資源簡介

中小學教育資源及組卷應用平臺
課題名稱 3.2 基因工程的基本操作程序（4課時） 課堂類型： 新課 □復習課 □習題課 實驗課 □試卷講評課 □其他：
學習者 分析 本節課的授課對象為高二年級的學生，學生經過“科學探索之路——基因工程的誕生和發展”和上一節“重組DNA技術的基本工具”的學習，而且經過之前對必修二的掌握，學生的生物基礎知識較為扎實，思維的目的性、連續性和邏輯性已初步建立，所以已經具備學習“基因工程的基本操作程序”一節的基礎。但本節內容較雜，知識抽象，并且學生缺乏科學技術的實踐經驗，所以對學生來說本節內容不易理解。因此在教學過程中，應在教師的引導下適時加強學生解決問題和運用概念圖等生物學語言歸納結論等方面的能力。
教學目標 與本節內容對應的課程標準的“內容要求”是：闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體的構建、目的基因導入受體細胞和目的基因及其表達產物的檢測鑒定等步驟。結合教材內容，確定本節的教學目標如下： 闡明PCR的原理，說出PCR反應所需要的條件和PCR反應的過程； 說出基因表達載體的組成； 列舉將目的基因導入植物細胞、動物細胞和微生物細胞的方法； 列舉檢測與鑒定目的基因在受體細胞中是否穩定維持和表達其遺傳特性的方法； 能夠用流程圖的形式概括出基因工程的基本操作程序； 針對人類生產或生活中的某一需求，能運用基因工程技術嘗試設計獲得某一轉基因產品的方案； 能夠基于對基因工程的原理和操作流程的認識，以理性的態度對待基因工程的研發和應用，認同我國科研工作者在基因工程領域取得的成就； 嘗試進行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產物。
教學重點 基因工程基本操作程序的四個步驟； DNA片段的擴增及電泳鑒定 落實教學重點的方法： 播放視頻、板畫流程、學生小組活動
教學難點 1、利用PCR獲取和擴增目的基因； 2、DNA片段的擴增及電泳鑒定。 突破教學難點的方法： 播放視頻、板畫流程、學生小組活動
教學資源 選擇 教師用書、教材、題單、天天練 技術手段的使用： 電子白板、板書、多媒體
課時： 3-4課時
核心問題 基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個步驟？ 基因工程操作的每一步涉及的技術和方法有哪些？
教學過程設計
3.2.1 基因工程的基本操作程序
問題情境 教學活動設計 （學習活動設計） 設計意圖
播放視頻，導入新課 在上節課中我們通過學習簡單地了解了基因工程的三大基本工具，包括分子手術刀——限制性內切核酸酶（限制酶），可以通過識別特定的核苷酸序列并且切斷特定部位的磷酸二酯鍵來進行目的基因的剪切，一般來說要想把目的基因剪下來需要用限制酶切割兩次；目的基因獲取以后還需要與運載體進行連接才能夠進入到受體細胞，與運載體連接的工具是DNA連接酶，將兩個DNA片段連接起來，包括兩種類型：E.coliDNA連接酶只能連接互補的黏性末端；T4DNA連接酶既可以連接互補的黏性末端，也可以連接平末端；通過DNA連接酶將目的基因構建到運載體，也就是分子運輸車上進行轉運，其中運載體的種類有質粒、動植物病毒以及噬菌體，其中質粒是最常見的運載體，它是一種環狀的DNA分子，存在于真核細胞和原核細胞中，作為基因工程的載體必須滿足四個要求：不能對受體細胞有害；至少有一個或多個酶切位點，便于目的基因的插入；能夠在受體細胞中自我復制，或整合到受體DNA上隨著受體的DNA同步復制；含有特殊的標記基因，便于重組DNA分子的篩選。 我國是棉花生產大國，轉基因抗蟲棉的誕生為我國帶來極大的便利。教師播 放視頻，激發學生學習興趣。提問：培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟 今天我們進入基因工程的第二節內容：基因工程的基本操作程序。 按照我們對基因工程概念的理解，其大致過程應該可以概括為： 教師引導學生梳理上節課的知識點，加深印象。 播放視頻，激發學生學習興趣，認同科技發展已成為不同國家比拼的有效工具。 結合概念構建基因工程的大致流程。
問題情境 教學活動設計 （學習活動設計） 設計意圖
如何進行目的基因的篩選和獲取？ 因此基因工程大致包括四個步驟，分別是目的基因的篩選與獲取、目的基因表達載體的構建（這是核心步驟）、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。我們按照操作順序逐一進行分析： （一）目的基因 概念：目的基因指的是在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因。根據不同的需要目的基因肯定也是不同的。但主要指的是編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有調控作用的因子。 比如：與生物抗逆性、優良品質、生產藥物、毒物降解和工業用酶等相關的基因。 蘇云金桿菌通過產生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統來殺死棉鈴蟲。科學家將“殺蟲基因”轉入棉花中，棉花產生Bt 抗蟲蛋白抵抗蟲害。這里的殺蟲基因就是目的基因。 （二）篩選目的基因 那么，如何篩選目的基因呢？一般來說都是從已知結構和功能清晰的基因中進行 篩選。由于科學家對蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑已經有多年歷史，且掌握了Bt基因的序列信息，對Bt基因的表達產物也了解得很透徹，且Bt抗蟲蛋白只在某類昆蟲腸道的堿性環境中才表現出毒性，對人和牲畜無影響。因此它是培育轉基因抗蟲棉較為適合的目的基因。 隨著技術的發展，比如測序技術、序列數據庫以及序列對比工具等，越來越多的基因的結構和功能為人們所知，這就為科學家找到合適的目的基因提供了更多的機會。 目的基因的獲取 當我們篩選到了目的基因Bt基因，有什么方法可以獲得它呢？ 人工合成：人工合成法只適用于基因比較小、核苷酸序列已知的目的基因，可以通過通過DNA合成儀用化學方法直接合成； 人工化學合成法 ：根據已知的氨基酸序列合成DNA （2）反轉錄法：以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。 利用PCR獲取和擴增目的基因。 PCR獲取和擴增目的基因 概念：PCR——指的是聚合酶鏈式反應 原理：DNA半保留復制，即在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。 PCR由穆里斯等人于1985年發明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學獎。 DNA復制所需的基本條件 我們簡單回顧一下必修二DNA半保留復制的一些條件： 那么PCR技術是如何實現在體外進行大規模擴增DNA的呢？我們先通過視頻簡單了解一下，根據該視頻可得出： Q：需要引物的原因：DNA聚合酶不能從頭合成DNA，只能從引物的3′端開始延伸DNA鏈。 PCR的反應過程： 【復性時引物與DNA模板的結合是隨機的，也存在解開的兩條DNA單鏈的結合，但兩條模板鏈重新結合的概率較低，原因是：①模板鏈一般比較長，比引物復雜得多，重新結合的概率較低。②加入引物的量足夠多，而模板鏈數量少，引物與模板之間的碰撞結合機會，遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞機會。】 4、列表比較PCR技術與DNA分子的復制過程： Q：PCR技術獲取目的基因時至少要經過幾次循環才能從DNA分子中分離出目的基因？ 5、如何對產物進行鑒定？ 瓊脂糖凝膠電泳——DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就叫電泳。 用PCR可以擴增mRNA嗎？——不能！由于RNA不穩定，需要將RNA逆轉錄為cDNA，然后再進行擴增。 【練習】 1、下列有關體內DNA復制與PCR技術比較的敘述，錯誤的是（ B ） A.二者子鏈的延伸方向相同，均為5′端→3′端 B.二者均需要解旋酶破壞氫鍵來實現解旋 C.體內DNA復制需要能量，PCR反應也需要能量 D.二者遵循的堿基互補配對原則相同 2.(2022·天津一中高二期中)下圖表示利用PCR技術擴增目的基因的部分過程，其原理與細胞內DNA復制類似。下列敘述錯誤的是（ D ） A.耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到3′端 B.在第三輪循環產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段 C.引物之間或引物自身發生堿基互補配對，則不能有效擴增目的基因 D.從理論上推測，第三輪循環產物中含有引物A的DNA片段占3/4 明確基因工程的基本操作程序包括四個方面。 讓學生認識到篩選合適的目的基因的重要性。 引導學生學習了解科學研究的方法。 讓學生基于DNA復制的相關知識類比推出PCR反應所需要的條件，既可以培養他們的科學思維，又能深化他們對PCR原理的理解。 借助動態視頻呈現PCR反應的過程，可以降低學習難度，也便于學生理解和掌握。 通過列表比較PCR技術與DNA復制，培養學生的比較分析能力，強化對該部分知識的掌握。 通過問題驅動引導學生思考PCR技術的具體操作問題，培養學生的科學思維。 即時訓練即時評價。
問題情境 教學活動設計 （學習活動設計） 設計意圖
獲得了足量的Bt基因后，是否能直接將Bt基因導入棉花細胞呢？ 獲得了足量的Bt基因后，是否能直接將Bt基因導入棉花細胞呢？我們 基因包括編碼區和非編碼區，其中編碼區能夠編碼蛋白質的合成，非編碼區不能編碼蛋白質，但是可以調控遺傳信息的表達，其中啟動子和終止子就是位于非編碼區。 啟動子：一段有特殊序列結構的DNA片段，位于基因的上游，緊挨轉錄的起始位點，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終表達出人類需要的蛋白質。通俗來說啟動子就是告訴起始密碼子可以開始轉錄了。 終止子：位于基因的下游，也是一段有特殊序列的DNA片段，相當于紅色信號燈，使轉錄在需要停止的地方停下來，終止子就是在告訴終止密碼子可以終止轉錄了。 通過前面的學習我們知道下一步就是要讓基因在受體細胞中穩定存在，并且遺傳給下一代；同時使Bt基因能夠表達和發揮作用，這就需要進行基因表達載體的構建，這一步是培育轉基因抗蟲棉的核心工作。如果我們以質粒為載體的話，那么此時的質粒中還需要有啟動子、終止子、標記基因等。除此以外，由于這個載體必須要能夠在受體細胞中自我復制，因此還會有一個復制原點。 如何構建基因的表達載體呢？其實就是將目的基因導入到載體質粒中去，因此第一步就是切，用限制酶切割質粒形成切口，然后用和切質粒一樣的限制酶或用能產生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，再利用DNA連接酶進行連接就可以形成一個重組的DNA分子，這個重組的DNA分子就是基因表達載體。 2、前面說應該用同一種限制酶切割載體和目的基因，現在又說應該用不同的限制酶切割載體和目的基因，兩種說法是否沖突？ —— 不沖突，用不同的酶是指不管是切割載體還是切割目的基因，最好都用兩種限制酶切，保證不管是載體還是目的基因，其本身左右兩側的切口不同，不會自身環化。 而為了保證目的基因和載體能連接，就要求不管目的基因用的什么種類的限制酶切，載體也應該用同一種限制酶，比如目的基因用酶1和酶2切，則載體也應該用酶1和酶2切。 【練習】3.下列關于基因表達載體構建的敘述，錯誤的是（ B ） A.啟動子是RNA聚合酶識別和結合的位點，組成它的基本單位是脫氧核苷酸 B.基因表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終止密碼子、標記基因等組件 C.人工構建的誘導型啟動子，當誘導物存在時，可激活或抑制目的基因的表達 D.由于受體細胞不同，基因表達載體的構建也有所差別 【總結】 適當拓展基因的分子結構，讓學生對后面了解載體可能具有的結構。 總結載體的各元件的作用。 結合動畫和板書引導學生構建基因表達載體。 通過真實的素材圖片強化學生的理解，引導學生思考切割以后的基因和質粒之間的連接存在的可能性有哪些。 即時訓練即時評價。 總結限制酶的選擇原則，加深學生的理解。
問題情境 教學活動設計 （學習活動設計） 設計意圖
構建好的基因表達載體如何導入到受體細胞中呢？ 通過用兩種不同的限制酶同時對質粒和目的基因進行切割，就可以得到正向連接的基因表達載體，構建好的基因表達載體如何導入受體細胞呢？請大家閱讀教材81-82頁并回答下列問題： 1.總結將目的基因導入受體細胞的方法有哪些，各個方法如何操作？各自適用于什么生物？ 2. 閱讀課本P81內容，寫出農桿菌轉化法的思路 將目的基因導入受體細胞的過程中，受體細胞可以是哪些種類？——可以是植物細胞、動物細胞或微生物細胞。其中導入植物細胞的方法有花粉管通道法和農桿菌轉化法，其中花粉管通道法是我國科學家獨創的，其中農桿菌轉化法是常用的將目的基因導入植物細胞的方法。將目的基因導入動物細胞一般用顯微注射法，如果導入到微生物細胞則用Ca2+轉化法。 將目的基因導入植物細胞 花粉管通道法： 原理：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進一步被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發育而成為帶轉基因的新個體。所以實質是將目的基因注入到了植物體的受精卵細胞中； 方法一：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 方法二：在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。 農桿菌轉化法 轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。實質是基因重組。 農桿菌能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有侵染能力。農桿菌細胞內含有Ti質粒，侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T-DNA轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。因此其操作流程大致為： 利用農桿菌轉化法將目的基因導入植物細胞時，可以導入體細胞也可以導入到受精卵細胞中。 按道理來講農桿菌轉化法應該更適用于將目的基因導入雙子葉植物和裸子植物中，但隨著技術的發展，也可以用農桿菌侵染水稻和玉米等單子葉植物。 將目的基因導入動物細胞 如果不是想要抗蟲棉或者抗病毒植物等，想要在豬體內獲得表達出胰島素的基因，即將人胰島素基因導入到豬體內進行表達，因此就涉及到將目的基因導入動物細胞中。常用的方法是顯微注射法。前面講體細胞核移植技術的時候，我們提到用顯微操作去核法除去卵母細胞的核，然后用顯微注射法將供體細胞注射到供體卵母細胞中。將目的基因導入到動物體中時候常用受精卵細胞為受體細胞，原因：①體積大，易操作。②易表現出全能性，也就是容易培養成完整個體。也就是將人胰島素基因的表達載體導入到豬的受精卵中，然后進行早期胚胎培養，再通過胚胎移植得到能夠產生人胰島素的豬。 將目的基因導入微生物細胞 我們在講發酵工程的時候就講過菌種的來源可以是基因工程，也就是將目的基因導入到菌種中。一般將目的基因導入微生物細胞常用的方法是Ca2+轉化法，一般先用Ca2+處理微生物細胞，可使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態。 微生物細胞常常指的是原核細胞，以大腸桿菌的利用最為頻繁。選擇大腸桿菌的目的是繁殖快，多為單細胞，遺傳物質相對較少，易于培養。 列表比較常用的三種方法： 學生自主閱讀回答問題，驅動學生自主學習能力，培養學生的閱讀能力、信息獲取能力。 教師逐一引導學生分析各種方法，并對其細節部分進行點評。 通過列表比較三種常見的目的基因導入方法，加深學生的印象，培養學生的比較分析能力、綜合理解能力。
問題情境 教學活動設計 （學習活動設計） 設計意圖
將表達載體導入受體細胞后，如何判斷導入是否成功？即使導入成功，如何判斷目的基因是否可以正常表達？ 以Bt基因表達載體為例，將表達載體導入受體細胞后，如何判斷導入是否成功？即使導入成功，如何判斷目的基因是否可以正常表達？判斷是否導入，也就是看受體細胞中是否有目的基因，是否表達也就要看是否表達出相關的蛋白質，可以從轉錄形成的mRNA和翻譯成的蛋白質兩個方面進行檢測，這些都是從分子水平進行的檢測；是否可以正常表達還需要從個體層面上檢測，我們可以用棉鈴蟲來放在這個轉基因的棉花植株上，看棉花是否抗棉鈴蟲，如果不被感染那就說明成功表達。 讓學生結合學過的基因表達相關的知識推出檢測與鑒定目的基因的幾個水平，可以促進他們對這一操作環節的理解，發展思維能力。
總結 學以致用：如何制備能生產人胰島素的大腸桿菌？ 引導學生對基因工程的基本操作程序有大致的了解。 培養學生的遷移應用能力和實驗設計能力。
3.2.2 DNA片段的擴增及電泳鑒定
問題情境 教學活動設計 （學習活動設計） 設計意圖
回顧舊知，導入新課 前面的學習中我們已經知道基因工程的基本操作程序主要包括四個步驟：目的基因的篩選和獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞以及目的基因的檢測與鑒定。其中基因表達載體的構建是核心工作。 回顧舊知，將基因工程的基本操作程序連接成線。
問題情境 教學活動設計 （學習活動設計） 設計意圖
DNA片段的PCR擴增技術與電泳鑒定方法是如何進行的？ 如果我們在體外進行PCR技術擴增，以及對擴增的產物進行鑒定應該如何進行呢？我們知道體外擴增DNA片段的方法是PCR技術，由于PCR技術中的產物有的并不是純凈的目的基因片段，因此還需要進行鑒定，鑒定的方法用瓊脂糖凝膠電泳法。我們先來了解一下實驗的原理。 實驗原理 DNA體外擴增的原理 PCR利用了DNA熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。由于PCR技術通過高溫加熱使雙鏈DNA雙鏈解旋，該過程不需要解旋酶的參與。雙鏈DNA在高溫下解開雙鏈的現象稱為DNA的變性，在降溫時，雙鏈又可以重新形成，說明DNA的熱變性是可逆的。 PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器，一次PCR一般要經歷30次循環。 （二）DNA片段電泳鑒定的原理 1、DNA分子具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。【由于絕大部分DNA是帶負電荷的，因此在移動的時候會發現基本都是往正極移動】 2、在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構像等有關。【其實應該也與所帶電荷有關，在這個過程中如果DNA分子所帶的電荷量都相等，DNA分子越大的話其實移動得越慢】 3、凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。 二、材料用具 1、儀器：PCR 儀、微量離心管、微量移液器、一次性吸液槍頭、電泳裝置（包括電泳儀電泳槽等） 2、材料：4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、擴增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等 三、實驗過程 （一）PCR擴增過程 離心的目的：在前面加樣的時候有的樣品是在管壁上的，將其離心集中在離心管的底部，可以提高反應速率。 預變性的目的：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合 教師播放視頻，學生對PCR技術的具體操作形成印象。 瓊脂糖凝膠電泳過程 配置瓊脂糖溶液：電泳緩沖液+瓊脂糖——沸水浴至瓊脂糖熔化——加入核酸染料； 制備凝膠：將瓊脂糖溶液倒入模具——插入梳子形成加樣孔——凝膠凝固——取出梳子將其放入電泳槽（電泳槽中的電泳緩沖液超過凝膠1mm） 加樣：PCR產物+凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合【凝膠載樣緩沖液指示劑的作用是用來指示電泳的進度，不能讓DNA跑到凝膠以外的緩沖液中】——加樣，留一個孔加標準參照物。 Marker標準參照物的作用：相當于一把標尺，會跑出很多條帶，這些條帶對應一定大小的核苷酸序列或者堿基序列，通過找到與樣品平齊的帶可判斷樣品的片段長度。 4、電泳、觀察：1~5V/cm 電泳——300nm紫外燈下觀察 教師播放視頻，加深學生印象。 【注意事項】 1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。 2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。 3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。 4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。 5.PCR擴增不能隨意加大試劑用量。 【探討·導學案P58】 探討點1.未出現擴增條帶的主要原因有哪些？ (1)TaqDNA聚合酶失活或濃度過低。 (2)引物出現質量問題。 (3)Mg2＋濃度過低。 (4)變性時的溫度低，變性時間短。 探討點2.出現非特異性擴增條帶的主要原因有哪些？【非特異性擴增即就是PCR擴增出來的條帶不是所需要的】 (1)模板DNA出現污染。 (2)引物特異性不強或引物設計不合理或引物過短。【引物設計不合理導致PCR在退火復性階段引物結合到多個基因位點上】 (3)Mg2＋濃度過高。【鎂離子的作用是激活DNA聚合酶活性，如果濃度過高，DNA聚合酶的活性會發生改變】 (4)復性時的溫度過低等。【GC含量是影響溫度設置的原因之一，如果目的基因的GC含量高，而在未達到完全解鏈溫度時，引物會以未完全解鏈的DNA為模板，進行PCR非特異性擴增。降低退火溫度，DNA復性減緩，增加非特異性互補的機會，使得非特異性條帶增多】 探討點3. 你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？ 【提示】可以通過在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。 探討點4.你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因。 【提示】如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當等。如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚體；退火溫度過低【GC含量是影響溫度設置的原因之一，如果目的基因的GC含量高，而在未達到完全解鏈溫度時，引物會以未完全解鏈的DNA為模板，進行PCR非特異性擴增。降低退火溫度，DNA復性減緩，增加非特異性互補的機會，使得非特異性條帶增多】；DNA聚合酶的質量不好等。 針對本節的難點之一：PCR產物的電泳鑒定，先用傳統的講解法讓學生對知識有了初步的認識，再以視頻的形式直觀地將瓊脂糖凝膠電泳的具體操作映入學生腦海，激發學生的學習興趣，強化學生對該內容的理解。 根據實驗設計方案及實施的具體操作流程，預測其實驗結果，并分析影響實驗結果的因素。
問題情境 教學活動設計 （學習活動設計） 設計意圖
練習 即時訓練即時評價(共16張PPT)
第3章 基因工程
第2節 基因工程的基本操作程序
DNA片段的擴增及電泳鑒定
DNA片段的擴增及電泳鑒定
1.DNA體外擴增的原理
PCR利用了DNA熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。
PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器，一次PCR一般要經歷30次循環。
2.DNA片段電泳鑒定的原理
DNA分子具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。
凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。
探究.實踐
DNA片段的擴增及電泳鑒定
（1）儀器
（2）材料
PCR 儀、微量離心管、微量移液器、一次性吸液槍頭、電泳裝置（包括電泳儀電泳槽等）
4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、擴增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等
PCR儀
微量離心管
微量移液器
電泳裝置
3、材料用具
探究.實踐
DNA片段的擴增及電泳鑒定
3、材料用具
PCR反應體系的配方 10倍濃縮的擴增緩沖液 5ul
20mmol/l 的4種脫氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
總體積 50ul
注：模板DNA的用量為1pg-1ug
探究.實踐
DNA片段的擴增及電泳鑒定
4、實驗步驟（PCR）
用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量移液管中依次加入各組分。
待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部。
參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。
移液
離心
擴增
探究.實踐
提高反應速率
預變性的目的：
使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合
DNA片段的擴增及電泳鑒定
4、實驗步驟（電泳鑒定）
根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。
將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。
配制瓊脂糖溶液
制備凝膠
探究.實踐
DNA片段的擴增及電泳鑒定
將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物（Marker）。
加樣
電泳、觀察
接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
4、實驗步驟（電泳鑒定）
探究.實踐
DNA片段的擴增及電泳鑒定
注意：
1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
5.PCR擴增不能隨意加大試劑用量。
探究.實踐
探討點1.未出現擴增條帶的主要原因有哪些？探討點2.出現非特異性擴增條帶的主要原因有哪些？探討點3. 你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？探討點4.你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因。(1)TaqDNA聚合酶失活或濃度過低。(2)引物出現質量問題。(3)Mg2＋濃度過低。(4)變性時的溫度低，變性時間短。(1)模板DNA出現污染。(2)引物特異性不強、引物設計不合理、引物過短。(3)Mg2＋濃度過高。(4)復性時的溫度過低等。可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當等。如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質量不好等。
(1)利用PCR擴增DNA片段時，在第一輪循環的變性之前，通常要用94 ℃的高溫處理反應液5 min進行預變性。( )
(2)PCR中離心的目的是讓反應組分在離心管中分層分布。( )
解析：PCR中離心的目的是讓反應組分集中分布在離心管的底部。
(3)電泳鑒定PCR產物時，應在每個加樣孔中加入等量的PCR產物與凝膠載樣緩沖液的混合液。( )
解析：電泳鑒定PCR產物時，應在一個加樣孔中加入指示分子大小的標準參照物，其他加樣孔中加入等量的PCR產物與凝膠載樣緩沖液的混合液。
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【基礎過關】
【典例】下列關于PCR的說法，錯誤的是(　　)
A.PCR是體外復制DNA的技術
B.PCR過程中只需要一個模板DNA、兩種引物分子、大量脫氧核苷酸原料
C.TaqDNA聚合酶要具有耐高溫的特點
D.PCR利用了DNA的熱變性原理
解析：PCR是體外復制DNA的技術，A正確；PCR過程中需要一種模板DNA、兩種引物分子、大量脫氧核苷酸原料，還需要擴增緩沖液、TaqDNA聚合酶等，B錯誤；TaqDNA聚合酶具有耐高溫的特點，C正確；PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合，D正確。
B
【變式訓練】用PCR方法檢測轉基因植株是否成功導入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標準樣液(Marker)，10號為蒸餾水。PCR時加入的模板DNA如圖所示。據此做出分析不合理的是(　　)
A.PCR產物的分子大小在250至500 bp之間
B.3號樣品為不含目的基因的載體DNA
C.9號樣品對應植株不是所需的轉基因植株
D.10號的電泳結果能確定反應體系等對實驗結果沒有干擾
B
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