資源簡(jiǎn)介

第10單元　生物技術(shù)與工程
第5課　基因工程
[復(fù)習(xí)目標(biāo)]　1.基因結(jié)構(gòu)決定其功能；掌握目的基因的篩選與獲取方法；理解蛋白質(zhì)工程的原理。(生命觀念)　2.建立基因工程的操作流程模型，掌握目的基因的檢測(cè)與鑒定方法。(科學(xué)思維)　3.基因工程和蛋白質(zhì)工程在生產(chǎn)實(shí)踐上的應(yīng)用。(社會(huì)責(zé)任)　4.探究基因工程在生產(chǎn)上的應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用，掌握DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定的方法。(科學(xué)探究)
考點(diǎn)一　重組DNA技術(shù)的基本工具
1．基因工程的概念
2．基因工程的基本工具
[教材深挖]
(選擇性必修3 P74拓展應(yīng)用1)限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子是因?yàn)楹心撤N限制酶的細(xì)胞的DNA分子不具備這種限制酶的識(shí)別序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。
(2)DNA連接酶——“分子縫合針”
種類(lèi) E.coli DNA連接酶 T4 DNA連接酶
來(lái)源 大腸桿菌 T4噬菌體
特點(diǎn) 只縫合黏性末端 縫合黏性末端和平末端
作用 恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，并連接兩個(gè)DNA片段
(3)基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”
[教材深挖]
(選擇性必修3 P72正文，拓展)天然質(zhì)粒是否可以直接用作基因工程載體？為什么？
提示：不可以。具有能自我復(fù)制、有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因及對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害等特點(diǎn)的質(zhì)粒才可以直接用作基因工程的載體。實(shí)際上天然質(zhì)粒一般不完全具備上述條件，往往需要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。
[易錯(cuò)辨析]
1．重組DNA技術(shù)所需要的工具酶有限制酶、DNA連接酶和載體。(×)
2．切割質(zhì)粒的限制性?xún)?nèi)切核酸酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列。(×)
3．DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事。(×)
4．DNA連接酶可以連接目的基因與載體的氫鍵，形成重組DNA。(×)
5．載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選的標(biāo)記基因。(×)
1．基因工程的理論基礎(chǔ)
2．與DNA有關(guān)的幾種酶的比較
命題點(diǎn)1　圍繞基因工程所需工具酶考查科學(xué)思維
1．(2023·泰安模擬)限制酶的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割和功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。限制酶Sau3A Ⅰ、EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)分別為。含某目的基因的DNA片段如圖所示，若利用質(zhì)粒A(含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)各1個(gè))構(gòu)建基因表達(dá)載體，為克服目的基因和質(zhì)粒A的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒的任意連接等，應(yīng)該如何選擇限制酶(　　)
A．用限制酶EcoRⅠ或BamHⅠ處理含某目的基因的DNA和質(zhì)粒A
B．用限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ處理含某目的基因的DNA和質(zhì)粒A
C．用限制酶Sau3AⅠ和EcoRⅠ處理含某目的基因的DNA和質(zhì)粒A
D．用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ處理含某目的基因的DNA和質(zhì)粒A
解析：選D。限制酶Sau3AⅠ切割目的基因會(huì)破壞目的基因，質(zhì)粒含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，獲取目的基因也可以用限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ進(jìn)行切割，但為了防止目的基因或質(zhì)粒自身環(huán)化，需要使用不同種限制酶進(jìn)行切割，則可以使用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ去切割質(zhì)粒，也可以用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ去切割目的基因，則獲得的重組質(zhì)粒會(huì)進(jìn)行正常連接。
2．下列是基因工程的有關(guān)問(wèn)題，請(qǐng)回答：
(1)限制性?xún)?nèi)切核酸酶可以識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的______________(填化學(xué)鍵名稱(chēng))斷開(kāi)，形成的末端總體可分為兩種類(lèi)型，分別是__________________。
(2)目的基因和載體重組時(shí)需要的工具酶是______________，和限制性?xún)?nèi)切核酸酶相比，它對(duì)所重組的DNA兩端堿基序列________________(填“有”或“無(wú)”)專(zhuān)一性要求。
(3)如圖表示構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)的某種質(zhì)粒與目的基因。已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)是，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)是。分析可知，最好選擇限制酶____________切割質(zhì)粒，限制酶__________切割目的基因所在的DNA，這樣做的好處分別是___________。
解析：(1)限制性?xún)?nèi)切核酸酶(限制酶)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)，經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式，分別為黏性末端和平末端。(2)目的基因和載體重組時(shí)需要DNA連接酶恢復(fù)兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。多種限制酶切割，形成不同的切割位點(diǎn)，所用的DNA連接酶對(duì)所連接的DNA兩端堿基序列無(wú)專(zhuān)一性要求。(3)由題干及圖示可知，限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)是，限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒不會(huì)把兩個(gè)標(biāo)記基因都破壞，最好選擇限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒。限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)是，目的基因兩端均有限制酶Ⅱ的識(shí)別序列，因此用限制酶Ⅱ切割目的基因所在的DNA。
答案：(1)磷酸二酯鍵　黏性末端和平末端 (2)DNA連接酶　無(wú)　(3)Ⅰ　Ⅱ　限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒不會(huì)把兩個(gè)標(biāo)記基因都破壞　目的基因兩端均有限制酶Ⅱ的識(shí)別序列
[技法提煉]　限制酶的選擇技巧
甲　　　　　　　　乙
(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)
①應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。
②不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。
③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。
(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)
命題點(diǎn)2　圍繞載體的作用及特點(diǎn)考查科學(xué)思維
3．(2022·章丘區(qū)模擬)如圖為某種質(zhì)粒的簡(jiǎn)圖，小箭頭所指分別為限制性?xún)?nèi)切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，P為轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)部位。已知目的基因的兩端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，受體細(xì)胞為無(wú)任何抗藥性的原核細(xì)胞。下列有關(guān)敘述正確的是(　　)
A．將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用EcoRⅠ酶切，在DNA連接酶作用下，生成的由兩個(gè)DNA片段連接形成的產(chǎn)物有兩種
B．DNA連接酶的作用是將酶切后得到的黏性末端連接起來(lái)，形成一個(gè)重組質(zhì)粒時(shí)形成兩個(gè)磷酸二酯鍵
C．為了防止目的基因反向連接和質(zhì)粒自身環(huán)化，酶切時(shí)可選用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
D．能在含青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的受體細(xì)胞中已成功導(dǎo)入該目的基因
解析：選C。根據(jù)題意可知，目的基因的兩端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，將含有目的基因的DNA用EcoRⅠ酶切，會(huì)得到目的基因片段；根據(jù)質(zhì)粒的簡(jiǎn)圖可知，將質(zhì)粒用EcoRⅠ酶切，會(huì)得到與質(zhì)粒周長(zhǎng)等長(zhǎng)的鏈狀DNA；因此將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用EcoRⅠ酶切，在DNA連接酶作用下，可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—質(zhì)粒片段、質(zhì)粒—質(zhì)粒片段三種產(chǎn)物，A錯(cuò)誤。DNA連接酶的作用是將酶切后得到的黏性末端連接起來(lái)形成一個(gè)重組質(zhì)粒，該過(guò)程形成四個(gè)磷酸二酯鍵，B錯(cuò)誤。EcoRⅠ和BamHⅠ的識(shí)別序列不同，獲取目的基因和切割質(zhì)粒時(shí)，同時(shí)選用EcoRⅠ和BamHⅠ切割，目的基因兩端形成的末端不同，切割后的質(zhì)粒兩端形成的末端不同，再用DNA連接酶連接，可以防止目的基因反向連接和質(zhì)粒自身環(huán)化，C正確；導(dǎo)入普通質(zhì)粒的大腸桿菌和導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌都能在含青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因此能在含青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的受體細(xì)胞不一定含有目的基因，D錯(cuò)誤。
4.(經(jīng)典高考題)某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問(wèn)題：
(1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有____________(答出兩點(diǎn)即可)，而作為基因表達(dá)載體，除滿(mǎn)足上述基本條件外，還需具有啟動(dòng)子和終止子。
(2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是___________；并且__________和__________的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是____________。
在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有__________________的固體培養(yǎng)基。
(3)基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復(fù)制所需的原料來(lái)自_________________________________________________。
解析：(1)質(zhì)粒作為載體，應(yīng)具備的基本條件有：有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受體細(xì)胞中能自我復(fù)制，或能整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進(jìn)行同步復(fù)制；有特殊的標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇等。(2)在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素進(jìn)行篩選，其中未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌，因不含氨芐青霉素抗性基因而都不能在此培養(yǎng)基上存活，二者不能區(qū)分。含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌中都含有氨芐青霉素抗性基因，都能在此培養(yǎng)基上存活，二者也不能區(qū)分。若要將含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)一步篩選出來(lái)，還需要使用含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基。(3)某些噬菌體經(jīng)改造后作為載體，導(dǎo)入受體細(xì)胞后，其DNA復(fù)制所需的原料來(lái)自受體細(xì)胞。
答案：(1)能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因(答出兩點(diǎn)即可)　(2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)　含有質(zhì)粒載體　含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒(或答含有重組質(zhì)粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)　四環(huán)素　(3)受體細(xì)胞
考點(diǎn)二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的篩選與獲取
(1)篩選合適的目的基因
①目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。
②篩選目的基因的方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。
(2)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
①原理：DNA半保留復(fù)制。
②條件：DNA模板、2種引物、耐高溫的DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸。
③擴(kuò)增過(guò)程
(3)通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)獲取目的基因。
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(選擇性必修3 P77正文，拓展)利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，為什么要用2種不同的引物？
提示：DNA是兩條反向平行的雙鏈結(jié)構(gòu)，而復(fù)制時(shí)只能從固定的方向(模板鏈的3′端)開(kāi)始，所以引物的堿基序列是不同的。
2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建
(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的
①使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。
②使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
(2)基因表達(dá)載體的組成
(3)基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程
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(選擇性必修3 P80正文，拓展)為什么切割含有目的基因的DNA片段和載體要選用同一種限制酶？是否只能用同一種限制酶？
提示：選用同一種限制酶切割會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，可以在DNA連接酶的作用下將切割的目的基因和載體連接起來(lái)。也可以使用能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割。
3．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
類(lèi)型 方法 過(guò)程 優(yōu)點(diǎn)
植物細(xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 將目的基因插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T－DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→用農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞→將目的基因整合到植物細(xì)胞的染色體DNA上→目的基因表達(dá) 經(jīng)濟(jì)、有效，適用于雙子葉植物和裸子植物，尤其適用于雙子葉植物，但單子葉植物也獲得了成功
花粉管通道法 用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊 簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法
動(dòng)物細(xì)胞 顯微注射技術(shù) 將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→注射了目的基因的受精卵，經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)后，移植到雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)→獲得具有新性狀的動(dòng)物 將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最為有效的方法
微生物細(xì)胞 Ca2＋處理法 Ca2＋處理細(xì)胞→細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達(dá)載體導(dǎo)入 簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效
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(選擇性必修3 P81資料卡)在用土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的過(guò)程中，為什么一定要將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T－DNA上？
提示：Ti質(zhì)粒上的T－DNA也稱(chēng)為可轉(zhuǎn)移的DNA，可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上。
4．目的基因的檢測(cè)與鑒定
檢測(cè)水平 檢測(cè)目的 檢測(cè)方法
分子水平 目的基因是否插入到轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上 PCR
目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA
目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì) 抗原—抗體雜交
個(gè)體生物學(xué)水平 轉(zhuǎn)基因生物是否表現(xiàn)出相應(yīng)的特性 如抗蟲(chóng)、抗病的接種實(shí)驗(yàn)
[易錯(cuò)辨析]
1．目的基因就是指編碼蛋白質(zhì)的基因。(×)
2．用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不必知道基因的全部序列。(√)
3．基因工程的核心步驟是目的基因的獲取。(×)
4．基因表達(dá)載體中含有啟動(dòng)子和密碼子。(×)
5．抗蟲(chóng)基因即使成功地插入植物細(xì)胞染色體DNA上也未必能正常表達(dá)。(√)
6．從大腸桿菌細(xì)胞中獲得人胰島素基因的mRNA，說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)。(×)
1．圖解PCR的擴(kuò)增過(guò)程
(1)在PCR過(guò)程中實(shí)際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。
(2)引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，也需要引物，一般為RNA片段。
(3)真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。
(4)PCR的擴(kuò)增結(jié)果：DNA分子以指數(shù)形式擴(kuò)增(約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)次數(shù))。
提醒：(1)PCR中的復(fù)性不一定均為引物與DNA模板結(jié)合。復(fù)性時(shí)，引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，也存在DNA解開(kāi)的兩條鏈的結(jié)合。
(2)PCR反應(yīng)的結(jié)果不都是所需的DNA片段。因?yàn)榈谝淮窝h(huán)得到的DNA片段只有一種引物，比所需的DNA片段要長(zhǎng)，從第三次循環(huán)才出現(xiàn)所需的DNA片段，這樣的片段存在兩種引物。
2．篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞
(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時(shí)，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會(huì)導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。
(2)被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌。
(3)篩選方法：將細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長(zhǎng)的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)粒的細(xì)菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長(zhǎng)的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。
命題點(diǎn)1　圍繞PCR技術(shù)考查生命觀念及科學(xué)探究
1．(2022·綏中縣模擬)農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T－DNA可以轉(zhuǎn)移并隨機(jī)插入到被侵染植物的染色體DNA中。研究者將圖中被侵染植物的DNA片段連接成環(huán)，并以此環(huán)為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出T－DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，以此可確定T－DNA插入的具體位置。下列說(shuō)法不正確的是(　　)
注：子鏈從引物的3′端開(kāi)始延伸。
A．PCR擴(kuò)增依據(jù)的是DNA分子雙鏈復(fù)制的原理
B．進(jìn)行PCR擴(kuò)增需要耐高溫的DNA聚合酶
C．利用圖中的引物②、③組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列
D．通過(guò)與受體細(xì)胞的基因組序列比對(duì)，可確定T－DNA的插入位置
解析：選C。PCR擴(kuò)增依據(jù)的是DNA分子雙鏈復(fù)制的原理，是體外擴(kuò)增DNA的一種方式，A正確；PCR技術(shù)需要在高溫條件下進(jìn)行變性，故進(jìn)行PCR擴(kuò)增需要耐高溫的DNA聚合酶，B正確；由于DNA的兩條鏈反向平行，且子鏈從引物的3′端開(kāi)始延伸，故利用圖中的引物①、④組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列，C錯(cuò)誤；通過(guò)與受體細(xì)胞的基因組序列比對(duì)，可確定T－DNA的插入位置，D正確。
2．(2022·石家莊模擬)錦鯉皰疹病毒是一種雙鏈DNA病毒。如圖為T(mén)aqMan熒光探針技術(shù)的原理示意圖，探針完整時(shí)，報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅熒光基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)該探針被Taq酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增1個(gè)DNA分子，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。下列有關(guān)敘述不正確的是(　　)
A．在基因工程中，目前獲取目的基因的常用方法有從基因文庫(kù)中獲取、PCR技術(shù)擴(kuò)增等
B．引物的化學(xué)本質(zhì)是DNA單鏈
C．引物中的GC含量比探針中的略高，這有利于保證復(fù)性時(shí)引物先與模板DNA結(jié)合
D．若最初該反應(yīng)體系中只有一個(gè)病毒DNA分子，經(jīng)n次循環(huán)后，需要消耗TaqMan熒光探針2n－1個(gè)
解析：選C。在基因工程中，目前獲取目的基因的常用方法有從基因文庫(kù)中獲取、PCR技術(shù)擴(kuò)增、利用化學(xué)方法人工合成等，A正確；引物是根據(jù)目的基因合成的，一般是一段短的DNA單鏈，B正確；GC之間形成3個(gè)氫鍵，GC含量高的DNA更穩(wěn)定，更難變性，但是對(duì)復(fù)性過(guò)程影響不大，C錯(cuò)誤；由于每擴(kuò)增1個(gè)DNA分子，就有一個(gè)熒光分子形成，經(jīng)n次循環(huán)后共有2n個(gè)DNA，跟初始相比，新增2n－1個(gè)DNA，所以需要TaqMan熒光探針2n－1個(gè)，D正確。
命題點(diǎn)2　圍繞基因工程的基本操作程序考查科學(xué)思維及社會(huì)責(zé)任
3．下列關(guān)于目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的敘述，不正確的是(　　)
A．花粉管通道法的操作之一是用微量注射器將含有目的基因的溶液直接注入子房中
B．顯微注射是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中采用最多的方法
C．大腸桿菌最常用的轉(zhuǎn)化方法是：用鈣離子處理細(xì)胞，使細(xì)胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變
D．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法
解析：選D。花粉管通道法的操作之一是用微量注射器將含有目的基因的溶液直接注入子房中，A正確；目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用的方法是顯微注射，B正確；大腸桿菌細(xì)胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是用鈣離子處理細(xì)胞，使細(xì)胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變，從而完成轉(zhuǎn)化過(guò)程，C正確；我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的方法是花粉管通道法，D錯(cuò)誤。
4．(2022·全國(guó)乙卷)新冠疫情出現(xiàn)后，病毒核酸檢測(cè)和疫苗接種在疫情防控中發(fā)揮了重要作用。回答下列問(wèn)題：
(1)新冠病毒是一種RNA病毒，檢測(cè)新冠病毒RNA(核酸檢測(cè))可以采用RT-PCR法。這種方法的基本原理是先以病毒RNA為模板合成cDNA，這一過(guò)程需要的酶是________，再通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增相應(yīng)的DNA片段。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷被檢測(cè)者是否感染新冠病毒。
(2)為了確保新冠病毒核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性，在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)必須依據(jù)新冠病毒RNA中的________________來(lái)進(jìn)行。PCR過(guò)程每次循環(huán)分為3步，其中溫度最低的一步是_____________________________。
(3)某人同時(shí)進(jìn)行了新冠病毒核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)(檢測(cè)體內(nèi)是否有新冠病毒抗體)，若核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性而抗體檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明__________(答出1種情況即可)；若核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明___________________。
(4)常見(jiàn)的病毒疫苗有滅活疫苗、蛋白疫苗和重組疫苗等。已知某種病毒的特異性蛋白S(具有抗原性)的編碼序列(目的基因)。為了制備蛋白疫苗，可以通過(guò)基因工程技術(shù)獲得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是________________。
解析：(1)以RNA為模板合成cDNA的過(guò)程需要逆轉(zhuǎn)錄酶起催化作用。(2)在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，為了確保新冠病毒核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性，應(yīng)依據(jù)新冠病毒RNA中一段特有的核苷酸序列來(lái)進(jìn)行。PCR過(guò)程每次循環(huán)分為3步，變性(溫度為90 ℃以上)、復(fù)性(溫度為50 ℃左右)、延伸(溫度為72 ℃左右)，故其中溫度最低的一步是復(fù)性。(3)在對(duì)某人同時(shí)進(jìn)行核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)時(shí)，若核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性而抗體檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明該人近期可能感染過(guò)新冠病毒，經(jīng)自身免疫系統(tǒng)的作用，體內(nèi)病毒被消滅，但體內(nèi)產(chǎn)生的抗體尚未消失。若核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明該人感染了新冠病毒，且機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了相應(yīng)抗體，但還未將病毒完全消滅。(4)基因工程的基本流程是：目的基因的獲取→基因表達(dá)載體的構(gòu)建→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定。
答案：(1)逆轉(zhuǎn)錄酶　(2)一段特有的核苷酸序列　復(fù)性　(3)該人近期可能感染過(guò)新冠病毒，經(jīng)自身免疫系統(tǒng)的作用，體內(nèi)病毒被消滅，但體內(nèi)產(chǎn)生的抗體尚未消失　該人感染了新冠病毒，且機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了相應(yīng)抗體，但還未將病毒完全消滅　(4)目的基因的獲取→基因表達(dá)載體的構(gòu)建→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定
考點(diǎn)三　基因工程的應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程
1．基因工程的應(yīng)用
[教材深挖]
(選擇性必修3 P91正文)利用基因工程技術(shù)對(duì)豬的器官進(jìn)行改造，采用的方法是在器官供體的基因組中導(dǎo)入某種調(diào)節(jié)因子，以抑制抗原決定基因的表達(dá)，或設(shè)法除去抗原決定基因，然后再結(jié)合克隆技術(shù)，培育出不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官。
2．蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用
(1)蛋白質(zhì)工程的概念
(2)蛋白質(zhì)工程的基本原理
(3)蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用
①醫(yī)藥工業(yè)方面：研發(fā)藥物，如延長(zhǎng)干擾素的保存時(shí)間；降低小鼠單克隆抗體誘發(fā)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。
②其他工業(yè)方面：改進(jìn)酶的性能或開(kāi)發(fā)新的工業(yè)用酶。
③農(nóng)業(yè)方面：通過(guò)改造某些參與調(diào)控光合作用的酶，增加糧食產(chǎn)量；改造微生物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)優(yōu)良微生物農(nóng)藥，防治病蟲(chóng)害。
[教材深挖]
(選擇性必修3 P94思考·討論，節(jié)選)確定目的基因的堿基序列后，怎樣才能合成或改造目的基因？
提示：確定目的基因的堿基序列后，可以人工合成目的基因或從基因文庫(kù)中獲取目的基因。對(duì)基因的改造經(jīng)常會(huì)用到基因定點(diǎn)突變技術(shù)來(lái)進(jìn)行堿基的替換、增添等。
[易錯(cuò)辨析]
1．來(lái)自蘇云金桿菌的Bt抗蟲(chóng)蛋白基因只能應(yīng)用于棉花。(×)
2．“轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物”也可以用于抵抗各種植物疾病。(×)
3．干擾素是我國(guó)批準(zhǔn)生產(chǎn)的第一個(gè)基因工程藥物。(√)
4．用基因工程的方法，使得外源基因得到高效表達(dá)的菌類(lèi)一般稱(chēng)為基因工程菌。(√)
5．對(duì)蛋白質(zhì)的改造是通過(guò)直接改造相應(yīng)的mRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)的。(×)
1．乳腺生物反應(yīng)器與工程菌生產(chǎn)藥物的區(qū)別
比較內(nèi)容 乳腺生物反應(yīng)器 工程菌
含義 指讓外源基因在哺乳動(dòng)物的乳腺中特異表達(dá)，利用動(dòng)物的乳腺組織生產(chǎn)藥物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達(dá)的菌類(lèi)
基因表達(dá) 合成的藥物蛋白與天然蛋白質(zhì)相同 細(xì)菌合成的藥物蛋白可能沒(méi)有活性
受體細(xì)胞 動(dòng)物受精卵 微生物細(xì)胞
目的基因?qū)敕绞?顯微注射法 Ca2＋處理法
生產(chǎn)條件 不需嚴(yán)格滅菌；溫度等外界條件對(duì)其影響不大 需嚴(yán)格滅菌，嚴(yán)格控制工程菌所需的溫度、pH、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度等外界條件
藥物提取 從動(dòng)物乳汁中提取 從微生物細(xì)胞或其培養(yǎng)液中提取
2．蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別和聯(lián)系
命題點(diǎn)1　圍繞基因工程的應(yīng)用考查科學(xué)思維及社會(huì)責(zé)任
1．(2022·山東卷)某種類(lèi)型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解，藥物A可通過(guò)影響這一過(guò)程對(duì)該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或P△的功能。
(1)為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物需滿(mǎn)足的條件是________________________，為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列，該限制酶識(shí)別序列應(yīng)添加在引物的__________(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個(gè)融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問(wèn)題的原因是___________________________________________。
修改擴(kuò)增P基因時(shí)使用的帶有EcoRⅠ識(shí)別序列的引物來(lái)解決該問(wèn)題，具體修改方案是_________________________________________________。
圖甲
(3)融合蛋白表達(dá)成功后，將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照?qǐng)D乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì)，分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC抗體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③組結(jié)果的差異推測(cè)，藥物A的作用是____________；由②④組或③⑤組的差異推測(cè)，P△中缺失的特定序列的作用是______________________________。
圖乙
圖丙
(4)根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，藥物A治療該病的機(jī)理是____________。
解析：(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核苷酸，因此設(shè)計(jì)擴(kuò)增P基因的引物，需要兩種引物分別與兩條模板鏈3′端的堿基序列互補(bǔ)。耐高溫的DNA聚合酶延伸時(shí)，是將脫氧核苷酸加到引物的3′端，為了不破壞目的基因，該限制酶識(shí)別序列應(yīng)添加在引物的5′端。(2)融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同，說(shuō)明P基因翻譯時(shí)出錯(cuò)。由圖可看出，在轉(zhuǎn)錄出的mRNA中，限制酶識(shí)別序列對(duì)應(yīng)的最后兩個(gè)堿基與P基因?qū)?yīng)的第一個(gè)堿基構(gòu)成一個(gè)密碼子，導(dǎo)致讀碼框改變，翻譯出的氨基酸序列改變，可通過(guò)在EcoRⅠ識(shí)別序列3′端添加1個(gè)堿基，使其堿基數(shù)目加上FLAG的堿基數(shù)目為3的倍數(shù)，這樣能保證P基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA上的讀碼框不改變，能夠正常翻譯。(3)①組僅添加UBC，處理后，用UBC抗體檢測(cè)，不出現(xiàn)雜交帶；②組添加UBC和FLAG-P，出現(xiàn)雜交帶；③組添加UBC、藥物A和FLAG-P，雜交帶更加明顯，說(shuō)明藥物A的作用是促進(jìn)UBC與FLAG-P的結(jié)合。②④組或③⑤組的差異在于②③組使用FLAG-P，出現(xiàn)雜交帶；④⑤組使用FLAG-P△，不出現(xiàn)雜交帶，據(jù)此推測(cè)P△中缺失的特定序列是與UBC結(jié)合的關(guān)鍵序列。(4)根據(jù)(3)的分析推測(cè)，藥物A促進(jìn)UBC與FLAG-P的結(jié)合，從而促進(jìn)蛋白P被蛋白酶識(shí)別并降解，達(dá)到治療的目的。
答案：(1)能與P基因母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)、短單鏈核酸　5′端　(2)P基因編碼鏈的第一個(gè)堿基與EcoRⅠ識(shí)別序列的最后兩個(gè)堿基編碼一個(gè)氨基酸，導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯(cuò)位讀取　在引物中的EcoRⅠ識(shí)別序列3′端添加1個(gè)堿基　(3)增強(qiáng)FLAG-P與UBC的結(jié)合　參與P與UBC的結(jié)合　(4)藥物A通過(guò)增強(qiáng)P與UBC結(jié)合促進(jìn)P降解
命題點(diǎn)2　圍繞蛋白質(zhì)工程考查生命觀念、社會(huì)責(zé)任及科學(xué)探究
2．(2022·湖南卷)水蛭是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材，主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。擬通過(guò)蛋白質(zhì)工程改造水蛭素結(jié)構(gòu)，提高其抗凝血活性。回答下列問(wèn)題：
(1)蛋白質(zhì)工程流程如圖所示，物質(zhì)a是______________________，物質(zhì)b是____________。在生產(chǎn)過(guò)程中，物質(zhì)b可能不同，合成的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象卻相同，原因是_____________________________。
(2)蛋白質(zhì)工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有______________________________、________________________和利用PCR技術(shù)擴(kuò)增。PCR技術(shù)遵循的基本原理是___________________________。
(3)將提取的水蛭蛋白經(jīng)甲、乙兩種蛋白酶水解后，分析水解產(chǎn)物中的肽含量及其抗凝血活性，結(jié)果如圖所示。推測(cè)兩種處理后酶解產(chǎn)物的抗凝血活性差異主要與肽的______________(填“種類(lèi)”或“含量”)有關(guān)，導(dǎo)致其活性不同的原因是____________________________________________。
(4)若要比較蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，簡(jiǎn)要寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路_________________________。
解析：(1)據(jù)分析可知，物質(zhì)a是具有特定氨基酸序列的多肽鏈，物質(zhì)b是mRNA。在生產(chǎn)過(guò)程中，物質(zhì)b可能不同，合成的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象卻相同，原因是密碼子的簡(jiǎn)并性，即一種氨基酸可能有幾個(gè)密碼子。(2)蛋白質(zhì)工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有從基因文庫(kù)中獲取目的基因、通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成和利用PCR技術(shù)擴(kuò)增。PCR技術(shù)遵循的基本原理是DNA半保留復(fù)制。(3)將提取的水蛭蛋白經(jīng)甲、乙兩種蛋白酶水解后，據(jù)圖可知，水解產(chǎn)物中的肽含量隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)均上升，且差別不大；而水解產(chǎn)物中抗凝血活性有差異，經(jīng)酶甲處理后，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，抗凝血活性先上升后相對(duì)穩(wěn)定，經(jīng)酶乙處理后，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲處理后的酶解產(chǎn)物的抗凝血活性最終高于經(jīng)酶乙處理后的酶解產(chǎn)物的抗凝血活性，差異明顯，據(jù)此推測(cè)兩種處理后酶解產(chǎn)物的抗凝血活性差異主要與肽的種類(lèi)有關(guān)，導(dǎo)致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解時(shí)間和酶的種類(lèi)不同，導(dǎo)致水蛭蛋白空間結(jié)構(gòu)有不同程度破壞。(4)若要比較蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路為：取3支試管，分別加入等量的蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一種動(dòng)物(如家兔)血液，立即將等量的血液加入1、2、3號(hào)三支試管中，靜置相同時(shí)間，統(tǒng)計(jì)三支試管中血液凝固時(shí)間。
答案：(1)具有特定氨基酸序列的多肽鏈　mRNA　密碼子的簡(jiǎn)并性　(2)從基因文庫(kù)中獲取　通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成　DNA半保留復(fù)制　(3)種類(lèi)　提取的水蛭蛋白的酶解時(shí)間和酶的種類(lèi)不同，導(dǎo)致水蛭蛋白空間結(jié)構(gòu)有不同程度破壞　(4)取3支試管，分別加入等量的蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一種動(dòng)物(如家兔)血液，立即將等量的血液加入1、2、3號(hào)三支試管中，靜置相同時(shí)間，統(tǒng)計(jì)三支試管中血液凝固時(shí)間
考點(diǎn)四　(實(shí)驗(yàn))DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
1．DNA的粗提取與鑒定
(1)實(shí)驗(yàn)原理
(2)實(shí)驗(yàn)步驟
2．DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
(1)實(shí)驗(yàn)原理
①PCR原理：利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。
②電泳：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。
③PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。
(2)PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟
(3)DNA的測(cè)定：凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為300_nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。
(4)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)
①成功擴(kuò)增出DNA片段的判斷依據(jù)是可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶。
②進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是一條條帶。如圖所示，該片段大小約為750 bp。
1．DNA的粗提取與鑒定的注意事項(xiàng)
(1)加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
(2)本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核(無(wú)DNA)。可選用雞血細(xì)胞作為材料。
(3)鑒定DNA時(shí)，一支試管為對(duì)照組，另一支試管為實(shí)驗(yàn)組。兩支試管中都先加物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液；在實(shí)驗(yàn)組試管中加DNA絲狀物，對(duì)照組不加；加入二苯胺試劑后沸水浴加熱。結(jié)果可以看到加DNA絲狀物的試管呈現(xiàn)藍(lán)色，對(duì)照組無(wú)色。如果實(shí)驗(yàn)組藍(lán)色較淺，說(shuō)明提取出的DNA量太少。
2．DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。
(2)該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購(gòu)買(mǎi)，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20 ℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
(3)在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染。
(4)在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。
(5)觀察DNA帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。
命題點(diǎn)1　圍繞DNA的粗提取與鑒定考查科學(xué)探究
1．(2022·山東卷)關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是(　　)
A．過(guò)濾液沉淀過(guò)程在4 ℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解
B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀
C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)
解析：選B。低溫時(shí)DNA酶的活性較低，過(guò)濾液沉淀過(guò)程在4 ℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解，A正確；離心研磨液是為了使細(xì)胞碎片沉淀，B錯(cuò)誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色，C正確；細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶解于酒精，可能有蛋白質(zhì)不溶于酒精，在95%的冷酒精中與DNA一塊兒析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)，D正確。
命題點(diǎn)2　圍繞DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定考查科學(xué)探究
2．人體內(nèi)一些正常或異常細(xì)胞脫落破碎后，其DNA會(huì)以游離的形式存在于血液中，稱(chēng)為cfDNA。近幾年，結(jié)合PCR及電泳鑒定、DNA測(cè)序等技術(shù)，cfDNA在臨床上得到了廣泛應(yīng)用。下列相關(guān)說(shuō)法不正確的是(　　)
A．PCR反應(yīng)中設(shè)置不同的溫度是為了使DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)
B．在瓊脂糖凝膠中，cfDNA的遷移速率與cfDNA分子的大小、構(gòu)象等有關(guān)
C．在進(jìn)行電泳時(shí)，要預(yù)留一個(gè)加樣孔，加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物
D．對(duì)cfDNA進(jìn)行檢測(cè)，可以用于腫瘤的早期篩查
解析：選A。PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了解旋變性、復(fù)性、延伸，A錯(cuò)誤；分子的大小、構(gòu)象、凝膠的種類(lèi)、濃度、電泳的電壓大小等都會(huì)影響分子遷移速率，B正確；在進(jìn)行電泳時(shí)，要預(yù)留一個(gè)加樣孔，加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物，C正確；cfDNA是人體內(nèi)一些正常或異常細(xì)胞脫落破碎后形成的游離DNA，所以可通過(guò)檢測(cè)cfDNA中的相關(guān)基因，判斷其來(lái)自正常或異常細(xì)胞，并進(jìn)行癌癥的篩查，D正確。
[真題演練]
1．(2021·湖北卷)某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對(duì))外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對(duì))。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是(　　)
A．增加模板DNA的量 B．延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間
C．延長(zhǎng)延伸的時(shí)間 D．提高復(fù)性的溫度
解析：選D。增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度，但不能有效減少非特異性條帶，A不符合題意；延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間和延長(zhǎng)延伸的時(shí)間會(huì)影響變性和延伸過(guò)程，但對(duì)于延伸中的配對(duì)影響不大，故不能有效減少反應(yīng)非特異性條帶，B、C不符合題意；非特異性產(chǎn)物增加的原因可能是復(fù)性溫度過(guò)低造成引物與模板的結(jié)合位點(diǎn)增加，故可通過(guò)提高復(fù)性的溫度來(lái)減少反應(yīng)非特異性條帶的產(chǎn)生，D符合題意。
2．(2021·江蘇卷)如圖是剔除轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的一種策略，下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．分別帶有目的基因和標(biāo)記基因的兩個(gè)質(zhì)粒，都帶有T－DNA序列
B．該方法建立在高轉(zhuǎn)化頻率基礎(chǔ)上，標(biāo)記基因和目的基因須轉(zhuǎn)到不同染色體上
C．若要獲得剔除標(biāo)記基因的植株，轉(zhuǎn)化植株必須經(jīng)過(guò)有性繁殖階段遺傳重組
D．獲得的無(wú)篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生了染色體結(jié)構(gòu)變異
解析：選D。農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上，故分別帶有目的基因和標(biāo)記基因的兩個(gè)質(zhì)粒，都帶有T－DNA序列，進(jìn)而成功整合到受體細(xì)胞染色體上，A正確；該方法需要利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，在高轉(zhuǎn)化頻率的基礎(chǔ)上，將目的基因和標(biāo)記基因整合到染色體上，由圖可知，標(biāo)記基因和目的基因位于細(xì)胞中不同的染色體上，B正確；由圖可知，若要獲得剔除標(biāo)記基因的植株，轉(zhuǎn)化植株必須經(jīng)過(guò)有性繁殖階段遺傳重組，C正確；獲得的無(wú)篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生了基因重組，D錯(cuò)誤。
3．(2021·遼寧卷)腈水合酶(N0)廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)和醫(yī)藥原料生產(chǎn)等領(lǐng)域，但不耐高溫。利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)在N0的α和β亞基之間加入一段連接肽，可獲得熱穩(wěn)定的融合型腈水合酶(N1)。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．N1與N0氨基酸序列的差異是影響其熱穩(wěn)定性的原因之一
B．加入連接肽需要通過(guò)改造基因?qū)崿F(xiàn)
C．獲得N1的過(guò)程需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯
D．檢測(cè)N1的活性時(shí)先將N1與底物充分混合，再置于高溫環(huán)境
解析：選D。在N0的α和β亞基之間加入一段連接肽，可獲得熱穩(wěn)定的融合型腈水合酶(N1)，則N1與N0氨基酸序列有所不同，這可能是影響其熱穩(wěn)定性的原因之一，A正確；蛋白質(zhì)工程的作用對(duì)象是基因，即加入連接肽需要通過(guò)改造基因?qū)崿F(xiàn)，B正確；N1為蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的合成需要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)過(guò)程，C正確；酶具有高效性，檢測(cè)N1的活性需先將其置于高溫環(huán)境，再與底物充分混合，D錯(cuò)誤。
4．(2021·福建卷)微生物吸附是重金屬?gòu)U水的處理方法之一。金屬硫蛋白(MT)是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)植物中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的作用。科研人員將棗樹(shù)的MT基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建工程菌。回答下列問(wèn)題：
(1)根據(jù)棗樹(shù)的MTcDNA的核苷酸序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物(圖1甲)，通過(guò)PCR擴(kuò)增MT基因。已知A位點(diǎn)和B位點(diǎn)分別是起始密碼子和終止密碼子對(duì)應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為_(kāi)___________。
圖1
(2)本實(shí)驗(yàn)中，PCR所用的DNA聚合酶擴(kuò)增出的MT基因的末端為平末端。由于載體E只有能產(chǎn)生黏性末端的酶切位點(diǎn)，需借助中間載體P將MT基因接入載體E。載體P和載體E的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切序列如圖1乙所示。
①選用____________________酶將載體P切開(kāi)，再用________________(填“T4 DNA”或“E.coli DNA”)連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。
②載體P′不具有表達(dá)MT基因的____________和______________。選用________________酶組合對(duì)載體P′和載體E進(jìn)行酶切，將切下的MT基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連接，將得到的混合物導(dǎo)入到用________離子處理的大腸桿菌，篩出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表達(dá)量如圖2所示。結(jié)果仍無(wú)法說(shuō)明已經(jīng)成功構(gòu)建能較強(qiáng)吸附廢水中重金屬的MT工程菌，理由是_____________________。
圖2
解析：(1)密碼子位于mRNA上，是決定氨基酸的三個(gè)相鄰堿基，起始密碼子和終止密碼子分別控制翻譯的開(kāi)始和結(jié)束，故為保證基因的正常表達(dá)，一對(duì)引物應(yīng)分別位于位點(diǎn)A和位點(diǎn)B的兩側(cè)，故選擇引物1和引物4。(2)①為得到平末端，可用EcoRⅤ酶將載體P切開(kāi)；由于E.coli DNA連接酶只能連接黏性末端，而T4 DNA連接酶可以連接平末端和黏性末端，結(jié)合題意可知，MT基因的末端為平末端，故需要用T4 DNA連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。②載體P′是重組質(zhì)粒，故不含有表達(dá)MT基因的啟動(dòng)子和終止子；為避免自身環(huán)化和反向連接，可選用兩種酶切割兩種載體，據(jù)圖可知，載體P′和載體E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶，故可選用XhoⅠ和PstⅠ酶進(jìn)行酶切；將目的基因?qū)氪竽c桿菌的方法是鈣離子處理法。(3)由于尚未在個(gè)體生物學(xué)水平上對(duì)MT工程菌吸附重金屬的能力進(jìn)行鑒定，故即使MT工程菌的MT蛋白相對(duì)含量較高，也無(wú)法說(shuō)明已經(jīng)成功構(gòu)建能較強(qiáng)吸附廢水中重金屬的MT工程菌。
答案：(1)引物1和引物4　(2)①EcoRⅤ　T4DNA　②啟動(dòng)子　終止子　XhoⅠ和PstⅠ　鈣　(3)尚未在個(gè)體生物學(xué)水平上對(duì)MT工程菌吸附重金屬的能力進(jìn)行鑒定
[長(zhǎng)句特訓(xùn)]
新冠病毒是一種單鏈RNA病毒，常用“熒光RT—PCR技術(shù)”進(jìn)行檢測(cè)，方法是取檢測(cè)者的mRNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，并大量擴(kuò)增時(shí)，用熒光標(biāo)記的新冠病毒核酸探針來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物中是否含有新冠病毒的cDNA，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
設(shè)問(wèn)形式1　必備知識(shí)及其應(yīng)用類(lèi)命題
(1)“熒光RT—PCR技術(shù)”所用的試劑盒中通常都應(yīng)該含有：___________、______________、熒光標(biāo)記的核酸探針、引物、dNTP、緩沖體系。
設(shè)問(wèn)形式2　信息推斷類(lèi)命題
(2)如果要同時(shí)擴(kuò)增兩種基因，則試劑盒中的引物應(yīng)該有____________種。如圖為新冠病毒的“ORFlab基因”對(duì)應(yīng)的cDNA片段結(jié)構(gòu)示意圖，則與之對(duì)應(yīng)的引物結(jié)合的部位應(yīng)該是圖中的____________(子鏈延伸方向?yàn)槠渥陨淼?′→3′，用圖中數(shù)字作答)。若已知該基因的引物Ⅰ，能否依據(jù)其堿基序列設(shè)計(jì)出另一種引物Ⅱ？
____________，理由是_______________________。
設(shè)問(wèn)形式3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析類(lèi)命題
(3)在檢測(cè)過(guò)程中，隨著PCR的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，“雜交雙鏈”熒光信號(hào)的強(qiáng)度也等比例增加。可通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖(如圖)。
①“平臺(tái)期”出現(xiàn)的最可能的原因是_________________________。
②理論上，在檢測(cè)過(guò)程中，有熒光標(biāo)記的“雜交雙鏈”出現(xiàn)，則說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果呈__________(填“陰”或“陽(yáng)”)性，但為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，一般要達(dá)到或超過(guò)閾值時(shí)才確診。現(xiàn)有兩個(gè)待檢樣本，檢測(cè)時(shí)都出現(xiàn)了上述形態(tài)的曲線，但甲的a點(diǎn)比乙的a點(diǎn)明顯左移。請(qǐng)給這種結(jié)果作出科學(xué)合理的解釋(試劑盒合格且正常，操作過(guò)程規(guī)范且準(zhǔn)確)：___________________________________。
解析：(1)根據(jù)題目信息可知，熒光PCR法基本原理是：將新冠病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)采用熒光RT—PCR技術(shù)，因此熒光PCR法所用的試劑盒中通常都應(yīng)該含有：逆轉(zhuǎn)錄酶、耐高溫的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、熒光標(biāo)記的核酸探針、引物、dNTP、緩沖體系。(2)根據(jù)PCR技術(shù)的原理，在擴(kuò)增DNA分子時(shí)每一條鏈均需與相應(yīng)的引物結(jié)合才能進(jìn)行擴(kuò)增，因此如果要成功將上述兩個(gè)獨(dú)立基因分別擴(kuò)增出來(lái)，則在試劑盒中的引物應(yīng)該有4種；在利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA分子過(guò)程中，耐高溫的DNA聚合酶只能從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸，又由于DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模砸锱cDNA分子單鏈的3′端(—OH)相結(jié)合即圖示中的1和4所示部位。由于兩段引物的堿基序列沒(méi)有相關(guān)性，既不相同，也不互補(bǔ)，因此不能根據(jù)該基因的引物Ⅰ的堿基序列設(shè)計(jì)出另一種引物Ⅱ。(3)①分析熒光擴(kuò)增曲線圖，圖中曲線通過(guò)熒光強(qiáng)度變化反映產(chǎn)物量的變化，因此曲線中“平臺(tái)期”出現(xiàn)的最可能原因是試劑盒中的原料和探針數(shù)量一定，超出一定的循環(huán)數(shù)后，熒光標(biāo)記的雜交雙鏈不再增加。②理論上，在檢測(cè)過(guò)程中，有熒光標(biāo)記的“雜交雙鏈”出現(xiàn)，則說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，一般要達(dá)到或超過(guò)閾值時(shí)才確診。現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果甲的a點(diǎn)比乙的a點(diǎn)明顯左移，說(shuō)明甲樣本中的新冠病毒含量更高，達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)更少。
答案：(1)逆轉(zhuǎn)錄酶　耐高溫的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)　(2)4　4、1　不能　兩段引物的堿基序列沒(méi)有相關(guān)性(既不相同，也不互補(bǔ))　(3)①試劑盒中的原料、引物和探針數(shù)量一定，超出一定的循環(huán)數(shù)后，熒光標(biāo)記的“雜交雙鏈”不再增加　②陽(yáng)　甲樣本中的新冠病毒含量更高，達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)更少
第5課　基因工程
[基礎(chǔ)練透]
1．如圖是3種限制性?xún)?nèi)切核酸酶對(duì)DNA分子的識(shí)別序列和剪切位點(diǎn)圖(箭頭表示切點(diǎn)，切出的斷面為黏性末端)。下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．不同的限制酶有不同的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，體現(xiàn)了酶的專(zhuān)一性
B．限制酶2和3識(shí)別的序列都包含6個(gè)核苷酸
C．限制酶1和3剪出的黏性末端相同
D．能夠識(shí)別和切割RNA分子內(nèi)一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2
解析：選D。不同的限制酶有不同的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，體現(xiàn)了酶具有專(zhuān)一性，A正確；據(jù)圖可知，限制酶2和3識(shí)別的序列分別是CCGCGG和GGATCC，均為6個(gè)核苷酸，B正確；限制酶1和3剪出的黏性末端相同，均為GATC，C正確；限制酶只能識(shí)別特定的DNA序列，因此三種限制酶均不能識(shí)別和切割RNA中核糖核苷酸序列，D錯(cuò)誤。
2．(2022·北京房山區(qū)二模)大腸桿菌的質(zhì)粒——環(huán)狀DNA是基因工程的常用載體，結(jié)構(gòu)如圖。下列敘述正確的是(　　)
A．①②③共同組成核糖核苷酸
B．質(zhì)粒中的堿基遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則
C．DNA連接酶會(huì)使化學(xué)鍵④重新連接
D．若某種限制酶在質(zhì)粒上只有一個(gè)酶切位點(diǎn)，則質(zhì)粒被切為兩個(gè)片段
解析：選B。①②③共同組成DNA的基本單位——脫氧核苷酸，A錯(cuò)誤；質(zhì)粒中的堿基遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，A與T配對(duì)，G與C配對(duì)，B正確；DNA連接酶使DNA片段重新連接，該過(guò)程形成磷酸二酯鍵，磷酸二酯鍵是由磷酸基團(tuán)與3號(hào)碳原子相連，圖中的④不屬于磷酸二酯鍵，C錯(cuò)誤；限制酶識(shí)別特定序列并在特定位點(diǎn)切割，環(huán)狀質(zhì)粒上若只有一個(gè)限制酶切位點(diǎn)，則質(zhì)粒被切割為1個(gè)完整的DNA鏈狀片段，D錯(cuò)誤。
3．某研究所的研究人員擬將生長(zhǎng)激素基因通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，已知質(zhì)粒中存在兩個(gè)抗性基因：A是抗鏈霉素基因，B是抗氨芐青霉素基因，目的基因要插入到基因B中，且大腸桿菌本身不帶有任何抗性基因。下列敘述正確的是(　　)
A．導(dǎo)入大腸桿菌的質(zhì)粒一定為重組質(zhì)粒
B．抗生素抗性基因是目的基因表達(dá)的必要條件
C．成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)
D．能在含鏈霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的大腸桿菌不一定符合生產(chǎn)要求
解析：選D。導(dǎo)入大腸桿菌的質(zhì)粒可能為重組質(zhì)粒，也可能為普通質(zhì)粒，A錯(cuò)誤；抗生素抗性基因是標(biāo)記基因，是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)，與目的基因表達(dá)無(wú)關(guān)，B錯(cuò)誤；由于目的基因要插入到基因B中，即抗氨芐青霉素基因被破壞，即工程菌不能抗氨芐青霉素，因此成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌不能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，C錯(cuò)誤；能在含鏈霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的大腸桿菌可能含有重組質(zhì)粒或普通質(zhì)粒，因此不一定符合生產(chǎn)要求，D正確。
4．菊花是一種雙子葉植物，易感桃蚜。桃蚜不但直接影響植物生長(zhǎng)，還是多種植物病毒的傳播媒介。雪花蓮凝集素基因GNA的表達(dá)產(chǎn)物能有效抑制桃蚜生長(zhǎng)，某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)GNA基因菊花。下列有關(guān)敘述不正確的是(　　)
A．受體細(xì)胞可以選擇菊花葉片細(xì)胞或桃蚜細(xì)胞
B．將目的基因GNA插入到Ti質(zhì)粒的T－DNA上構(gòu)建表達(dá)載體
C．可以將菊花葉片取下與農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞
D．應(yīng)用抗蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因菊花對(duì)桃蚜的抗性及抗性的程度
解析：選A。要獲得轉(zhuǎn)基因菊花，可以選擇菊花葉片細(xì)胞作為受體細(xì)胞，但不能選擇桃蚜細(xì)胞作為受體細(xì)胞，A錯(cuò)誤；Ti質(zhì)粒的T－DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上，根據(jù)這一特點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)將目的基因GNA插入到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，B正確；可以將菊花葉片取下與農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株，C正確；已知雪花蓮凝集素基因GNA的表達(dá)產(chǎn)物能有效抑制桃蚜生長(zhǎng)，故應(yīng)用抗蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因菊花對(duì)桃蚜的抗性及抗性的程度，D正確。
5．科學(xué)家培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因奶牛的乳腺細(xì)胞能夠合成并分泌人凝血因子，這是動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器研究的重大進(jìn)展。下列敘述正確的是(　　)
A．在該轉(zhuǎn)基因牛中，人凝血因子基因只存在于乳腺細(xì)胞，而不存在于其他體細(xì)胞中
B．“提高基因表達(dá)水平”是指設(shè)法使牛的乳腺細(xì)胞中含有更多的人凝血因子基因
C．人凝血因子基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄后，DNA聚合酶以DNA分子的一條鏈為模板合成mRNA
D．轉(zhuǎn)基因奶牛需要進(jìn)入泌乳期才能批量生產(chǎn)人凝血因子
解析：選D。根據(jù)題意，在該轉(zhuǎn)基因工程中，人凝血因子基因?qū)氲氖荏w細(xì)胞是牛的受精卵，由該受精卵發(fā)育形成的個(gè)體的各種體細(xì)胞中都存在人凝血因子基因，A錯(cuò)誤；“提高基因表達(dá)水平”是指設(shè)法使牛的乳腺細(xì)胞合成更多的人凝血因子，B錯(cuò)誤；人凝血因子基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄后，RNA聚合酶以DNA分子的一條鏈為模板合成mRNA，C錯(cuò)誤；轉(zhuǎn)基因奶牛需要進(jìn)入泌乳期才能批量生產(chǎn)人凝血因子，D正確。
6．(2022·青島市一模)亞洲棉的突變型光籽和野生型毛籽是一對(duì)相對(duì)性狀，研究發(fā)現(xiàn)，亞洲棉某突變體的光籽表型與8號(hào)染色體的～880 kb至～903 kb區(qū)間相關(guān)，研究人員根據(jù)野生型毛籽棉的該區(qū)間設(shè)計(jì)連續(xù)的重疊引物進(jìn)行PCR，產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果如圖所示，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是(　　)
A．應(yīng)提取該突變體和野生型亞洲棉的全部染色體DNA進(jìn)行PCR
B．題圖中PCR產(chǎn)物的鑒定是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)進(jìn)行的
C．據(jù)圖分析可知，分子量較大的擴(kuò)增產(chǎn)物與點(diǎn)樣處的距離較小
D．該突變體出現(xiàn)的根本原因是第6對(duì)引物對(duì)應(yīng)區(qū)間發(fā)生了基因突變
解析：選A。由于8號(hào)染色體的～880 kb至～903 kb區(qū)間與突變體的光籽表型相關(guān)，故應(yīng)該提取突變體和野生型的8號(hào)染色體上的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，A錯(cuò)誤；題圖中PCR產(chǎn)物的鑒定是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)進(jìn)行的，主要依據(jù)分子量不同，采用外加電場(chǎng)使其分開(kāi)，B正確；由圖可知，分子量較大的擴(kuò)增產(chǎn)物遷移速率慢，與點(diǎn)樣處的距離較小，C正確；根據(jù)野生型和突變體經(jīng)引物6擴(kuò)增的產(chǎn)物不同可知，8號(hào)染色體上的第6對(duì)引物對(duì)應(yīng)的區(qū)間基因突變是光籽性狀出現(xiàn)的根本原因，D正確。
7．(多選)科研人員通過(guò)PCR技術(shù)獲得白蛋白啟動(dòng)子，將該啟動(dòng)子與Cre重組酶基因結(jié)合構(gòu)建基因表達(dá)載體，培育出在肝細(xì)胞中特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。下列相關(guān)敘述正確的是(　　)
A．將基因表達(dá)載體導(dǎo)入肝細(xì)胞經(jīng)培育獲得轉(zhuǎn)基因小鼠
B．利用PCR技術(shù)獲得白蛋白啟動(dòng)子需要兩種引物
C．通過(guò)抗原—抗體雜交技術(shù)可檢測(cè)Cre基因是否完成表達(dá)
D．將發(fā)育到原腸胚時(shí)期的重構(gòu)胚向受體進(jìn)行移植
解析：選BC。將該基因表達(dá)載體導(dǎo)入受精卵以獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，A錯(cuò)誤；DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從引物的3′端(子鏈的5′端)開(kāi)始延伸DNA，因此PCR過(guò)程中需要添加引物才能完成復(fù)制過(guò)程，要合成兩條子鏈，需要兩種引物，B正確；Cre基因完成表達(dá)的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，故可用抗原—抗體雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，C正確；胚胎移植需要胚胎發(fā)育至桑葚胚或囊胚階段，D錯(cuò)誤。
8．(2022·山東模考)大芻草具有較強(qiáng)的耐鹽堿能力，該性狀與基因D有關(guān)。研究人員從大芻草細(xì)胞中獲得D后導(dǎo)入小麥中培育出轉(zhuǎn)基因小麥，該育種過(guò)程的操作流程如圖，圖中AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，TetR表示四環(huán)素抗性基因，BclⅠ、Hind Ⅲ和BamHⅠ為限制酶。回答下列問(wèn)題：
(1)將目的基因D和Ti質(zhì)粒連接構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，為保證目的基因正確連接，切割Ti質(zhì)粒選用的限制酶是______________，原因是___________________。
(2)在對(duì)導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進(jìn)行篩選時(shí)，首先將處理的農(nóng)桿菌接種到含________________的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，但得到的農(nóng)桿菌不完全含有重組質(zhì)粒，原因是________________________________；再用另一種培養(yǎng)基進(jìn)一步篩選，在此培養(yǎng)基上含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌______________(填“能”或“不能”)存活。
(3)增強(qiáng)子是可增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄的一小段特殊DNA序列，將其插入目的基因D的啟動(dòng)子中可提高基因D的表達(dá)量。但有人認(rèn)為這樣會(huì)引起基因突變，導(dǎo)致基因D表達(dá)的蛋白質(zhì)氨基酸序列改變，你是否認(rèn)同這種觀點(diǎn)，理由是_____________。
解析：(1)為了保證目的基因能夠插入到T－DNA上，所以不選BclⅠ，由于雙酶切可產(chǎn)生不同的黏性末端，能防止自身環(huán)化和連接，并保證目的基因準(zhǔn)確插入到T－DNA內(nèi)部，故選擇限制酶為HindⅢ和BamHⅠ。(2)將處理的農(nóng)桿菌接種到含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以達(dá)到篩選的目的；但得到的農(nóng)桿菌不完全含有重組質(zhì)粒，原因是含有Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌也存在AmpR，也能正常存活。再用含四環(huán)素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌不能存活，因?yàn)橹亟M質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因酶切時(shí)被破壞。(3)不認(rèn)同，插入位點(diǎn)在啟動(dòng)子，而翻譯是從起始密碼子開(kāi)始的，啟動(dòng)子屬于非編碼區(qū)，不編碼氨基酸，未能打亂起始密碼子后的堿基序列，從而不會(huì)造成氨基酸序列改變。
答案：(1)Hind Ⅲ和BamHⅠ　雙酶切產(chǎn)生不同的黏性末端，防止自身環(huán)化和連接，保證了目的基因準(zhǔn)確插入到T－DNA內(nèi)部　(2)氨芐青霉素　含有Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌也存在AmpR，能正常存活　不能　(3)不認(rèn)同，啟動(dòng)子屬于非編碼區(qū)，不編碼氨基酸，不影響蛋白質(zhì)的氨基酸序列
[能力提升]
9．(2022·遼寧一輪聯(lián)考)TALEN是一種靶向基因操作技術(shù)，該技術(shù)利用了TAL靶向識(shí)別單元對(duì)靶向基因的識(shí)別作用和FokⅠ蛋白對(duì)靶向基因的切割作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定靶向基因的敲除。TAL靶向識(shí)別單元為間隔32個(gè)氨基酸的雙連氨基酸(即兩個(gè)相連的氨基酸)序列。不同的雙連氨基酸分別與靶向基因中的A、T、C、G有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，根據(jù)靶向基因的堿基序列可以設(shè)計(jì)出雙連氨基酸序列。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是(　　)
A．該技術(shù)應(yīng)該先推測(cè)出信使RNA序列，再推測(cè)出目的基因的核苷酸序列
B．在構(gòu)建的基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子應(yīng)位于基因的首端，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位
C．TALEN是一種靶向基因操作技術(shù)，其中FokⅠ蛋白實(shí)質(zhì)上是一種限制酶
D．雙連氨基酸能夠與含氮堿基A、T、C、G之間發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)
解析：選D。已知TAL靶向識(shí)別單元中雙連氨基酸序列和FokⅠ蛋白的氨基酸序列，可先推測(cè)出信使RNA序列，再推測(cè)出目的基因的核苷酸序列，利用化學(xué)法以單個(gè)核苷酸為原料的步驟最終合成目的基因，再通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，A正確；在構(gòu)建的基因表達(dá)載體中，有啟動(dòng)子、終止子、目的基因、標(biāo)記基因等，其中啟動(dòng)子位于基因的首端，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，B正確；TALEN是一種靶向基因操作技術(shù)，該技術(shù)利用了TAL靶向識(shí)別單元對(duì)靶向基因的識(shí)別作用和FokⅠ蛋白對(duì)靶向基因的切割作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定靶向基因的敲除，可見(jiàn)FokⅠ蛋白實(shí)質(zhì)上是一種限制酶，C正確；只有含氮堿基之間能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，而雙連氨基酸不含有含氮堿基，D錯(cuò)誤。
10．(2022·濱州一模)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，可利用堿性磷酸單酯酶催化載體的5′－P變成5′－OH，如圖所示。將經(jīng)過(guò)該酶處理的載體與外源DNA連接時(shí)，由于5′－OH與3′－OH不能連接而形成切口(nick)。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是(　　)
A．經(jīng)堿性磷酸單酯酶處理的載體不會(huì)發(fā)生自身環(huán)化
B．外源DNA也必需用堿性磷酸單酯酶處理
C．T4 DNA連接酶可連接黏性末端和平末端
D．重組DNA經(jīng)過(guò)2次復(fù)制可得到不含nick的子代DNA
解析：選B。將經(jīng)過(guò)該酶處理的載體與外源DNA連接時(shí)，由于5′－OH與 3′－OH不能連接而形成切口(nick)，因此經(jīng)堿性磷酸單酯酶處理的載體不會(huì)發(fā)生自身環(huán)化，A正確；外源DNA不能用堿性磷酸單酯酶處理，如用堿性磷酸單酯酶處理，載體與外源DNA將不能連接形成重組DNA，B錯(cuò)誤；T4 DNA連接酶可連接黏性末端和平末端，C正確；DNA是半保留復(fù)制，重組DNA經(jīng)過(guò)2次復(fù)制，可得到2個(gè)不含nick的子代DNA，D正確。
11．(多選)小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因(kissl基因)僅在特定組織中表達(dá)。在雌激素誘導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可以與kissl基因啟動(dòng)子的特定區(qū)域結(jié)合，激活kissl基因的轉(zhuǎn)錄。研究者擴(kuò)增了kissl基因啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度的片段P1、P2、P3和P4，分別構(gòu)建這些片段與綠色熒光蛋白基因(G)融合的載體，轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的特定細(xì)胞中，在培養(yǎng)液中添加雌激素，以確定不同片段的轉(zhuǎn)錄活性。下列敘述正確的是(　　)
A．PCR獲取不同長(zhǎng)度片段時(shí)每組所用的引物有一個(gè)是統(tǒng)一的
B．應(yīng)選擇有kissl基因且能表達(dá)的小鼠細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞
C．在細(xì)胞中表達(dá)出綠色熒光強(qiáng)度弱的片段具有較高的轉(zhuǎn)錄活性
D．該啟動(dòng)子能響應(yīng)外源激素信號(hào)可在基因工程中發(fā)揮重要作用
解析：選ABD。結(jié)合圖示可知，不同長(zhǎng)度的片段P1、P2、P3和P4，分別構(gòu)建這些片段與綠色熒光蛋白基因(G)融合的載體，因此與G融合的那段是一樣的，即下游引物是一樣的，A正確；實(shí)驗(yàn)探究不同片段的轉(zhuǎn)錄活性，應(yīng)選擇有kissl基因且能表達(dá)的小鼠細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞，B正確；若某片段被轉(zhuǎn)錄，則熒光基因也被表達(dá)，在細(xì)胞中表達(dá)出綠色熒光強(qiáng)度強(qiáng)的片段具有較高的轉(zhuǎn)錄活性，C錯(cuò)誤；在雌激素誘導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可以與kissl基因啟動(dòng)子的特定區(qū)域結(jié)合，該啟動(dòng)子能響應(yīng)外源激素信號(hào)可在基因工程中發(fā)揮重要作用，D正確。
12．(2022·濟(jì)南一模)研究發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄需要轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子是組件式蛋白質(zhì)，包括DNA結(jié)合功能域(DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(DNA-AD)，兩結(jié)合域分開(kāi)時(shí)具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，如果將待測(cè)蛋白質(zhì)X與DNA-BD融合，蛋白質(zhì)Y與DNA-AD融合，蛋白質(zhì)X和Y有相互作用時(shí)，兩結(jié)構(gòu)域能重新呈現(xiàn)完整轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活報(bào)告基因啟動(dòng)子，過(guò)程如圖1所示。科研人員為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)X和Y是否具有相互作用及作用位置是位于蛋白質(zhì)的氨基端還是羧基端，分別PCR擴(kuò)增蛋白質(zhì)X和Y的全長(zhǎng)基因序列、編碼氨基端603個(gè)氨基酸片段的基因序列、編碼羧基端539個(gè)氨基酸片段的基因序列，分別構(gòu)建不同的酵母表達(dá)載體(如圖2和圖3所示)，其中AmpR為氨芐青霉素抗性基因，HIS3和TRPI分別為控制組氨酸和色氨酸合成的基因。空白載體或單獨(dú)一種載體均不能激活報(bào)告基因，載體對(duì)酵母菌無(wú)毒害作用。回答下列問(wèn)題：
(1)為了將pLexA-JL和pB42AD載體分別與蛋白質(zhì)X和Y的三種基因序列連接，需要先進(jìn)行PCR擴(kuò)增蛋白質(zhì)X基因和蛋白質(zhì)Y基因的6種序列，共需要設(shè)計(jì)___________種引物；擴(kuò)增后再用限制酶__________和_________分別切割蛋白質(zhì)X基因的3種序列和Y基因的3種序列。構(gòu)建好pLexA-JL和pB42AD基因表達(dá)載體后，為確定是否成功，需要酶切兩種載體后，根據(jù)__________結(jié)果觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的目標(biāo)條帶。
(2)色氨酸和亮氨酸合成缺陷型酵母菌菌株是實(shí)驗(yàn)室常用的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，將成功構(gòu)建的上述基因表達(dá)載體通過(guò)__________________法導(dǎo)入到處于感受態(tài)的色氨酸和亮氨酸合成缺陷型酵母菌中，在培養(yǎng)基中需添加____________________用于篩選成功導(dǎo)入基因表達(dá)載體的酵母菌。
(3)兩種載體成功導(dǎo)入酵母菌并表達(dá)，結(jié)果為蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y、蛋白質(zhì)X羧基端和蛋白質(zhì)Y、蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y羧基端、蛋白質(zhì)X羧基端和蛋白質(zhì)Y羧基端之間有相互作用。據(jù)此可推測(cè)的結(jié)論是______________________。不同蛋白質(zhì)之間相互作用是通過(guò)檢測(cè)________________________________得到的。
解析：(1)擴(kuò)增蛋白質(zhì)X基因和蛋白質(zhì)Y基因全序列分別需要2種引物，共需4種；單獨(dú)擴(kuò)增蛋白質(zhì)X的氨基端基因序列需要額外1種引物(其中一種引物與擴(kuò)增蛋白質(zhì)X基因全序列時(shí)相同)，同理單獨(dú)擴(kuò)增蛋白質(zhì)X羧基端基因、蛋白質(zhì)Y氨基端基因、蛋白質(zhì)Y羧基端基因各額外需要1種引物，共4種；故使用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)X基因和蛋白質(zhì)Y基因的6種序列進(jìn)行擴(kuò)增，需8種引物。在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，需使用同種限制酶切割目的基因與載體，使其形成相同末端以便使用DNA連接酶進(jìn)行連接。觀察可知pLexA-JL載體的目的基因插入位點(diǎn)含有的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)限制酶分別為EcoRⅠ和BamHⅠ，pB42AD載體的目的基因插入位點(diǎn)含有的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的限制酶分別為EcoRⅠ和XhoⅠ。構(gòu)建好基因表達(dá)載體后，可以使用DNA電泳，觀察電泳結(jié)果是否出現(xiàn)預(yù)期大小的目標(biāo)條帶，來(lái)確定表達(dá)載體構(gòu)建是否成功。(2)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常用的方法為Ca2＋處理法。表達(dá)載體上所含有的標(biāo)記基因?yàn)锳mpR基因，即氨芐青霉素抗性基因。可通過(guò)向培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素，觀察細(xì)胞的存活狀態(tài)來(lái)確定轉(zhuǎn)化是否成功，能在添加了氨芐青霉素的培養(yǎng)基上存活的微生物即為已完成轉(zhuǎn)化的酵母菌。(3)蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y均具有氨基端和羧基端，能觀察到蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y結(jié)合的結(jié)果，說(shuō)明蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y之間有相互作用；同時(shí)能觀察到蛋白質(zhì)X羧基端和蛋白質(zhì)Y、蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y羧基端、蛋白質(zhì)X羧基端和蛋白質(zhì)Y羧基端的作用結(jié)果，說(shuō)明蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y的作用位置分別在兩種蛋白質(zhì)的羧基端。由于只有當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)X和蛋白質(zhì)Y相互作用時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合功能域(DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(DNA-AD)才能發(fā)揮作用，進(jìn)而激活報(bào)告基因的啟動(dòng)子，從而驅(qū)動(dòng)對(duì)報(bào)告基因(LacZ基因)的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而得以表達(dá)。因此，可以通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因(LacZ基因)的表達(dá)情況來(lái)確定不同蛋白質(zhì)之間是否發(fā)生作用。
答案：(1)8　EcoRⅠ、BamHⅠ　EcoRⅠ、XhoⅠ 　電泳　(2)Ca2＋處理　氨芐青霉素　(3)蛋白質(zhì)X和Y之間具有相互作用，X蛋白和Y蛋白作用位置在羧基端　報(bào)告基因的表達(dá)(或LacZ的表達(dá))

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