資源簡介

第一章 發酵工程
——高二生物學人教版（2019）期末復習知識大盤點
第一部分：學習目標整合
1.
簡述傳統發酵技術的特點及常見應用。
2.
概述微生物純培養的技術，闡明微生物選擇培養和分離、計數
3.
概述發酵工程及其基本環節舉例說明發酵工程的應用價值
第二部分：教材習題變式
【教材課后習題】
1.某化工廠為了處理排出污水中的一種有害的、難以降解的有機化合物A，其研究團隊用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽和微量元素等配制了培養基，成功地篩選出能高效降解化合物A的細菌（目的菌）。實驗的主要步驟如下圖所示，請分析回答問題。
（1）在培養基中加入化合物A的目的是_____，這種培養基屬于_____培養基。
（2）培養若干天后，應選擇培養瓶中化合物A含量_____的培養液，接入新的培養液中連續培養，使目的菌的數量_____。
（3）若要研究目的菌的生長規律，可挑取單個菌落進行液體培養，再采用_____方法進行計數。請你預測目的菌的種群數量會發生怎樣的變化。
（4）將目的菌用于環境保護實踐時，還有哪些問題需要解決？
（5）有人提出，可以通過改造細菌的基因來獲得能夠降解化合物A的細菌，請分析這種方法是否可行。
2.某個高溫日，某校三位高中學生相約去吃冰激凌，之后兩人都出現腹瀉現象，于是他們懷疑冰激凌中的大腸桿菌含量超標。老師建議他們利用學過的有關微生物培養的知識對此冰激凌進行檢測。經過一番資料查閱，他們提出了如下實驗設計思路。
立即去賣冰激凌的小店再買一個同樣品牌的同種冰激凌；配制伊紅—亞甲藍瓊脂培養基（該培養基可用來鑒別大腸桿菌，生長在此培養基上的大腸桿菌菌落呈深紫色，并有金屬光澤）、滅菌、倒平板；取10mL剛融化的冰激凌作為原液，然后進行梯度稀釋，稀釋倍數為1×10~1×105取每個濃度的冰激凌液各0.1mL，用涂布平板法進行接種，每個濃度涂3個平板，一共培養18個平板；在適宜溫度下培養48h，統計菌落數目。
（1）請你從下面幾個角度對這三位同學的思路進行評議。
①他們只打算對一個冰激凌進行檢測，理由是：兩個人吃過冰激凌后，都拉肚子了，所以再檢測一個就足以說明問題。你同意這樣的觀點嗎？為什么？
②有沒有必要對冰激凌原液進行梯度稀釋？為什么？【提示：我國衛生部門規定了飲用水標準，1mL自來水中細菌總數不可以超過100個（37℃培養24h），1000mL自來水中大腸桿菌菌落數不能超過3個（37℃培養48h）】
③他們認為，在用該方法統計菌落數目時不需要設計對照組，所以只準備培養18個平板。你認為在這項檢測中是否需要對照組？為什么？
（2）下圖所示為4種菌落分布圖，一般不能由涂布平板法得到的是____。
（3）在完善實驗設計思路后，三位同學進行了實驗。培養結果顯示，除了深紫色菌落，還有其他菌落存在，這說明了什么？如果以菌落數代表樣品中的大腸桿菌數量，則統計結果比實際值是偏多還是偏少？為什么？
（4）如果實驗結果顯示，檢測的冰激凌中大腸桿菌含量超標了。接下來他們應該做什么？
1.答案：（1）篩選出能降解化合物A的細菌選擇
（2）低；增多
（3）稀釋涂布平板：培養液中目的菌的種群數量在開始一段時間范圍內，由于營養充分、空間充裕，種群數量類似于“J”形增長，隨著營養物質的消耗，種群增長速率逐漸下降，最終會達到K值，繼續培養，由于營養物質缺乏、有害代謝物積累、pH改變等，種群數量將會下降。
（4）將目的菌用于環境保護實踐之前，還要對目的菌進行研究，檢測其是否會產生對環境有害的代謝物；當使用大量目的菌時會不會使目的菌成為優勢菌群，對其他微生物的生存構成威脅，從而打破微生物菌群的平衡等。
（5）可以利用基因工程的方法，將能降解化合物A的基因導入受體菌中來實現。但在使用之前要檢驗其安全性。
2.答案：（1）①不同意。對一個冰激凌進行檢測，沒有遵循實驗的平行重復原則，實驗誤差可能會很大。
②有必要。若不進行梯度稀釋，可能會由于菌體數量過多，兩個或多個細菌連在一起當作一個菌落計數，從而使計數結果偏低。
③需要設計對照組，需要設計未接種的培養基作為空白對照，來檢測培養基滅菌是否徹底。
（2）B
（3）說明冰激凌中除了大腸桿菌外，還有其他細菌等微生物的污染。若以菌落數代表樣品中的大腸桿菌數量，則統計結果比實際值偏小，因為當兩個或多個細菌連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
（4）如果大腸桿菌含量超標，應該向衛生檢疫部門反映，停止售賣該種冰激凌，同時檢測是冰激凌生產過程中大腸桿菌污染超標，還是水源中大腸桿菌污染超標。若是前者，冰激凌生產廠家應停止生產，進行設備滅菌等，直到達標；若是后者，應找到水源所在處，進行水源污染治理。
【變式訓練】
1.研究深海獨特的生態環境對于開發海洋資源具有重要意義。近期在“科學號”考察船對中國南海科考中，中國科學家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉積物樣品，分離、鑒定得到新的微生物菌株并進一步研究了其生物學特性。
回答下列問題：
（1）研究者先制備富集培養基，然后采用________________法滅菌，冷卻后再接入沉積物樣品，28℃厭氧培養一段時間后，獲得了含擬桿菌的混合培養物，為了獲得純種培養物，除了稀釋涂布平板法，還可采用________________法。據圖分析，擬桿菌新菌株在以________________為碳源時生長狀況最好。
（2）研究發現，將采集的樣品置于各種培養基中培養，仍有很多微生物不能被分離篩選出來，推測其原因可能是________________。（答一點即可）
（3）藻類細胞解體后的難降解多糖物質，通常會聚集形成碎屑沉降到深海底部。從生態系統組成成分的角度考慮，擬桿菌對深海生態系統碳循環的作用可能是________________。
（4）深海冷泉環境特殊，推測此環境下生存的擬桿菌所分泌的各種多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能還有________________。
2.部分白酒廠的常見白酒釀造工藝流程可簡化為圖1。濃發酵是指在高濃度的原料中發酵，在規模化生產中，發酵原料濃度的提高能增加生產能力，并具有降低能耗、節約水資源等優點。研究者不斷探索能進一步提高發酵原料濃度的發酵工藝，以實現真正意義上的“濃”發酵。回答下列問題：

（1）玉米是東北地區釀制白酒的常用原料，作為培養基的主料主要提供酵母菌所需的碳源。玉米經碾磨后，在“拌料”環節中，除加水外，還應加入其他類型的營養物質如____________、____________以滿足酵母菌的代謝需求，提高發酵效率。
(2)“蒸煮”可以改變淀粉分子結構，有利于淀粉的分解，此外，蒸煮還具有____________的作用
(3)“糖化”環節可以加入黑曲霉菌等菌種，也可以直接加入酶，該環節的目的是____________。
（4）發酵原料濃度升高，提高了發酵難度，常導致酒精轉化效率降低，研究者對此展開了模擬實驗：對照組一次性添加27g/mL濃度的葡萄糖，實驗組在酒精發酵的前24h內分批次每3h添加3g/mL濃度的葡萄糖，最終保持兩組添加的葡萄糖量相等，定期抽樣檢測，測定各組葡萄糖、酒精濃度。實驗數據如圖2所示。

①結果表明，在葡萄糖供應量相等的條件下，分批次添加能提高發酵效率，使酒精產量提高，從培養基理化性質的角度分析，一次性添加過多葡萄糖不利于酒精發酵的原因可能與____________有關。
②為實現濃醪發酵并提高產量，研究者提出了優化發酵工藝環節的建議：將玉米粒研磨顆粒適當增大、將糖化環節與發酵環節合并為一個環節。根據上述實驗結果分析，這些措施能____________，從而在原料濃度高的情況下提高酒精產量。
1.答案：（1）高壓蒸汽滅菌；平板劃線；纖維素
（2）某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物質才能生存（或需要在深海冷泉的特定環境中才能存活）
（3）擬桿菌作為分解者，將沉降到深海底部的難降解多糖物質分解為無機物，歸還到無機環境中，有利于碳循環的順利進行
（4）耐低溫
解析：（1）培養基通常采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌。可以采用稀釋涂布平板法或平板劃線法，將單個微生物分散在固體培養基上，經過培養得到單菌落，從而獲得純凈培養物。分析圖12可知，在以纖維素為碳源的培養基中，細胞數量最多，可推知擬桿菌新菌株在以纖維素為碳源時生長狀況最好。
（2）深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物質才能生存（或需要在深海冷泉的特定環境中才能存活），故將采集的樣品置于各種培養基中培養，仍可能有很多微生物不能被分離篩選出來。
（3）擬桿菌為異養生物，作為該生態系統的分解者，能將沉降到深海底部的難降解多糖物質分解為無機物，歸還到無機環境中，有利于碳循環的順利進行。
（4）深海冷泉溫度較低，故生活在其中的擬桿菌所分泌的各種多糖降解酶，應具有耐低溫的特性，才能高效降解多糖，保證擬桿菌的正常生命活動所需。
2.答案：（1）氮源；無機鹽
（2）使原料在高溫下滅菌
（3）使淀粉水解成葡萄糖，為酵母菌發酵提供底物
（4）液體培養基滲透壓過高；降低淀粉的水解速度，邊糖化邊發酵，相當于分批補料，使培養液的滲透壓不至于太高，有利于發酵
解析：（1）酵母菌代謝時需要水、碳源、氮源及無機鹽，因此，釀制白酒時，降低了玉米提供碳源，添加了水外，還要添加氮源和無機鹽，以滿足酵母菌的代謝需求，提高發酵效率。
（2）蒸煮是指利用高溫促進糧食淀粉顆粒吸水、膨脹、破裂，使淀粉膨脹成溶解狀態，可以改變淀粉分子結構，有利于淀粉的分解。由于此過程利用了高溫，因此蒸煮還具有滅菌的作用。
（3）“糖化”是指淀粉水解成葡萄糖的過程，黑曲霉菌在生活過程中會分泌淀粉酶，因此，“糖化”環節加入黑曲霉菌等菌種，或直接加入酶，都是為了把原料中的淀粉水解成葡萄糖，為酵母菌發酵提供底物。
（4）①釀酒時使用的培養基是液體培養基，據圖2可知，一次性添加過多葡萄糖時，培養基中葡萄糖濃度很高，使培養基的滲透壓也高。這會導致酵母菌吸水減少而影響代謝過程，或者會導致部分酵母菌失水死亡，進而不利于酒精發酵。
②將玉米粒研磨顆粒適當增大，則玉米中淀粉與淀粉酶接觸概率減小，降低淀粉的水解速度，進而降低發酵液中葡萄糖濃度。將糖化環節與發酵環節合并為一個環節，邊糖化邊發酵相當于分批補料，使培養液的滲透壓不至于太高，有利于發酵。
第三部分：重難知識易混易錯
一、傳統發酵技術
1.發酵：利用微生物，在適宜的條件下，將原料通過微生物的代謝轉化為人類所需要的產物的過程
2.實例：腐乳制作
（1）參與微生物：毛霉、酵母、曲霉等
（2）原理：豆腐中的蛋白質被分解成小分子的肽和氨基酸，味道鮮美，易于消化吸收
3.傳統發酵技術
（1）概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次發酵保存下來的面團、鹵汁等發酵物中的微生物進行發酵、制作食品的技術
（2）形式：以混合菌種的固體發酵及半固體發酵為主，通常是家庭式或作坊式的
（3）產物：腐乳、醬油、醋、泡菜、豆豉、醬等
【例】千百年來，腐乳一直受到人們的喜愛。腐乳以黃豆為主要原料制成，它的制作與發酵技術密切相關。下列敘述錯誤的是（???）
A.腌制腐乳的過程中不需要嚴格進行滅菌處理
B.多種微生物參與了腐乳的制作，如酵母菌、毛霉和曲霉等
C.腐乳味道鮮美、易于消化，這與微生物發酵產生的小分子物質有關
D.微生物產生的脂肪酶能將豆腐中的脂肪分解為甘油和氨基酸
答案：D
解析：腐乳是利用微生物發酵制作的大豆食品，如果嚴格滅菌會抑制發酵，A正確；酵母菌、毛霉和曲霉等都參與了腐乳的制作，其中起主要作用的是毛霉，B正確；毛霉等微生物產生的蛋白酶能將豆腐中的蛋白質分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶可將脂肪水解為甘油和脂肪酸，所以腐乳味道鮮美，易于消化吸收，C正確，D錯誤。
二、嘗試制作傳統發酵食品
1.泡菜制作的原理
（1）菌種：乳酸菌。
a.分布：廣泛分布在空氣、土壤、植物體表、人或動物的腸道等處。
b.代謝類型：異養厭氧型。
c.常見種類：乳酸鏈球菌和乳酸桿菌。其中乳酸桿菌常用于生產酸奶。
（2）發酵原理：乳酸菌在無氧條件下，將葡萄糖分解為乳酸。
2.泡菜制作的實驗設計
a.制作流程
b.準備材料
①選擇泡菜壇：選用火候好、無裂紋、無砂眼、壇沿深、蓋子吻合好的泡菜壇。
②選擇原料：質地鮮嫩，肉豐富，無蟲咬，無爛痕，無斑點。
c.制作過程
①原料處理：將鮮菜修整、清洗、陽光下晾曬到菜表皮萎蔫時收起，切成條狀或片狀。
②配制鹽水：按照清水與鹽的質量比為4∶1的比例配制鹽水，并將鹽水煮沸冷卻。
③裝壇：將經過預處理的新鮮蔬菜混合均勻，裝入泡菜壇中，裝至半壇時放入香辛料，繼續裝到八成滿，再徐徐注入配制好的鹽水，使鹽水沒過全部菜料，蓋好壇蓋。
④封壇發酵：向壇蓋邊沿的水槽中注滿水，以保證壇內乳酸菌發酵所需的無氧環境。要注意經常補充水槽中的水。
⑤成品：將封好的壇子，放在室溫環境中約15天，便可制成清脆爽口的泡菜。
d.腌制條件
在腌制過程中，要控制腌制的時間、溫度和食鹽的用量。溫度過高、食鹽用量過低、腌制時間過短，容易造成細菌大量繁殖，亞硝酸鹽含量增加。
3.果醋和果酒的制作原理
（1）果酒的制作原理
a.菌種：酵母菌。
①代謝類型：兼性厭氧型。
②最適生長溫度：20℃左右。
b.發酵原理：
①在有氧條件下，進行有氧呼吸，大量繁殖。
反應式：C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O。
②在無氧條件下，進行酒精發酵，產生酒精。
反應式：C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2。
c.菌種來源：自然發酵過程中，來源于附著在葡萄皮上的野生型酵母菌。
（2）果醋的制作原理
a.菌種：醋酸菌。
①代謝類型：需氧型。
②最適生長溫度：30～35_℃。
b.發酵原理：
①當氧氣、糖源都充足時，醋酸菌將葡萄汁中的糖分解成醋酸。
②當缺少糖源時，醋酸菌將乙醇變為乙醛，再將乙醛變為醋酸。
反應簡式：C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O。
4.果醋和果酒的制作流程
（1）實驗流程
（2）實驗裝置
①充氣口：在醋酸發酵時連接充氣泵進行充氣；
②排氣口：排出酒精發酵時產生的CO2；
③出料口：用來取樣。
（3）發酵條件
果酒制作
果醋制作
溫度
18～25℃
30～35℃
時間
10～12d
7～8d
通氣
先通氣后密封，或預留約1/3的空間
始終通氣
（4）操作要求
a.器具的清洗、消毒：榨汁機要洗凈晾干，發酵瓶要清洗干凈并用體積分數為70%的酒精消毒。
b.材料的選擇和處理：選擇新鮮的葡萄，先用清水沖洗1～2遍除去污物后，再去枝梗。
c.榨汁裝瓶：將沖洗干凈并除枝梗的葡萄放入榨汁機榨取葡萄汁，然后將葡萄汁裝入發酵瓶，要留大約1/3的空間，并封閉充氣口。
d.發酵：
①制葡萄酒的過程中，將溫度嚴格控制在18～25℃，時間控制在10～12d，每天定時排出發酵產生的CO2，10d后開始從出料口抽樣，監測酒精濃度或菌體數量。
②制葡萄醋的過程中，用充氣泵不斷從充氣口泵入空氣，溫度嚴格控制在30～35℃，發酵7～8d，即可制成果醋。
（5）酒精檢測
a.檢測試劑：重鉻酸鉀。
b.檢測條件：酸性條件。
c.實驗現象：呈現灰綠色。
【例】圖甲為果酒和果醋生產工藝流程簡圖，圖乙為果酒、果醋發酵裝置示意圖。下列相關敘述錯誤的是（ ）
A.在葡萄沖洗后才能去除葡萄枝梗，以防止雜菌污染
B.盡量縮短排氣口膠管的長度，以便順利排出發酵產生的氣體
C.發酵過程要控制適宜的溫度，醋酸發酵的溫度比酒精發酵的高
D.利用酵母菌進行酒精發酵時，充氣口應該先打開后關閉
答案：B
解析：葡萄在沖洗后再去除葡萄枝梗，能防止雜菌污染，A正確；排氣口有長長的膠管，其作用是排氣，同時能避免雜菌污染，若發酵裝置的排氣口膠管過短。外界空氣中的細菌容易進入發酵瓶，可能會導致污染，B錯誤；酒精發酵的最適溫度在18～25℃之間，醋酸發酵最適溫度在30～35℃之間，顯然，醋酸發酵的溫度比酒精發酵的高，C正確；利用酵母菌進行酒精發酵時，充氣口先打開的目的是讓酵母菌在有氧條件下大量繁殖，隨后關閉充氣口制造無氧環境進行酒精發酵，D正確。
三、發酵工程
1.發酵工程的含義
利用微生物的特定功能，通過現代工程技術，規模化生產對人類有用的產品。
2.發酵工程與傳統發酵技術相比的特點
主要以可再生資源為原料；反應條件溫和；環境污染較少；能生產目前不能生產或通過化學方法生產困難的性能優異的產品；投資較少。
3.發酵工程的基本環節
（1）菌種的選育（誘變育種、基因工程和細胞工程）
（2）擴大培養
（3）培養基的配制
（4）培養基和設備的滅菌
（5）接種（注意防止雜菌的污染，發酵罐冷卻后才可加入）
（6）發酵罐內發酵——中心環節，需嚴格控制溫度、pH、溶氧、通氣量與轉速等發酵條件。
（7）產品的分離和提純
菌體可采用過濾、沉淀等方法分離。
代謝產物可采用蒸餾、萃取、離子交換等方法提取。
4.發酵工程中菌種的選擇
（1）如果生產的是微生物直接合成的產物：可以從自然界中先分離出相應的菌種，再用物理或化學的方法使菌種產生突變，從突變個體中篩選出符合生產要求的優良菌種。
（2）如果生產的是一般微生物不能合成的產品：可用基因工程、細胞工程的方法對菌種的遺傳特性進行定向改造，以構建工程細胞或工程菌，從而達到生產相應產品的目的。
5.發酵工程的特點
（1）生產條件溫和：溫度、壓力都不高。
（2）原料來源豐富且價格低廉：微生物種類多，易分離。
（3）產物專一：可直接生產某種物質。
（4）廢棄物對環境的污染小且容易處理：廢料是各種代謝產物，只要滅菌后，一般對環境不造成污染。
6.發酵工程的應用
（1）在食品工業上的應用
生產傳統的發酵產品，如醬油、各種酒類。
生產各種各樣的食品添加劑，如通過黑曲霉發酵制得的檸檬酸，由谷氨酸棒狀桿菌發酵生產味精。
生產酶制劑，如α淀粉酶、β淀粉酶、脂肪酶等。
（2）在醫藥工業上的應用
基因工程、蛋白質工程等的廣泛應用給發酵工程制藥領域的發展注入了強勁動力。
（3）在農牧業上的應用
生產微生物肥料。微生物肥料利用了微生物在代謝過程中產生的有機酸、生物活性物質等來增進土壤肥力，改良土壤結構，促進植株生長，常見的有根瘤菌肥、固氮菌肥等。
生產微生物農藥。微生物農藥是利用微生物或其代謝物來防治病蟲害的。微生物農藥作為生物防治的重要手段，將在農業的可持續發展方面發揮越來越重要的作用。
生產微生物飼料。微生物含有豐富的蛋白質。以淀粉或纖維素的水解液、制糖工業的廢液等為原料，通過發酵獲得了大量的微生物菌體，即單細胞蛋白，用單細胞蛋白制成的微生物飼料，能使家畜、家禽增重快，產奶或產蛋量顯著提高。
（4）在其他方面的應用
發酵工程正滲透到幾乎所有的工農業領域，在助力解決糧食、環境、健康和能源等方面的重大問題上，作出了越來越大的貢獻。
【例】谷氨酸除用于制造味精外，還可以用來治療神經衰弱以及配制營養注射液等。通過發酵工程可以大量制備谷氨酸，下列有關谷氨酸發酵生產的敘述，誤（是( )
A.發酵之前要對谷氨酸菌種進行擴大培養
B.若發酵產品是產谷氨酸菌種，可采用過濾等方法分離
C.發酵過程中，在中性和弱堿性條件下會積累谷氨酸
D.分離、提純發酵產物是發酵過程的中心環節
答案：D
解析：
選項
解析
正、誤
A項
發酵罐的體積很大，發酵之前要對谷氨酸菌種進行擴大培養
正確
B項
若發酵產品是產谷氨酸菌種，可采用過濾、沉淀等方法分離
正確
C項
發酵過程中在中性或弱堿性條件下會積累谷氨酸
正確
D項
發酵罐內的發酵是發酵過程的中心環節
錯誤
四、培養基的配制
1.培養基的概念：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質——培養基，用以培養、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。
2.培養基的分類：按照物理性質不同分為兩類。
（1）液體培養基：呈液體狀態的培養基，不加入凝固劑（如瓊脂）。
（2）固體培養基：呈固體狀態的培養基，加入凝固劑（如瓊脂）。
3.營養組成：各種培養基一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽，此外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及O2的需求。
4.培養基特殊需求：
（1）培養乳酸桿菌時，在培養基中添加維生素。
（2）培養霉菌時，將培養基調至酸性。
（3）培養細菌時，將培養基調至中性或弱堿性。
（4）培養厭氧微生物時，需要提供無氧的條件。
【例】下表為某培養基的配方，有關敘述正確的是（ ）
成分
牛肉膏
葡萄糖
K2HPO4
瓊脂
蒸餾水
含量
10g
10g
2g
適量
定容至1000mL
A.從物理性質看，該培養基屬于液體培養基
B.該培養基中屬于氮源的物質有牛肉膏和葡萄糖
C.配制該培養基并調節pH后可直接接種微生物
D.該培養基可用于菌種的分離、計數、鑒定
答案：D
解析：不含凝固劑（如瓊脂）、呈液體狀態的培養基為液體培養基，呈固體狀態的培養基為固體培養基，題表培養基配方中有瓊脂，故該培養基為固體培養基，A錯誤；一切能滿足微生物生長繁殖所需氮元素的營養源稱為氮源，牛肉膏（內含蛋白質）含氮元素，屬于氮源，葡萄糖不含氮元素，不能作氮源，B錯誤；按配方配制培養基，并調節培養基的pH后，需要進行滅菌處理，C錯誤；人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質一培養基，用以培養、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物，其中固體培養基常用于菌種的分離、計數、鑒定，D正確。
五、無菌技術
1.無菌技術關鍵：防止雜菌污染。
2.無菌技術的目的：
（1）可防止實驗室的培養物被其他微生物污染。
（2）有效避免操作者自身被微生物感染。
3.無菌技術的選擇原則：
（1）考慮效果：滅菌的效果比消毒要好。
（2）考慮操作對象的承受能力：活體生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用滅菌的方法。
4.消毒與滅菌：
（1）概念：
①消毒：使用較為溫和的物理、化學或生物等方法僅殺死物體表面或內部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。
②滅菌：使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物（包括芽孢和孢子）。
（2）類型
消毒
滅菌
常用方法
煮沸消毒法、巴氏消毒法、化學藥劑消毒法、紫外線消毒法
灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌
適用對象
操作空間、操作者雙手等
接種環、接種針、玻璃器皿、培養基等
【例】無菌技術包括以下幾個方面的敘述，其中錯誤的是（ ）
A.對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行滅菌
B.將用于微生物培養的培養皿、接種用具和培養基等進行滅菌
C.為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行
D.實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸
答案：A
解析：A、對實驗操作的空間、操作者的衣著和手應進行消毒，A錯誤；B、為保證不被雜菌污染，應將培養器皿、接種用具和培養基等進行滅菌，B正確；C、酒精燈火焰附近可以形成一個無菌區，為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行，C正確；D、周圍物品可能會含有雜菌，為防止污染，實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸，D正確。故選A。
六、微生物的純培養
1.微生物純培養的概念：由單一個體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養物，獲得純培養物的過程就是純培養。
2.酵母菌的純培養：
（1）純培養的原理：設法在培養基上得到由單個微生物繁殖形成的純培養物（單菌落）。
（2）純培養方法：平板劃線法和稀釋涂布平板法。
（3）純培養過程：
a配制培養基：

b滅菌：培養基轉移至錐形瓶，加棉塞，包上牛皮紙，如圖所示，然后放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，培養皿包扎后放入干熱滅菌箱內滅菌。

c倒平板：待培養基冷卻到50 ℃左右時，在酒精燈火焰附近進行。具體操作過程：

d平板劃線法接種和分離酵母菌
①平板劃線法：通過接種環在固體培養基表面連續劃線操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。
②平板劃線法結果：
平板劃線示意圖（A）及培養后菌落分布示意圖（B）如下圖所示。

③幾次灼燒的目的：
灼燒時期
目的
第一次操作（取菌種前）
殺死接種環上原有的微生物，避免污染培養物
每次劃線之前
殺死上次劃線后接種環上殘留的菌種，使下次劃線的菌種直接來源于上次劃線的末端，使每次劃線菌種數目減少
劃線結束
殺死接種環上殘存的菌種，避免微生物污染環境和感染操作者
（4）培養酵母菌：接種和未接種的平板在溫度適宜的恒溫箱中培養。
【例】為了分離和純化高效分解石油的細菌，科研人員用被石油污染過的土壤進行如圖A所示的實驗。步驟④的一個平板經培養后的菌落分布如圖B所示。下列敘述錯誤的是（ ）
A.步驟③的培養基與普通液體培養基的最大區別是步驟③的培養基中石油是唯一碳源
B.步驟⑤振蕩培養的目的是提高培養液溶氧量，同時使菌體與培養液充分接觸
C.圖B培養基的結果可能是涂布不均勻造成的
D.步驟⑤后取樣測定石油含量的主要目的是篩選出能分解石油的細菌
答案：D
解析：該實驗的目的是分離和純化高效分解石油的細菌，因此步驟③的培養基與普通液體培養基的最大區別是步驟③的培養基中石油是唯一碳源，A正確；步驟⑤需要振蕩培養，以提高培養液中（溶解）氧的含量，同時振蕩可使菌體與培養液充分接觸，提高營養物質的利用率，B正確；步驟④采用的接種方法是稀釋涂布平板法，出現圖B結果（菌落分布不均勻）可能是涂布不均勻造成的，C正確；步驟⑤后取樣測定石油含量的目的是篩選出分解石油能力最強的細菌，D錯誤。
七、微生物的選擇培養與計數
1.選擇培養基
（1）實驗室中微生物篩選的原理：人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物的生長。
（2）選擇培養基概念：在微生物學中，允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基。
（3）選擇培養基配方的設計：
a原理：分解尿素的細菌合成的脲酶將尿素分解產生NH3。
b培養基配方設計：以尿素為唯一氮源的選擇培養基。
2.微生物的選擇培養
（1）方法：對樣品進行充分稀釋，然后將菌液涂布到制備好的選擇培養基上。
（2）稀釋涂布平板法的操作過程：
a系列梯度稀釋操作：

b涂布平板操作。
①取菌液：取0.1mL菌液，添加到培養基表面。
②涂布器滅菌：取出浸在酒精中的涂布器，放在火焰上燃燒，酒精燃盡后，冷卻涂布器。
③涂布過程：用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面，涂布時可轉動培養皿，使菌液分布均勻。
（3）培養：待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入恒溫培養箱中培養，觀察。
3.微生物的數量測定
（1）稀釋涂布平板法
a統計依據。
當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。
b操作。
①一般選擇菌落數為30～300的平板進行計數。
②選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養，在同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數，然后求平均值。
c注意問題：統計的菌落數往往比活菌的實際數目少。這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
（2）顯微鏡直接計數
a原理：此法利用特定的細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定體積的樣品中微生物的數量。
b方法：顯微鏡下觀察，細菌計數板或血細胞計數板計數。
c計算公式：
每毫升原液所含細菌數=每小格平均細菌數×400×10000×稀釋倍數
d缺點：統計的結果一般是活細菌和死細菌的總和，計算結果比實際值偏大。
4.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
（1）實驗流程示意圖：

（2）實驗操作過程：
流程
具體操作
操作提示
土壤取樣
先鏟去表層土，取距地表 3～8?cm的土壤層，將樣品裝入紙袋中
①適宜在富含有機質，酸堿度接近中性的潮濕土壤中取樣
②取樣用的鐵鏟和取樣的紙袋使用前都需要滅菌
制備培養基
分別配制牛肉膏蛋白胨培養基和以尿素為唯一氮源的選擇培養基
牛肉膏蛋白胨培養基作為對照組，用來判斷選擇培養基是否具有選擇的作用
樣品的稀釋和涂布
①火焰旁稱取土壤樣本
②將稀釋倍數為103～107的稀釋液涂布平板。每個稀釋度至少涂布三個平板作為重復組
①注意無菌操作
②對所用的平板、試管做好標記
③初次實驗對于稀釋的范圍沒有把握，可選擇一個較為寬泛范圍103～107倍的稀釋液
培養、觀察和計數
①將涂布好的平板和空白平板放在適宜溫度下的培養箱中倒置培養
②每隔24?h統計一次菌落數目，比較牛肉膏蛋白胨培養基和選擇培養基中菌落的數量、形態等，并做好記錄
③當菌落數目穩定時，選取菌落數在30～300 的平板進行計數
①空白平板作為對照，檢測培養基制備是否合格
②觀察時還要記錄不同菌落的形狀、大小、顏色等
③在同一稀釋度下，至少對3個平板進行計數，然后求出平均值，并根據平板所對應的稀釋度計算出樣品中活菌的數目
【例】常乳是指雌性哺乳動物產后14天后所分泌的乳汁。奶牛自身乳房和乳頭中可能含有細菌，加上擠乳過程中產生的少量污染，因此常乳中會有一定量的細菌存在。研究小組要檢測一份常乳樣品中細菌的總量（不考慮菌種），檢測流程如圖，每個平板上接種菌液量為0.1mL。下列說法錯誤的是（ ）
A.倒平板時將培養皿打開一條細縫，不要完全打開，防止雜菌污染
B.上述方法是稀釋涂布平板法，培養基要營養全面，適合各種細菌生長
C.也可以通過連續劃線的方法接種，通過菌落數計算樣品中的細菌總數
D.若三個平板上的菌落平均數為59個，則每毫升樣品中細菌總數為5.9×107個
答案：C
解析：打開一條細縫是為了減少培養基與空氣的接觸，防止雜菌污染，A正確。對細菌進行計數常用稀釋涂布平板法，B正確。平板劃線法只能用于微生物的分離，不能用于計數，C錯誤。每毫升樣品中細菌總數=（菌落平均數÷接種菌液量）×稀釋倍數=59÷0.1×105=5.9×107（個），D正確。
第四部分：核心素養對接高考
本專題的考查內容集中在微生物的實驗室培養、特定微生物數量的測定方法、發酵工程的應用以及特定發酵產物的制備。本專題內容貼近生產生活，是高考的命題熱點。
【2023·湖南卷】1.某些植物根際促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列問題：
（1）若從植物根際土壤中篩選分解淀粉的固氮細菌，培養基的主要營養物質包括水和____。
（2）現從植物根際土壤中篩選出一株解淀粉芽孢桿菌H，其產生的抗菌肽抑菌效果見表。據表推測該抗菌肽對_________________的抑制效果較好，若要確定其有抑菌效果的最低濃度，需在__________μg·mL-1濃度區間進一步實驗。
測試菌
抗菌肽濃度/（?g·mL-1）

55.20
27.60
13.80
6.90
3.45
1.73
0.86
金黃色葡萄球菌
-
-
-
-
-
+
+
枯草芽孢桿菌
-
-
-
-
-
+
+
禾谷鐮孢菌
-
+
+
+
+
+
+
假絲酵母
-
+
+
+
+
+
+
注：“+”表示長菌，“－”表示未長菌。
（3）研究人員利用解淀粉芽孢桿菌H的淀粉酶編碼基因M構建高效表達質粒載體，轉入大腸桿菌成功構建基因工程菌A。在利用A菌株發酵生產淀粉酶M過程中，傳代多次后，生產條件未變，但某子代菌株不再產生淀粉酶M。分析可能的原因是______（答出兩點即可）。
（4）研究人員通過肺上皮干細胞誘導生成肺類器官，可自組裝或與成熟細胞組裝成肺類裝配體，如圖所示。肺類裝配體培養需要滿足適宜的營養、溫度、滲透壓、pH以及_____（答出兩點）等基本條件。肺類裝配體形成過程中是否運用了動物細胞融合技術___（填“是”或“否”）。

（5）耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是一種耐藥菌，嚴重危害人類健康。科研人員擬用MRSA感染肺類裝配體建立感染模型，來探究淀粉芽孢桿菌H抗菌肽是否對MRSA引起的肺炎有治療潛力。以下實驗材料中必備的是______。
①金黃色葡萄球菌感染的肺類裝配體
②MRSA感染的肺類裝配體
③解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽
④生理鹽水
⑤青霉素（抗金黃色葡萄球菌的藥物）
⑥萬古霉素（抗MRSA的藥物）
【2023·山東卷】2.平板接種常用在微生物培養中。下列說法正確的是（ ）
A.不含氮源的平板不能用于微生物培養
B.平板涂布時涂布器使用前必須進行消毒
C.接種后未長出菌落的培養基可以直接丟棄
D.利用以尿素為唯一氮源的平板能分離出合成脲酶的微生物
【2023·1月浙江卷】3.某同學想從泡菜汁中篩選耐高鹽乳酸菌，進行了如下實驗：取泡菜汁樣品，劃線接種于一定NaCl濃度梯度的培養基，經培養得到了單菌落。下列敘述正確的是（ ）
A.培養基pH需偏堿性 B.泡菜汁需多次稀釋后才能劃線接種
C.需在無氧條件下培養 D.分離得到的微生物均為乳酸菌
【2023·北京卷】4.自然界中不同微生物之間存在著復雜的相互作用。有些細菌具有溶菌特性，能夠破壞其他細菌的結構使細胞內容物釋出。科學家試圖從某湖泊水樣中分離出有溶菌特性的細菌。
（1）用于分離細菌的固體培養基包含水、葡萄糖、蛋白胨和瓊脂等成分，其中蛋白胨主要為細菌提供___________和維生素等。
（2）A菌通常被用作溶菌對象。研究者將含有一定濃度A菌的少量培養基傾倒在固體培養平板上，凝固形成薄層。培養一段時間后，薄層變渾濁（如圖），表明______________________。

（3）為分離出具有溶菌作用的細菌，需要合適的菌落密度，因此應將含菌量較高的湖泊水樣___________后，依次分別涂布于不同的渾濁薄層上。培養一段時間后，能溶解A菌的菌落周圍會出現___________。采用這種方法，研究者分離、培養并鑒定出P菌。
（4）為探究P菌溶解破壞A菌的方式，請提出一個假設，該假設能用以下材料和設備加以驗證。
主要實驗材料和設備：P菌、A菌、培養基、圓形濾紙小片、離心機和細菌培養箱。
【2023·山東卷】5.以下是以泡菜壇為容器制作泡菜時的4個處理：①沸鹽水冷卻后再倒入壇中；②鹽水需要浸沒全部菜料；③蓋好壇蓋后，向壇蓋邊沿的水槽中注滿水；④檢測泡菜中亞硝酸鹽的含量。下列說法正確的是（ ）
A.①主要是為了防止菜料表面的醋酸桿菌被殺死
B.②的主要目的是用鹽水殺死菜料表面的雜菌
C.③是為了使氣體只能從泡菜壇排出而不能進入
D.④可檢測到完整發酵過程中亞硝酸鹽含量逐漸降低
【2023·山東卷】6.果酒的家庭制作與啤酒的工業化生產相比，共同點有（ ）
A.都利用了酵母菌無氧呼吸產生酒精的原理
B.都需要一定的有氧環境供發酵菌種繁殖
C.發酵前都需要對原料進行滅菌
D.發酵結束后都必須進行消毒以延長保存期
1.答案：（1）無機鹽、碳源
（2）金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌；1.73~3.45
（3）淀粉酶編碼基因M發生突變；能產生淀粉酶M的個體產生后代時發生性狀分離
（4）無菌、無毒環境，含95%O2和5%CO2的氣體環境；否
（5）③④⑥
解析：（1）由題意可知，根際促生菌具有固氮作用，因此用于篩選根際促生菌的培養基的主要營養物質包括水、無機鹽和碳源。
（2）由題表可知，在抗菌肽濃度為3.45～55.20mg·mL-1范圍內，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均不能生長，表明該抗菌肽對它們的抑菌效果較好。因為抗菌肽的濃度為1.73mg·mL-1時，它們均能生長，所以要確定抗菌肽抑菌效果的最低濃度，應在1.73～3.45mg·mL-1濃度區間設置更小的濃度梯度進行實驗。
（3）A菌株在傳代過程中，淀粉酶編碼基因M可能發生突變導致其不能產生淀粉酶M；或者在遺傳過程中能產生淀粉酶M的個體產生后代時發生性狀分離。
（4）動物細胞培養的條件除需要適宜的營養、溫度、滲透壓、pH外，還需要無菌、無毒環境以及含95%O2和5%CO2的氣體環境。肺類裝配體形成過程中涉及不同類型的細胞，但僅是將不同類型細胞組裝起來，而非使不同類型的細胞融合。
（5）實驗的目的是探究解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽是否對MRSA引起的肺炎有治療潛力。因此自變量為是否使用解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽，因變量為MRSA引起的肺炎的癥狀是否緩解。所以實驗組用解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽處理，實驗對象為MRSA感染的肺炎裝配體，另外用萬古霉素（抗MRSA的藥物）來檢測解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽的抗菌效果。因此所選實驗材料有②③⑥。
2.答案：D
解析：A、不含有氮源的平板可用來培養利用空氣中氮氣的微生物，A錯誤；B、平板涂布時涂抹器使用前必須進行滅菌處理，以防止外來雜菌的污染，B錯誤；C、接種后未長出菌落的培養基，也可能有少量微生物，所以不能直接丟棄，C錯誤；D、利用以尿素為唯一氮源的平板上，若微生物可以產生脲酶，則可以利用脲酶分解尿素氨而獲得氮源生長，其他不能產生脲酶的微生物則不能生長，可以把合成脲酶的微生物分離出來，D正確。故選：D。
3.答案：C
解析：培養乳酸菌的培養基應偏酸性，A項錯誤；劃線接種時，泡菜汁無需進行多次稀釋，B項錯誤；乳酸菌是厭氧菌，需在無氧條件下培養，C項正確；泡菜汁中還有酵母菌等，因此分離得到的微生物不只有乳酸菌，D項錯誤。
4.答案：（1）氮源、碳源
（2）A菌能在培養平板中生長繁殖
（3）稀釋；溶菌圈
（4）假設P菌通過分泌某種化學物質使A菌溶解破裂
解析：（1）蛋白胨主要為細菌提供氮源、碳源和維生素等。
（2）將含有一定濃度A菌的少量培養基傾倒在固體培養平板上，凝固形成薄層。培養一段時間后，薄層變渾濁，表明A菌能在培養平板中生長繁殖。
（3）將含菌量較高的湖泊水樣稀釋后，依次分別涂布于不同的渾濁薄層上。培養一段時間后，能溶解A菌的菌落周圍會出現溶菌圈。
（4）略。
5.答案：C
解析：A、沸鹽水冷卻后再倒入壇中主要是為了防止乳酸菌被殺死，A錯誤；B、鹽水需要浸沒全部菜料主要目的是創造一個無氧的環境，有利于乳酸菌的發酵，B錯誤；C、蓋好壇蓋后，向壇蓋邊沿的水槽中注滿水目的是使氣體只能從泡菜壇排出而不能進入，保證壇內處于無氧環境，C正確；D、泡菜腌制過程中，亞硝酸鹽含量先升高，后降低，D錯誤。故選：C。
6.答案：AB
解析：A、家庭制作果酒和啤酒的工業化生產都是酵母菌無氧呼吸產生酒精的過程，A正確；B、酵母菌在營養充足和有氧條件下通過無性生殖大量繁殖，B正確；C、工業化生產啤酒，為了避免在發酵過程中雜菌的污染，在發酵前需要對原料進行滅菌處理，家庭制作果酒時需要用到水果表面的酵母菌，所以不能對原料滅菌，C錯誤；D、酵母菌不是有害菌種，家庭制作果酒發酵結束后不需要消毒處理，啤酒的工業化生產需要消毒，D錯誤。故選：AB。

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