因，培養(yǎng)細(xì)菌b的目的是獲得胰島素，因此培養(yǎng)兩者的培養(yǎng)基在營養(yǎng)成分和功能上有明顯差異，D錯(cuò)誤。
7．(2024·成都高三檢測(cè))研究人員利用綠色熒光蛋白基因(sGFP)轉(zhuǎn)染大麗輪枝菌，培育表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因菌株，主要過程如圖所示(圖中a鏈和b鏈分別是相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈)。下列說法正確的是(　　)
A．利用PCR擴(kuò)增sGFP時(shí)需解旋酶打開DNA雙鏈，b鏈的黏性末端堿基序列(5′→3′)為AGCT
B．應(yīng)將目的基因插入到復(fù)制原點(diǎn)，以保證sGFP基因可以在大麗輪枝菌細(xì)胞中表達(dá)
C．先將目的基因?qū)朕r(nóng)桿菌，再將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌放置于含有潮霉素的培養(yǎng)基上，篩選出含有目的基因的農(nóng)桿菌
D．最終通過抗原－抗體雜交技術(shù)檢測(cè)綠色熒光以篩選出綠色熒光蛋白旺盛表達(dá)的大麗輪枝菌
答案　C
解析　利用PCR擴(kuò)增sGFP時(shí)，高溫可將DNA雙鏈打開，A錯(cuò)誤；啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，終止子是使轉(zhuǎn)錄終止的序列，而目的基因不攜帶啟動(dòng)子和終止子，所以將sGFP插入到構(gòu)巢曲霉啟動(dòng)子和終止子之間的目的是保證sGFP能在大麗輪枝菌細(xì)胞中表達(dá)，B錯(cuò)誤；轉(zhuǎn)基因成功的標(biāo)志是形成目的基因的產(chǎn)物，最終可通過檢測(cè)大麗輪枝菌菌絲細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度，篩選出綠色熒光蛋白旺盛表達(dá)的大麗輪枝菌，綠色熒光可以直接觀察到，不需通過抗原－抗體雜交技術(shù)檢測(cè)，D錯(cuò)誤。
8．(2023·韶關(guān)高三聯(lián)考)真菌AFPs基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能提高細(xì)胞的抗凍能力，將AFPs基因?qū)敕阎信嘤箖龇哑贩N，延長番茄果實(shí)的儲(chǔ)存期。AFPs基因及基因表達(dá)載體的元件組成情況如圖所示，圖中的EcoR Ⅰ、HindⅢ、BamHⅠ、SmaⅠ均表示限制性內(nèi)切核酸酶，相關(guān)酶的切割位點(diǎn)分布如圖所示，基因經(jīng)所有酶切割后均會(huì)產(chǎn)生不同的黏性末端。下列分析正確的是(　　)
A．用限制性內(nèi)切核酸酶可從真菌細(xì)胞內(nèi)獲取大量的AFPs基因
B．構(gòu)建基因表達(dá)載體宜選擇BamHⅠ、HindⅢ與E.coli DNA連接酶
C．需用顯微注射技術(shù)將重組質(zhì)粒注入番茄胚細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)基因植株
D．含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上正常生長
答案　B
解析　要得到大量的AFPs基因需要利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，A錯(cuò)誤；為了不破壞目的基因，且避免由一種酶切割產(chǎn)生的黏性末端自行結(jié)合，宜選用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行切割，E.coli DNA連接酶可以連接黏性末端，B正確；將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，C錯(cuò)誤；目的基因?qū)牒髸?huì)破壞潮霉素抗性基因，四環(huán)素抗性基因作為標(biāo)記基因，含有AFPs基因的受體細(xì)胞能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上正常生長，D錯(cuò)誤。
9．如圖為質(zhì)粒pUC18，為生產(chǎn)出滿足需求的質(zhì)粒載體，利用定點(diǎn)誘變技術(shù)，通過設(shè)計(jì)具有誘變位點(diǎn)的引物P1和引物P2進(jìn)行PCR，來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)載體的單堿基突變，目的是使質(zhì)粒pUC18不能被限制酶Eam1105Ⅰ識(shí)別，但依然具有氨芐青霉素抗性。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．誘變位點(diǎn)位于限制酶Eam1105Ⅰ識(shí)別序列中
B．PCR反應(yīng)體系由P1、P2兩種引物、脫氧核苷酸、TaqDNA聚合酶及含Mg2＋的緩沖液組成
C．誘變成功的質(zhì)粒依然具有氨芐青霉素抗性，利用了密碼子具有簡并性的原理
D．誘變成功的質(zhì)粒pUC18經(jīng)過EcoRⅠ、Eam1105Ⅰ雙酶切后進(jìn)行電泳，只能產(chǎn)生1條條帶
答案　B
解析　PCR反應(yīng)體系除有P1、P2兩種引物、脫氧核苷酸、TaqDNA聚合酶及含Mg2＋的緩沖液之外，還需要有模板DNA，B錯(cuò)誤；誘變成功的質(zhì)粒pUC18只有限制酶EcoR Ⅰ的識(shí)別序列，沒有限制酶Eam1105 Ⅰ的識(shí)別序列，因此經(jīng)過EcoR Ⅰ、Eam1105 Ⅰ雙酶切后進(jìn)行電泳，只能產(chǎn)生1條條帶，D正確。
10．(2024·丹東第二中學(xué)高三期末)為提高大豆對(duì)磷元素的吸收能力，研究人員利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將水稻的耐低磷基因OsPTF轉(zhuǎn)移到大豆植株中，如圖為重組Ti質(zhì)粒上T－DNA的序列結(jié)構(gòu)示意圖。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．以水稻RNA為模板通過逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增可獲得大量OsPTF基因
B．RNA聚合酶與啟動(dòng)子1識(shí)別并結(jié)合后，啟動(dòng)抗除草劑基因的轉(zhuǎn)錄
C．可通過含除草劑的選擇培養(yǎng)基篩選含有目的基因的大豆愈傷組織
D．用EcoRⅠ、BamHⅠ酶同時(shí)切割重組Ti質(zhì)粒后，經(jīng)電泳分離至少得到兩個(gè)不同長度的條帶
答案　B
解析　啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，用于驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，抗除草劑基因位于啟動(dòng)子2的后面，故RNA聚合酶與啟動(dòng)子2識(shí)別并結(jié)合后，啟動(dòng)抗除草劑基因的轉(zhuǎn)錄，B錯(cuò)誤；由于圖中T－DNA的序列中含有目的基因和抗除草劑基因，故可通過含除草劑的選擇培養(yǎng)基篩選含有目的基因的大豆愈傷組織，C正確。
二、非選擇題
11．(2024·珠海實(shí)驗(yàn)中學(xué)高三月考)土壤鹽漬化影響水稻生長發(fā)育?？蒲腥藛T將水稻耐鹽堿基因OsMYB56導(dǎo)入不耐鹽堿水稻品種吉粳88中，培育出了耐鹽堿水稻新品種。其操作流程及可能用到的限制酶如圖所示，圖中Bar為抗除草劑基因，AmpR為氨芐青霉素抗性基因，TetR為四環(huán)素抗性基因。請(qǐng)分析回答：
限制酶 識(shí)別序列和切割位點(diǎn)
Sac Ⅰ －GAGCT↓C－
Sma Ⅰ －CCC↓GGG－
BamH Ⅰ －G↓GATCC－
Bcl Ⅰ －T↓GATCA－
(1)過程①利用PCR技術(shù)擴(kuò)增并改造OsMYB56基因需要添加引物，為了構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)用相同限制酶切割后的質(zhì)粒和OsMYB56基因能正確連接，應(yīng)選用的引物組合為______________。
A．5′－CCCGGG…－3′和5′－GGATCC…－3′
B．5′－GAGCTC…－3′和5′－GGATCC…－3′
C．5′－GAGCTC…－3′和5′－TGATCA…－3′
D．5′－CCCGGG…－3′和5′－TGATCA…－3′
(2)根據(jù)基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)組成分析，Ti質(zhì)粒中的CaMV 53S是__________。
(3)為篩選出含重組T－DNA的水稻愈傷組織細(xì)胞，應(yīng)在添加__________的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。誘導(dǎo)水稻愈傷組織細(xì)胞再分化發(fā)育成植株的培養(yǎng)過程中，__________(填“需要”或“不需要”)給予光照。
(4)為確定轉(zhuǎn)基因耐鹽堿水稻是否培育成功，可用________________方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽堿性。經(jīng)檢測(cè)，科研人員發(fā)現(xiàn)部分獲得耐鹽堿基因OsMYB56的水稻幼苗不具有耐鹽堿能力，原因可能是_________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
答案　(1)B　(2)啟動(dòng)子　(3)除草劑　需要　(4)一定濃度的鹽水澆灌　雖然獲得了相應(yīng)的基因，但耐鹽基因OsMYB56轉(zhuǎn)錄或翻譯異常(或耐鹽基因OsMYB56表達(dá)異常)
解析　(1)在進(jìn)行PCR操作時(shí)，引物應(yīng)分別與基因兩條鏈的3′端結(jié)合，根據(jù)圖中序列，應(yīng)選用的引物組合為5′－GAGCTC…－3′和5′－GGATCC…－3′，B符合題意。(2)根據(jù)基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)組成分析，在目的基因的上游要有啟動(dòng)子，下游要有終止子，因此CaMV 53S是啟動(dòng)子。(3)目的基因和質(zhì)粒連接后，T－DNA上只保留了抗除草劑基因，為了篩選出含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞，應(yīng)在添加除草劑的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。誘導(dǎo)水稻愈傷組織細(xì)胞再分化發(fā)育成植株的培養(yǎng)過程中，需要給予光照。
12．(2024·黃岡高三統(tǒng)考)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的原理如下：一條單鏈向?qū)NA(sgRNA)引導(dǎo)核酸酶Cas9到一個(gè)特定的基因位點(diǎn)進(jìn)行切割，如圖1所示。研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的發(fā)生與TDO2基因編碼的色氨酸2,3－雙加氧酶(TDO2)有關(guān)，某研究所采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除TDO2基因的部分外顯子，從而構(gòu)建TDO2基因敲除(TDO2－KO)純合模型小鼠(2n)，以期進(jìn)一步探究TDO2基因的調(diào)控作用，相關(guān)過程如圖2所示。
(1)為獲取TDO2－KO小鼠，研究者利用顯微注射技術(shù)將Cas9蛋白、sgRNA等混合液注入小鼠受精卵，其中sgRNA是以TDO2基因第______號(hào)外顯子的部分堿基序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，Cas9蛋白可催化________鍵水解。
(2)通過基因編輯及相關(guān)技術(shù)獲得4只小鼠，標(biāo)記為1～4號(hào)，1、2為雌鼠，3、4為雄鼠。利用PCR等技術(shù)檢測(cè)小鼠TDO2基因敲除情況。
①分別提取野生型和4只小鼠體細(xì)胞的________作為PCR模板，進(jìn)行PCR時(shí)應(yīng)選擇圖中引物__________，鑒定時(shí)才能區(qū)分各小鼠TDO2基因的敲除情況。
②PCR產(chǎn)物常采用________________(填技術(shù))鑒定，鑒定結(jié)果如圖3。據(jù)圖判斷，4號(hào)小鼠有____個(gè)TDO2基因被敲除，判斷依據(jù)是_____________________________________________
______________________________________________________________________________。
(3)利用已有小鼠設(shè)計(jì)雜交實(shí)驗(yàn)，選擇并獲得TDO2－KO純合小鼠，請(qǐng)寫出實(shí)驗(yàn)思路。
答案　(1)3、7　磷酸二酯　(2)①基因組DNA　1和8?、诃傊悄z電泳　1　4號(hào)小鼠有2個(gè)電泳條帶，有1個(gè)條帶與野生型小鼠不同，說明有1個(gè)TDO2基因被敲除　(3)將1號(hào)和4號(hào)小鼠雜交得子代，通過PCR及電泳對(duì)子代進(jìn)行鑒定，選出TDO2－KO純合小鼠
解析　(1)為獲取TDO2－KO小鼠，研究者利用顯微注射技術(shù)將Cas9蛋白、sgRNA等混合液注入小鼠受精卵，據(jù)圖可知，其中sgRNA是以TDO2基因第3、7號(hào)外顯子的部分堿基序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。(2)利用PCR等技術(shù)檢測(cè)小鼠TDO2基因敲除情況，需分別提取野生型(作為對(duì)照)和4只小鼠體細(xì)胞的基因組DNA作為PCR模板；據(jù)圖可知，基因敲除位點(diǎn)是圖2中引物2、3、6、7結(jié)合的區(qū)域，不能選用，而引物1和8分別與TDO2基因兩條鏈的3′端結(jié)合，PCR擴(kuò)增時(shí)，分別在引物1和8的3′端延伸，可獲得TDO2基因，基因敲除成功的小鼠擴(kuò)增得到的片段較野生型(基因未敲除)小鼠的短，故進(jìn)行PCR時(shí)應(yīng)選擇圖中引物1和8，鑒定時(shí)才能區(qū)分各小鼠TDO2基因的敲除情況；PCR產(chǎn)物常采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定；據(jù)圖判斷，4號(hào)小鼠有1個(gè)TDO2基因被敲除，因?yàn)?號(hào)小鼠有2個(gè)電泳條帶，有1個(gè)條帶與野生型小鼠不同，說明有1個(gè)TDO2基因被敲除，而有1個(gè)條帶與野生型小鼠相同，說明這個(gè)TDO2基因未被敲除。(3)1號(hào)和4號(hào)均有1個(gè)TDO2基因被敲除，1個(gè)TDO2基因未被敲除，可認(rèn)為是雜合子，1號(hào)為雌鼠，4號(hào)為雄鼠，故可選擇1號(hào)和4號(hào)進(jìn)行雜交，再通過PCR及電泳對(duì)子代進(jìn)行鑒定，選出僅含圖3中1號(hào)或4號(hào)與野生型小鼠不同的條帶所對(duì)應(yīng)的小鼠，即TDO2－KO純合小鼠。

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