資源簡介

第三章 基因工程
——高二生物學人教版（2019）期末復習知識大盤點
第一部分：學習目標整合
1. 認識三種基本工具，闡明重組DNA技術所需的三種基本工具的特點及作用。
2. 闡明基因工程的原理和基本操作程序。
3. 針對人類生產或生活中的某一需求，選取適當的基因工程的技術和方法，嘗試設計獲得某轉基因產品的方案。
4. 嘗試進行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產物。
5. 舉例說出基因工程在遺傳育種、疾病治療與生態環境保護方面的應用
6. 舉例說出蛋白質工程崛起的緣由，概述蛋白質工程的基本原理，簡述蛋白質工程已有的實際應用。
第二部分：教材習題變式
【教材課后習題】
1.某動物體內含有研究者感興趣的目的基因，研究者欲將該基因導入大腸桿菌的質粒中保存。該質粒含有氨芐青霉素抗性基因（AmpR）人、LacZ基因及一些酶切位點，其結構和簡單的操作步驟如下圖所示。
請根據以上信息回答下列問題。
（1）在第②步中，應怎樣選擇限制酶？
（2）在第③步中，為了使質粒DNA與目的基因能連接，還需要在混合物中加入哪種物質？
（3）選用含有AmpR和LacZ基因的質粒進行實驗有哪些優勢？
（4）含有重組質粒的大腸桿菌菌落將呈現什么顏色？為什么？
2.科學家將Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4基因通過逆轉錄病毒轉入小鼠成纖維細胞中，然后在培養ES細胞的培養基上培養這些細胞。2~3周后，這些細胞顯示出ES細胞的形態、具有活躍的分裂能力，它們就是iPS細胞。請回答下列問題。
（1）在這個實驗過程中，逆轉錄病毒的作用是什么？
（2）如何證明iPS細胞的產生不是由于培養基的作用？
（3）如果要了解Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4基因在誘導iPS細胞時，每個基因作用的相對大小，該如何進行實驗？請你給出實驗設計的思路。
（4）若將病人的皮膚成纖維細胞誘導成iPS細胞，再使它轉化為需要的細胞，用這些細胞給該病人治病，這是否會引起免疫排斥反應？為什么？iPS細胞具有分裂活性，用它進行治療時可能存在什么風險？
3.水稻根部一般沒有根瘤菌，在種植時常需要施加氮肥。科學家想利用基因工程技術來減少施用氮肥的生產成本及可能造成的環境污染，他們提出了以下兩種方案。
方案一把根瘤菌的固氮相關基因導入水稻根系微生物中，使微生物能在根系處固氮，從而減少氮肥的施用量。
方案二直接將固氮相關基因導入水稻細胞中，建立水稻的“小型化肥廠”，讓水稻直接固氮，這樣就可以免施氨肥了。
（1）請評估這兩種方案哪種更容易實現。
（2）如果兩個方案都實現的話，你認為哪種更值得推廣？請說出你的理由。
1.答案：（1）①應選擇酶切位點位于目的基因兩端的限制酶。②為了避免目的基因及質粒的自身環化、正向連接、反向連接，也可使用不同的限制酶（非同尾酶）切割目的基因所在片段和質粒。③切割質粒的限制酶不能同時切開質粒上的所有標記基因，即至少要保留一個標記基因，以用于重組DNA的鑒定和選擇。
（2）加入DNA連接酶。
（3）AmpR為氨芐青霉素抗性基因，在培養基中加入AmpR，沒有導入任何外源DNA的大腸桿菌不能在該培養基上生存。LacZ基因編碼的酶能分解X-gal產生藍色物質，若大腸桿菌菌落呈現藍色，則說明導入的是不含目的基因的空白質粒，AmpR和LacZ基因可以將成功導入目的基因的重組質粒篩選出來。
（4）白色。限制酶切割質粒時，會使LacZ基因破壞，含重組質粒的大腸桿菌不含LacZ基因，所以X-gal不會分解產生藍色物質，菌落呈現白色。
2.答案：（1）逆轉錄病毒相當于基因工程中的載體。
（2）可設立對照組：將正常的小鼠成纖維細胞放在培養ES細胞的培養基上培養，之后觀察是否出現iPS細胞。
（3）思路：將這4種基因分別導入小鼠的成纖維細胞，放在培養ES細胞的培養基上培養，觀察細胞的形態、分裂能力等，從而得出每一個基因作用的相對大小。
（4）不會，因為這些細胞來源于同一個體，遺傳物質都是相同的。iPS細胞具有分裂活性，這也是癌細胞具有的特點，可能iPS細胞會過度增殖。
3.答案：（1）方案一更容易實現，因為根瘤菌與水稻根系微生物的親緣關系更近。
（2）方案二更值得推廣，因為這種方法可以使水稻自己固氮，不受根系微生物的限制，同時含有的固氮基因還能遺傳給子代。
【變式訓練】
1.角蛋白酶（KerA）能降解角蛋白，在飼料工業中具有廣闊的應用前景。實驗小組將KerA基因導入大腸桿菌中，獲得了能高效表達KerA的工程菌，如圖表示KerA基因重組質粒的構建和篩選過程，（注：TikⅢ、BamHI、EcoRI和PstI表示限制酶，APr表示氨芐青霉素抗性基因，Ner表示新霉素抗性基因，大腸桿菌不含氨芐青霉素抗性基因和新霉素抗性基因）。請回答下列問題：
（1）構建重組質粒時宜選用___________兩種限制酶切割目的基因和質粒，而不選用另外兩種限制酶的原因是___________。
（2）將重組質粒導入大腸桿菌時要用___________處理大腸桿菌，目的是___________。大腸桿菌細胞作為原核細胞，常作為基因工程的受體細胞，其優點是___________（答出兩點）。
（3）影印接種就是用絲絨做成與平板大小相近的印章，然后把長有菌落的母平板倒置在絲絨印章上，輕輕印一下，再把此印章在新的培養基平板上輕輕印一下。經培養后，比較平板上長出的菌落與母平板上的菌落位置，推測可能導入了重組質粒的菌落。篩選重組質粒時，培養基甲應添加的抗生素是___________，培養基乙添加的抗生素是___________，根據圖示結果，從培養基甲中應選擇編號為___________的菌落進行選擇培養，其他菌落導入的是___________。
2.受到放射性污染的核廢水一旦排放入海，將對全球生態環境造成重大影響。某小組從耐輻射奇球菌中克隆出抗脅迫調節基因（pprⅠ基因），研究轉pprⅠ基因油菜對放射性污染物133Cs（銫）的吸收能力，結果如下表。回答下列各題：
133Cs濃度（mmoL·kg-1） 非轉基因 轉基因
地上部分含量（mg·g-1） 根系含量（mg·g-1） 地上部分含量（mg·g-1） 根系含量（mg·g-1）
05 1.39 1.73 1.24 2.11
10 2.79 4.42 2.37 4.59
5.0 6.30 6.37 4.58 9.69
10 8.77 10.02 7.55 12.54
（1）與細胞中DNA復制不同的是，利用PCR技術擴增pprⅠ基因時無需添加解旋酶，而是通過____________的方式使模板DNA解旋為單鏈。
（2）通常采用____________（酶）將pprⅠ基因與Ti質粒構建成基因表達載體。為檢測目的基因是否插入受體細胞的染色體DNA上，可采用________技術，以________為探針進行雜交。利用分子雜交技術檢測發現，某些受體植物細胞中的pprⅠ基因無法轉錄，其原因最可能是_________________________。
（3）由表可知，對133Cs污染的土壤進行生物修復時，應優先選擇轉pprⅠ基因油菜，其原因在于___________。在后續處理中，應加強對轉基因油菜__________（填“地上部分”或“根系”）的處理，這是因為_____________________。
3.棉花是重要的經濟纖維作物，土壤鹽分過高會對棉花的生產產生嚴重影響，因此篩選耐鹽棉花品種成為棉花農業生產中急需解決的問題。徑柳匙葉草液泡膜Na+/K+逆向轉運蛋白基因（TaNHX2基因）有利于提高植物的耐鹽能力，科研工作者將TaNHX2基因轉移到棉花細胞內，獲得了轉基因耐鹽棉花新品種。回答下列問題：
（1）科研人員在獲得TaNHX2基因對應的核苷酸序列時，利用DNA合成儀直接合成目的基因，該種獲取目的基因的方法為_____。
（2）構建基因表達載體時，科研人員將TaNHX2基因整合到土壤農桿菌的Ti質粒上，一般用相同的限制酶切割目的基因和Ti質粒的_____片段，目的是_____。構建成功的基因表達載體應含有啟動子、終止子、_____（答出三種）等結構。
（3）轉化后的棉花細胞進行組織培養發育成完整植株，組織培養常用的培養基所含有的主要成分除了水、無機營養成分和有機營養成分外，還有_____（答出兩種）等。
（4）為了檢測技術成果，科研工作者在個體水平上的檢測方法是_____。
1.答案：（1）EcoRI和PstI；TikⅢ會破壞質粒的復制原點，而BamHI會破壞目的基因
（2）Ca2+；使大腸桿菌處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態；細胞結構簡單、繁殖速度快、遺傳物質相對較少
（3）新霉素；氨芐青霉素；b、c；不含目的基因的普通質粒
解析：（1）構建重組質粒時需要切割含目的基因的DNA片段和質粒，分析圖示可知，應該用EcoRI和PstI兩種限制酶同時進行切割，不使用其他兩種酶切割的原因是TihⅢ會破壞質粒的復制原點，而BamHI會破壞目的基因。
（2）將外源DNA分子導入大腸桿菌前要用鈣離子處理大腸桿菌，目的是增大大腸桿菌細胞膜的通透性，使大腸桿菌處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的感受態。原核細胞作為基因工程的受體細胞的優點在于細胞結構簡單、繁殖速度快。遺傳物質相對較少。
（3）PstI進行切割時破壞質粒上的氨芐青得素抗性基因，根據圖示可知，b和c菌落能在培養基甲中增殖，但不能在培養基乙中增殖。因此培養甲添加的是新霉素，培養基乙添加的是氨芐青霉素。b、c菌落不能在培養基乙中生長，說明其插入了目的基因，質粒上的氨芐青霉素抗性基因被破壞；質粒上含有新霉素抗性基因的菌落僅僅能在新霉素培養基上增殖，因此其他菌落插入的是不含目的基因的普通質粒。
2.答案：（1）加熱到90-95℃（高溫）
（2）限制酶和DNA連接酶；DNA分子雜交；放射性同位素標記目的基因；pprⅠ基因在Ti質粒上的插入位點不在啟動子和終止子之間
（3）轉基因油菜整株植物（地上部分和根系）中的133Cs吸收量大于非轉基因油菜；根系；轉基因油菜的根系中133Cs吸收量大于地上部分
解析：（1）在體外利用PCR技術擴增目的基因時，利用DNA的高溫變性加熱至90-95℃，破壞雙鏈之間的氫鍵，使 DNA解鏈變為單鏈。
（2）基因工程在構建基因表達載體時，通常用限制酶和DNA連接酶將pprⅠ基因與Ti質粒連接成重組質粒；DNA分子雜交是指以放射性同位素標記目的基因為探針，進行雜交，若出現雜交帶則說明含有目的基因，若沒有出現則說明目的基因未轉入；啟動子和終止子分別控制轉錄的起始和終止，某些受體植物細胞中的pprⅠ基因無法轉錄，其原因可能是pprⅠ基因在Ti質粒上的插入位點不在啟動子和終止子之間，無法啟動正常的轉錄過程。
（3）由表可知，轉基因油菜整株植物（地上部分和根系）中的133Cs吸收量大于非轉基因油菜，有利于對 133Cs污染的土壤進行生物修復；由于轉基因油菜根系對 133Cs的吸收量大于地上部分，在后續處理中，應加強對轉基因油菜根系的處理。
3.答案：（1）化學合成法
（2）T-DNA；有利于目的基因和載體形成相同的末端，以便于目的基因和載體的連接；目的基因、標記基因、復制原點
（3）瓊脂、植物激素
（4）將轉基因棉花種植在鹽堿地上，觀察其生長狀況
解析：（1）獲取目的基因的方法有從基因文庫中獲取、PCR擴增和化學合成法等，通過DNA合成儀直接人工合成屬于化學合成法。
（2）對于棉花通常采用農桿菌轉化法將目的基因轉移至受體細胞。將目的基因整合到農桿菌的Ti質粒的T-DNA上，可使目的基因在農桿菌感染植物細胞的過程中隨著T-DNA整合到受體細胞染色體DNA上，隨受體細胞DNA進行復制和表達。因此在構建基因表達載體時，一般用相同的限制酶切割目的基因和Ti質粒的T-DNA片段，目的是有利于目的基因和載體形成相同的末端，以便于目的基因和載體的連接。構建成功的基因表達載體應含有啟動子、終止子、目的基因、標記基因、復制原點等結構。
（3）植物組織培養常用的培養基所含有的主要成分除了水、無機營養成分和有機營養成分外，還有瓊脂、植物激素等。
（4）結合目的基因的功能，人們可將轉基因棉花種植在鹽堿地上，觀察其生長狀況，從而在個體水平上檢測目的基因是否成功表達。
第三部分：重難知識易混易錯
一、基因工程的概念與原理
1.基因工程的概念
（1）操作場所：生物體外。
（2）操作技術：轉基因等技術。
（3）操作結果：賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。
（4）操作水平：DNA分子水平。
2.基因工程的原理
基因工程的基本原理是讓人們感興趣的基因（目的基因）在宿主細胞中穩定和高效地表達。
具體地說，基因工程就是在DNA分子水平上對基因進行操作的復雜技術，是將外源基因通過體外重組后導入受體細胞，使這個基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯表達的操作。
3.基因工程的誕生和發展
（1）基因工程的誕生
①1944年，艾弗里等人通過肺炎鏈球菌轉化實驗證明了遺傳物質是DNA，還證明了DNA可以在同種生物的不同個體之間轉移。
②1953年，沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結構模型并提出了遺傳物質自我復制的假說。
③1961年，尼倫伯格和馬太破譯了第一個編碼氨基酸的密碼子。
④20世紀70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉錄酶被相繼發現，為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創造了條件。
⑤1973年，科學家證明質粒可以作為基因工程的載體，構建重組DNA，使外源基因在原核細胞中成功表達，并實現物種間的基因交流。
（2）基因工程的發展
①1982年，第一個基因工程藥物——重組人胰島素被批準上市。
②1984年，我國科學家朱作言領導的團隊培育出世界上第一條轉基因魚。
③1985年，穆里斯等人發明PCR，為獲取目的基因提供了有效手段。
④1990年，人類基因組計劃啟動。2003年，該計劃的測序任務順利完成。
⑤21世紀以來，科學家發明了多種高通量測序技術，可以實現低成本測定大量核酸序列，加速了人們對基因序列的了解。
⑥2013年，華人科學家張鋒及其團隊首次報道利用最新的基因組編輯技術編輯了哺乳動物基因組。
【例】下列敘述符合基因工程概念的是（ )
A.在細胞內直接將目的基因與宿主細胞的遺傳物質進行重組，賦予生物新的遺傳特性
B.將人的干擾素基因與質粒重組后導入大腸桿菌，獲得能產生人的干擾素的菌株
C.用紫外線照射青霉菌，使其DNA發生改變，通過篩選獲得青霉素高產菌株
D.自然界中天然存在的噬菌體自行感染細菌后，其DNA整合到細菌DNA上
答案：B
解析：基因工程又叫DNA重組技術，是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，并通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性，從而創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。基因工程不能在生物細胞內直接將目的基因與宿主細胞的遺傳物質進行重組，A不符合基因工程的概念；將人的干擾素基因與質粒重組后導入大腸桿菌，獲得能產生人的干擾素的菌株，B符合基因工程的概念；用紫外線照射青霉菌，使其DNA發生改變，通過篩選獲得青霉素高產菌株，屬于誘變育種，C不符合基因工程的概念；自然界中天然存在的噬菌體自行感染細菌，并將自身DNA整合到細菌DNA上，屬于基因重組，D不符合基因工程的概念。
二、DNA重組技術的基本工具
1.限制性內切核酸酶（又稱限制酶）——“分子手術刀”
（1）來源：主要來自原核生物。
（2）功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。
（3）結果：產生黏性末端或平末端。
（4）應用：已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ識別的堿基序列和酶切位點分別為G↓AATTC和CCC↓GGG，在圖中寫出兩種限制酶切割DNA后產生的末端并寫出末端的種類。
EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶識別的堿基序列不同，切割位點不同（填“相同”或“不同”），說明限制酶具有專一性。
2.DNA連接酶——“分子縫合針”
（1）作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
（2）種類
種類 E·coli DNA連接酶 T4 DNA連接酶
來源 大腸桿菌 T4噬菌體
特點 縫合黏性末端 縫合黏性末端和平末端
作用 縫合雙鏈DNA片段，恢復兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵
3.基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
（1）種類
①質粒：常存在于原核細胞和酵母菌中，是一種分子質量較小的、環狀的、裸露的DNA分子，獨立于擬核之外。
②λ噬菌體的衍生物和動植物病毒等。
（2）目的
①將目的基因轉運到宿主細胞中去。
②在受體細胞內對目的基因進行大量復制。
（3）必備條件
①在宿主細胞中保存下來并大量復制。
②有多個限制酶切割位點。
③有一定的標記基因，便于篩選。
④對受體細胞無害。
4.重組DNA分子的模擬操作
（1）材料用具：剪刀代表EcoRⅠ，透明膠條代表DNA連接酶。
（2）切割位點：
①分別從兩塊硬紙板上的一條DNA鏈上找出—GAATTC—序列，并選G—A之間作切口進行“切割”。
②再從另一條鏈上互補的堿基之間尋找EcoR Ⅰ相應的切口剪開。
（3）操作結果：若操作正確，不同顏色的黏性末端應能互補配對；否則，說明操作有誤。
5.DNA的粗提取與鑒定
（1）實驗原理
①DNA不溶于酒精，蛋白質溶于酒精。
②DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2_mol/L的NaCl溶液。
③在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色。
（2）實驗步驟
稱取30 g洋蔥，切碎，加入10 mL研磨液，充分研磨。
↓
漏斗中墊紗布，將研磨液過濾到燒杯中，4 ℃處理，取上清液。
↓
在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液，靜置2～3 min，用玻璃棒沿同一方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去水分。
↓
取兩支20 ml的試管編號A、B，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL，將絲狀物溶于B試管的NaCl溶液中。然后向兩支試管中各加入4 mL的二苯胺試劑。混勻后，將試管置于沸水中加熱5 min。
↓
結果觀察：A試管不變藍，B試管變藍色。
【例】下列有關限制性內切核酸酶的敘述，正確的是（ )
A.用限制性內切核酸酶切割一個DNA分子中部，獲得一個目的基因時，被水解的磷酸二酯鍵有2個
B.限制性內切核酸酶識別序列越短，則該序列在DNA中出現的概率就越大
C.—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制性內切核酸酶切出的黏性末端可用DNA連接酶連接
D.只有用相同的限制性內切核酸酶處理含目的基因的片段和質粒，才能形成重組質粒
答案：B
解析：用限制性核酸內切酶切割一個DNA分子中部，獲得一個目的基因時，需要切割目的基因的兩側，又因DNA為雙鏈結構，因此要斷裂4個磷酸二酯鍵，即被水解的磷酸二酯鍵有4個，A錯誤；限制性核酸內切酶識別序列越短，則該序列在DNA中出現的概率就越大，B正確；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制性核酸內切酶切出的黏性末端不同，分別為—CATG和—CTAG，因此不能用DNA連接酶連接，C錯誤；用不同的限制性核酸內切酶處理含目的基因的DNA片段和質粒，若產生的黏性末端相同，則也能形成重組質粒，D錯誤。
三、基因工程的基本操作程序
目的基因的篩選與獲取
1.目的基因
（1）概念：用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因。
（2）實例：培養轉基因抗蟲棉用到的目的基因是Bt抗蟲蛋白基因。
2.篩選合適的目的基因
（1）較為有效的方法：從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選。
（2）實例：在培育轉基因抗蟲棉之前，科學家不僅掌握了Bt基因的序列信息，也對Bt基因的表達產物——Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解。
（3）認識基因結構和功能的技術方法：DNA測序技術、遺傳序列數據庫、序列比對工具。
3.利用PCR獲取和擴增目的基因
（1）PCR的含義：PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫，它是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。
（2）條件：DNA模板、分別與兩條模板鏈結合的2種引物、四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶。
（3）過程：
①變性：溫度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受熱變性后解為單鏈。
②復性：溫度下降到50 ℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。
③延伸：溫度上升到72 ℃左右時，溶液中四種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子鏈。
④重復循環多次。
（4）結果：每次循環后目的基因的量增加一倍，即呈指數形式擴增（約為2n）。
基因表達載體的構建與將目的基因導入受體細胞
1.基因表達載體的構建——核心
（1）構建基因表達載體的目的
①使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代。
②使目的基因能夠表達和發揮作用。
2.基因表達載體的組成
兩子啟動和終止；目的基因在中間；標記基因來篩選。
3.基因表達載體的功能
（1）使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代。
（2）使目的基因表達和發揮作用。
將目的基因導入受體細胞
1.轉化含義：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。
2.轉化方法
（1）導入植物細胞
（1）農桿菌轉化法：將目的基因導入雙子葉植物和裸子植物。
（2）基因槍法：將目的基因導入單子葉植物常用的方法。
（3）花粉管通道法：我國科學家獨創的一種方法。
（2）導入動物細胞
①常用方法：顯微注射技術。
②常用受體細胞：受精卵。
（3）導入微生物細胞
①方法
a.用Ca2＋處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態（這種細胞稱為感受態細胞）。
b.感受態細胞吸收重組表達載體DNA分子。
②受體細胞：原核細胞（使用最廣泛的是大腸桿菌）。
③原核生物的特點：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少等。
目的基因的檢測與鑒定
1.分子水平檢測
（1）檢測轉基因生物DNA上是否插入了目的基因。
方法：DNA分子雜交技術。
（2）檢測目的基因是否轉錄出mRNA。
方法：分子雜交技術。
（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質。
方法：抗原—抗體雜交技術。
2.個體水平鑒定
包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性及抗性程度。基因工程產品需要與天然產品活性進行比較等。
【例】研究人員欲從酵母菌中獲取某種酶的基因，并導入棉株表達，下列敘述不正確的是（ )
A.可用PCR技術在短時間內獲得大量編碼該酶的基因
B.以酵母菌中有關mRNA為模板合成目的基因的過程為逆轉錄
C.應使用PCR技術檢驗基因是否成功在棉株中表達
D.如果銷售這種轉基因棉籽榨成的油，應當在包裝上標明其原料為轉基因農作物
答案：C
解析：利用PCR技術可以在短時間內獲得大量目的基因，A正確；酵母菌的遺傳物質是DNA，以mRNA為模板合成DNA的過程為逆轉錄，B正確；目的基因是否成功在棉株中表達要看棉株中是否產生了相應的酶，可用抗原—抗體雜交技術檢驗，C錯誤；根據我國的有關規定，用轉基因生物加工成的產品，應當進行標識，保護消費者知情權，D正確。
四、基因工程在農牧業方面的應用
1.發展
（1）農牧業：1996—2017年，全世界轉基因作物的種植面積增加了一百多倍，美國是世界上轉基因作物種植面積最大的國家。2017年，我國轉基因作物種植面積居世界第八位。
（2）動物：第一種用于食用的轉基因動物——轉基因大西洋鮭在美國獲得批準上市。
2.實例
（1）轉基因抗蟲植物
①技術方法：從某些生物中分離出具有抗蟲功能的基因，將它導入作物中，培育出具有抗蟲性的作物。
②實例：抗蟲棉花、玉米、大豆、水稻和馬鈴薯等。
（2）轉基因抗病植物
①技術方法：將來源于病毒、真菌等的抗病基因導入植物中，培育出轉基因抗病植物。
②實例：轉基因抗病毒甜椒、番木瓜和煙草等。
（3）轉基因抗除草劑植物
①技術方法：將降解或抵抗某種除草劑的基因導入作物，可培育抗除草劑的作物品種。
②實例：轉基因抗除草劑玉米、大豆、油菜和甜菜等。
（4）改良植物的品質
①技術方法：將必需氨基酸含量多的蛋白質編碼基因導入植物中，可以提高這種氨基酸的含量。
②實例：轉基因玉米中賴氨酸的含量比對照高30%。
（5）提高動物的生長速率
①技術方法：將外源生長激素基因導入動物體內，提高動物的生長速率。
②實例：轉基因鯉魚。
（6）改善畜產品的品質
①技術方法：將腸乳糖酶基因導入奶牛基因組。
②實例：乳汁中乳糖含量大大降低的轉基因奶牛。
【例】下列關于植物基因工程應用的說法，錯誤的是（ )
A.將動物的某種蛋白質基因導入植物體中用來生產該蛋白質
B.植物基因工程可用來培育高產、穩產、品質優良和抗逆性強的作物
C.利用基因工程可以改造植物細胞的基因，使其能夠生產人類所需要的藥物
D.通過植物基因工程培育的抗蟲植物必然可以抗病毒
答案：D
解析：所有生物共用一套遺傳密碼，因此將動物的某種蛋白質基因導入植物體中可生產該蛋白質，A正確；可以將抗逆性強、高產等基因導入植物體內，培育出具有相應優良性狀的作物，B正確；利用基因工程可以改造植物細胞的基因，使其能夠生產人類所需要的藥物，例如紫草寧等，C正確；通過基因工程培育的抗蟲植物只能抗某種或某類蟲害，不能抗病毒，D錯誤。
五、基因工程在醫藥衛生領域以及食品工業方面的應用
1.基因工程在醫藥衛生領域的應用
（1）技術方法
①生產藥物
a常見的藥物：細胞因子、抗體、疫苗和激素等。我國生
產的重組人干擾素、血小板生成素、促紅細胞生成素和粒細胞集落刺激因子等基因工程藥物均已投放市場。
b批量生產藥物：乳腺（房）生物反應器。
目的基因：藥用蛋白基因。
啟動子：乳腺中特異性表達的基因的啟動子。
受體細胞：受精卵。
②培育移植器官：在器官供體的基因組中導入某種調節因子抑制抗原決定基因的表達或設法除去抗原決定基因，然后再結合克隆技術，培育出不會引起免疫排斥反應的轉基因克隆器官。
2.基因工程在食品工業方面的應用
（1）技術方法：利用基因工程菌生產食品工業用酶、氨基酸和維生素等。例如將編碼牛凝乳酶的基因導入大腸桿菌、黑曲霉或酵母菌的基因組中，再通過工業發酵生產凝乳酶。
（2）實例：淀粉酶、脂酶、天冬氨酸和苯丙氨酸。
【例】下列關于基因工程在食品工業方面的應用的敘述，錯誤的是（ )
A.用于形成阿斯巴甜的主要氨基酸可以通過基因工程大規模生產
B.基因工程獲得凝乳酶時，需將編碼凝乳酶的基因導入受體菌的基因組中
C.相比從天然產物中提取的酶，用基因工程技術獲得的工業用酶的純度較低
D.生產淀粉酶和脂酶時，可通過構建工程菌，用發酵技術大量生產
答案：C
解析：阿斯巴甜主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，這兩種氨基酸可以通過基因工程大規模生產，A正確；基因工程獲得凝乳酶時，需將編碼凝乳酶的基因導入受體菌，如大腸桿菌、黑曲霉等的基因組中，B正確；相比從天然產物中提取的酶，用基因工程技術獲得的工業用酶的純度較高，C錯誤；生產淀粉酶和脂酶時，可通過構建工程菌，用發酵技術大量生產，D正確。
六、蛋白質工程
1.蛋白質工程崛起的緣由
基因工程的不足
（1）基因工程的實質：將一種生物的基因轉移到另一種生物體內，后者可以產生它本不能產生的蛋白質，進而表現出新性狀。
（2）不足：在原則上只能生產自然界已存在的蛋白質。
天然蛋白質的不足
（1）天然蛋白質的結構和功能符合特定物種生存的需要，卻不一定完全符合人類生產和生活的需要。
（2）對天然蛋白質進行改造，應該從對基因的操作來實現，主要原因如下：
①任何一種天然蛋白質都是由基因編碼的，改造了基因即對蛋白質進行了改造，而且改造過的基因可以遺傳下去。如果對蛋白質直接改造，即使改造成功，被改造過的蛋白質分子還是無法遺傳。
②對基因進行改造比對蛋白質直接改造要容易，難度要小得多。
蛋白質工程的崛起
（1）理論和技術條件：分子生物學、晶體學以及計算機技術的迅猛發展。
（2）實例
蛋白質缺陷 改造措施 改造后效果
玉米中賴氨酸含量低 賴氨酸合成中兩種酶的氨基酸被替換 玉米葉片和種子中游離賴氨酸分別提高5倍和2倍
2.蛋白質工程的基本原理
概念
（1）基礎：蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系。
（2）手段：通過基因改造或基因合成，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質。
（3）目的：獲得滿足人類的生產和生活需求的蛋白質。
與基因工程的關系：在基因工程的基礎上，延伸出來的第二代基因工程。
原理
（1）目標：根據人們對蛋白質功能的特定需求，對蛋白質的結構進行設計改造。
（2）方法：改造基因或合成基因。
（3）流程：預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質。
蛋白質工程流程圖
3.蛋白質工程的應用
醫藥工業方面
（1）速效胰島素類似物：改變氨基酸序列，抑制胰島素的聚合。
（2）干擾素：一個半胱氨酸替換為絲氨酸，延長保存時間。
（3）單克隆抗體：將小鼠抗體上結合抗原的區域“嫁接”到人的抗體上，降低誘發免疫反應的強度。
其他工業方面：廣泛用于改進酶的性能或開發新的工業用酶。如枯草桿菌蛋白酶。
農業方面
（1）改造某些參與調控光合作用的酶，提高植物光合作用的效率。
（2）改造微生物蛋白質的結構，增強防治病蟲害的效果。
【例】如何更快速、準確地確定蛋白質的三維空間結構，這一直是生命科學領域的研究熱點和難點。人工智能程序AlphaFold2對大部分蛋白質結構的預測極為精準，接近真實的蛋白質結構，達到了人類利用冷凍電鏡等復雜儀器觀察預測的水平。下列相關敘述不正確的是（ )
A.蛋白質的氨基酸序列是預測其空間結構的重要基礎
B.預測、設計并制造新蛋白質的技術屬于蛋白質工程
C.結構預測有助于人們揭示蛋白質分子間相互作用的機制
D.依據新蛋白質的氨基酸序列能推出唯一的基因序列
答案：D
解析：天然蛋白質合成過程中要先形成具有特定氨基酸序列的多肽鏈，再形成具有高級結構的蛋白質，蛋白質的氨基酸序列是預測其空間結構的重要基礎，A正確；蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過改造或合成基因來改造現有蛋白質，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類生產和生活的需求，預測、設計并制造新蛋白質的技術屬于蛋白質工程，B正確；結構決定功能，結構預測有助于人們了解蛋白質如何行使其功能，揭示蛋白質分子間相互作用的機制，C正確；一個氨基酸對應的密碼子可能有多個，因此依據新蛋白質的氨基酸序列可能推出多個基因序列，D錯誤。
第四部分：核心素養對接高考
本專題多以最新科技信息材料的形式，結合細胞工程與胚胎工程進行考查。主要考查內容有：基因工程工具的作用和特點、基因工程操作步驟、基因工程在工農業生產和實踐中的應用。
【2023·山東卷】1.科研人員構建了可表達J-V5融合蛋白的重組質粒并進行了檢測，該質粒的部分結構如圖甲所示，其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。
（1）與圖甲中啟動子結合的酶是________。除圖甲中標出的結構外，作為載體，質粒還需具備的結構有________（答出2個結構即可）。
（2）構建重組質粒后，為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物_________。已知J基因轉錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的________（填“a鏈”或“b鏈”）相應部分的序列相同。
（3）重組質粒在受體細胞內正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應蛋白是否表達以及表達水平，結果如圖乙所示。其中，出現條帶l證明細胞內表達了________，條帶2所檢出的蛋白________（填“是”或“不是”）由重組質粒上的J基因表達的。
【2023·湖北卷】2.用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環素抗性基因（TetR）作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體（重組質粒），并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（ )
A.若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環素）培養基中的菌落，不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否
D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養基中能形成菌落
【2023·廣東卷】3.種子大小是作物重要的產量性狀。研究者對野生型擬南芥（2n=10）進行誘變，篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序，發現野生型DA1基因發生一個堿基G到A的替換，突變后的基因為隱性基因，據此推測突變體的表型與其有關，開展相關實驗。
回答下列問題：
（1）擬采用農桿菌轉化法將野生型DA1基因轉入突變體植株，若突變體表型確由該突變造成，則轉基因植株的種子大小應與_________植株的種子大小相近。
（2）用PCR反應擴增DA1基因，用限制性核酸內切酶對PCR產物和_________進行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DA1基因可以正常表達，其上下游序列需具備_________。
（3）轉化后，T-DNA（其內部基因在減數分裂時不發生交換）可在基因組單一位點插入也可以同時插入多個位點。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單一位點插入的植株，并進一步獲得目的基因穩定遺傳的植株（如圖），用于后續驗證突變基因與表型的關系。
①農桿菌轉化T0代植株并自交，將T1代種子播種在選擇培養基上，能夠萌發并生長的陽性個體即表示其基因組中插入了_________。
②T1代陽性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養基，選擇陽性率約_________%的培養基中幼苗繼續培養。
③將②中選出的T2代陽性植株_________（填“自交”、“與野生型雜交”或“與突變體雜交”）所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養基，陽性率達到_________%的培養基中的幼苗即為目標轉基因植株。
為便于在后續研究中檢測該突變，研究者利用PCR擴增野生型和突變型基因片段，再使用限制性核酸內切酶X切割產物，通過核酸電泳即可進行突變檢測，相關信息見下圖，在電泳圖中將酶切結果對應位置的條帶涂黑。
【2023·天津卷】4.某植物四號染色體上面的A基因可以指導植酸合成，不能合成植酸的該種植物會死亡。現有A3-和A25-兩種分別由A基因缺失3個和25個堿基對產生的基因，已知前者不影響植酸合成，后者效果未知。
（1）現有基因型為AA25-的植物，這兩個基因是_______基因。該植物自交后代進行PCR，正向引物與A25-缺失的堿基配對，反向引物在其下游0.5kb處，PCR后進行電泳，發現植物全部后代PCR產物電泳結果均具有明亮條帶，原因是______________，其中明亮條帶分為較明亮和較暗兩種，其中較明亮條帶代表基因型為_______的植物，比例為_______。
（2）將一個A基因導入基因型為A3-A25-的植物的6號染色體，構成基因型為A3-A25-A-的植物、該植物自交子代中含有A25-A25-的比例是_______。
（3）在某逆境中，基因型為A3-A3-的植物生存具有優勢，現有某基因型為A3-A的植物，若該種植物嚴格自交，且基因型為A3-A3-的植物每代數量增加10%，補齊下面的表格中，子一代基因頻率數據（保留一位小數）：
代 親代 子一代 子二代
A基因頻率 50% _______% 46.9%
A3-基因頻率 50% _______% 53.1%
基因頻率改變，是_______的結果。
1.答案：（1）RNA聚合酶；限制酶切位點、標記基因、復制原點等
（2）F1和R2；a
（3）標簽短肽V5；不是
2.答案：D
解析：若用HindⅢ酶切質粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA連接酶將兩者連接成重組質粒，目的基因和質粒有正向連接和反向連接兩種連接形式，因此，目的基因轉錄的產物可能不同，A正確；若用PvuⅠ酶切，會破壞氨芐青霉素抗性基因，在含Tet（四環素）培養基中的菌落可能是含有目的基因的重組質粒，也可能是質粒自身連接的普通質粒，因此，在含Tet（四環素）培養基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；若用SphⅠ酶切，由于重組質粒和普通質粒的堿基對數不同，因此可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否，C正確；若用SphⅠ酶切，會破壞四環素抗性基因，氨芐青霉素抗性基因不受影響，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）的培養基中能形成菌落，不能在含Tet（四環素）的培養基中形成菌落，D錯誤。
3.答案：（1）野生型
（2）Ti質粒；啟動子和終止子
（3）①DA1基因（和卡那霉素抗性基因）；②75；③自交；100；如圖所示
解析：（1）據題干信息可知，突變體是由野生型DA1基因發生隱性突變形成的，采用農桿菌轉化法將野生型DA1基因轉入突變體植株，若突變體表型確由隱性突變造成，由于轉入的基因為顯性基因，則轉基因植株的種子大小應與野生型植株的種子大小相近。
（2）構建基因表達載體時，需要用限制性核酸內切酶對經過PCR擴增的DA1基因和作為運載體的Ti質粒進行切割。為確保插入的DA1基因可以正常表達，DA1基因（目的基因）的上下游需具備啟動子和終止子。
（3）①卡那霉素抗性基因為標記基因，標記基因的作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細胞篩選出來。用農桿菌轉化T0代植株并自交，將T1代種子播種在含有卡那霉素的培養基上，能夠萌發并生長的陽性個體即表示其基因組中插入了DA1基因（和卡那霉素抗性基因）。②假設DA1基因用A表示，結合題中信息知，T1代中能在含有卡那霉素的培養基上生長的植株的基因型為Aa或AA或多位點插入，T1代陽性植株自交所得T2代種子按單株收種并播種于含有卡那霉素的培養基上，T1代陽性植株基因型為Aa時，該植株上所結種子有75%能夠萌發并長成幼苗，因此，應選擇陽性率約為75%的培養基中幼苗繼續培養。③T2代陽性植株的基因型為1/3AA、2/3Aa，將②中選出的T2代陽性植株自交，所得的T3代種子按單株收種并播種于含有卡那霉素的培養基上，基因型為AA的植株自交，其后代不會發生性狀分離，在含有卡那霉素的培養基上，所有種子都能夠萌發并生長，而基因型為Aa的植株自交，其后代會發生性狀分離，在含有卡那霉素的培養基上部分種子不能萌發，因此陽性率達到100%的培養基中的幼苗為純合子（AA），即目標轉基因植株。分析題圖可知，野生型相關基因中不含限制性核酸內切酶X的識別序列，不能被該酶切割，已知DA1基因的長度為150bp，因此，野生型相關基因被限制性核酸內切酶X切割并電泳后得到的條帶為150bp。突變型相關基因中含有限制性核酸內切酶X的識別序列，用該酶切割后，突變基因被切割成100bp、50bp兩種DNA片段，經電泳后得到的條帶為100bp和50bp。突變型和野生型相關基因經限制性核酸內切酶X切割并電泳后得到的結果如圖所示。
4.答案：（1）等位；自交后代中基因型為A25-A25-的個體死亡，基因型為A25-A和AA的個體由于都至少含有一個A基因，因此可以與正向引物和反向引物結合進而完成PCR，獲得明亮條帶；AA；1/3
（2）1/5
（3）48.8%；51.2%；自然選擇
解析：（1）由題干可知，A25-基因是由A基因缺失25個堿基對產生的基因，即A基因通過基因突變產生A25－基因，因此二者屬于等位基因。基因型為AA25-的植物自交后代的基因型及其比例為AA：AA25-：A25-A25-=1：2：1。當對這些后代進行PCR時，正向引物與A25-缺失的堿基配對，反向引物在其下游0.5kb處，可推知缺失這25個堿基對的A25-基因無法與正向引物配對從而不能擴增，因此只含有A25－基因的個體（即A25-A25-）不具有條帶；含有這25個堿基對的A基因才能與正向引物和反向引物都進行堿基互補配對從而擴增出條帶，因此基因型為AA、AA25－的個體均具有條帶，且A基因個數越多，擴增產物越多，條帶越明亮，因此基因型為AA的個體具有較明亮的條帶，基因型為AA25-的個體具有較暗的條帶。由題干可知，該植物的全部后代都具有明亮條帶，說明基因型為A25-A25-的個體無法存活，只有基因型為AA和AA25－的個體能夠存活下來，并進行了PCR擴增產生了條帶，因此較明亮條帶代表基因型為AA，占比為1/3。
（2）已知基因A3-和A25-都在4號染色體上，再導入一個A基因至6號染色體上，由于它們位于不同對染色體上，故該植物在減數分裂產生配子時，遵循基因自由組合定律，產生配子的基因型為A3-A、A25-A、A3-、A25-，比例各自占1/4；該植物自交后代中基因型為A25-A25-=1/4×1/4=1/16的個體死亡，存活個體占1-1/16=15/16，含有A25-A25-的后代個體基因型有2種，分別是AAA25-A25-=1/4×1/4=1/16，AA25-A25-=1/4×1/4×2=2/16，二者共占3/16，因此該植物自交子代中含有A25-A25-的比例是3/16÷5/16=1/5。
（3）基因型為A3-A的植物自交產生子一代的基因型及比例為AA=1/4，A3-A=1/2，A3-A3-=1/4，由題干可知，基因型為A3-A3-的植物每代數量增加10%，則子一代中A3-A3-=1/4+1/4×10%=11/40，因此子一代中AA:A3-A:A3-A3-=1/4：1/2：11/40=10:20:11，可計算出三者的基因型頻率分別是AA=10÷（10+20+11）=10/41，A3-A=20÷（10+20+11）=20/41，A3-A3-=11÷（10+20+11）=11/41，可進一步計算出子一代中A基因頻率=10/41+1/2×20/41=48.8%，A3-基因頻率=11/41+1/2×20/41=51.20%。自然選擇導致具有有利變異的個體存活并由更大幾率產生更多后代，導致后代中決定有利變異的基因頻率增大，而具有不利變異的個體則會被自然選擇淘汰，因此決定不利變異的基因頻率減小，因此基因頻率的改變是自然選擇的結果。

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