資源簡介

大題05 生物技術與工程
【高考真題分布】
考點 考向 高考考題分布
生物技術與工程 發酵工程綜合考查； 細胞工程與基因工程綜合考查； 基因工程與生物技術的安全性與倫理性 2023山東卷 2023湖南卷 2023遼寧卷 2023北京卷 2023天津卷 2023重慶卷 2023浙江卷 2023湖北卷 2023海南卷 2023河北卷 2022全國卷 2022湖南卷 2022福建卷 2022廣東
【題型解讀】
一、現代生物科技專題部分包括發酵工程、細胞工程和基因工程三大部分，是每年高考必考的內容。通過近3年試題分析發現，應用微生物的分離純化技術以及基因工程、細胞工程和胚胎工程相結合的技術，可以解決很多社會關注度高的生產、生活、健康方面的熱點問題。這使得生物技術與工程在贏得普通大眾關注的同時，也贏得了高考命題專家的青睞，成為當下熱門的高頻考點。
二、生物科技專題題目呈現方式也多種多樣，有坐標曲線，有圖表，還有流程圖及文字介紹。這些新情境類題目一般具有很高的陌生度，特別是山東卷等大量的專業術語和未知的新技術、新流程的出現，往往讓考生不知所措。生物技術主要考察傳統發酵技術和微生物培養兩部分。傳統發酵技術與生產生活實際聯系密切，題目一般以生活、學習和實踐作為學科情景來考察考生分析解決問題的能力。微生物培養對知識要點和操作的要求更高，題目難度也相應大一些。題目一般以科學實驗和探究作為學科情境，考察考生的邏輯推理能力和實驗探究能力。生物技術與工程方面的考題可以很好的考察考生在新情境下獲取信息的理解能力、解決問題能力、實驗探究能力和創新能力。生物工程主要考察細胞工程、胚胎工程和基因工程三部分內容。細胞工程主要考察動物細胞工程中單克隆抗體的相關知識；胚胎工程主要結合優良牲畜的繁育情境進行綜合進行考察，與生產生活聯系密切；基因工程因其與遺傳部分聯系密切，成為高考必考內容，而且難度一般較大，題目情景也較為復雜，與當前前沿科技聯系密切。
三、備考時要注意關注生產生活實踐，關注傳統文化；關注科學實驗、科技前沿。眾多科學實驗為實驗探究類題目提供了情景載體，此類題目綜合考察考生在新情境下獲取信息的理解能力，綜合運用知識解決問題的能力，進行實驗設計、分析等的實驗探究能力和創新能力；關注生態問題，倡導綠色發展理念，提升生態意識。從近幾年高考題變化來看，要以教材為基礎，抓牢基礎知識和基本概念的教學。試題對教材中概念的細節考察越來越突出，生物學關鍵詞更是得分要點。教學中應引導學生關注教材細節內容，落實好對基本概念、基礎知識的學習、理解和應用。
典例一：發酵工程
1.（2021·湖南·高考真題）大熊貓是我國特有的珍稀野生動物，每只成年大熊貓每日進食竹子量可達12~38kg。大熊貓可利用竹子中8%的纖維素和27%的半纖維素。研究人員從大熊貓糞便和土壤中篩選纖維素分解菌。回答下列問題：
（1）纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即 。為篩選纖維素分解菌，將大熊貓新鮮糞便樣品稀釋液接種至以 為唯一碳源的固體培養基上進行培養，該培養基從功能上分類屬于 培養基。
（2）配制的培養基必須進行 滅菌處理，目的是 。檢測固體培養基滅菌效果的常用方法是 。
（3）簡要寫出測定大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌活菌數的實驗思路 。
（4）為高效降解農業秸稈廢棄物，研究人員利用從土壤中篩選獲得的3株纖維素分解菌，在37℃條件下進行玉米秸稈降解實驗，結果如表所示。在該條件下纖維素酶活力最高的是菌株 ，理由是 。
菌株 秸稈總重(g) 秸稈殘重(g) 秸稈失重（%） 纖維素降解率（%）
A 2.00 1.51 24.50 16.14
B 2.00 1.53 23.50 14.92
C 2.00 1.42 29.00 23.32
2.（2023·全國·高考真題）某研究小組設計了一個利用作物秸稈生產燃料乙醇的小型實驗。其主要步驟是：先將粉碎的作物秸稈堆放在底部有小孔的托盤中，噴水浸潤、接種菌T，培養一段時間后，再用清水淋洗秸稈堆（清水淋洗時菌T不會流失），在裝有淋洗液的瓶中接種酵母菌，進行乙醇發酵（酒精發酵）。實驗流程如圖所示。

回答下列問題。
在粉碎的秸稈中接種菌T，培養一段時間后發現菌T能夠將秸稈中的纖維素大量分解，其原因是
。
采用液體培養基培養酵母菌，可以用淋洗液為原料制備培養基，培養基中還需要加入氮源等營養成分，氮源的主要作用是 （答出1點即可）。通常，可采用高壓蒸汽滅菌法對培養基進行滅菌。在使用該方法時，為了達到良好的滅菌效果，需要注意的事項有
（答出2點即可）。
(3)將酵母菌接種到滅菌后的培養基中，擰緊瓶蓋，置于適宜溫度下培養、發酵。擰緊瓶蓋的主要目的是 。但是在酵母菌發酵過程中，還需適時擰松瓶蓋，原因是 。發酵液中的乙醇可用 溶液檢測。
(4)本實驗收集的淋洗液中的 可以作為酵母菌生產乙醇的原料。與以糧食為原料發酵生產乙醇相比，本實驗中乙醇生產方式的優點是 。
1．理清“3”種傳統食品的制作技術
2．培養基制備與微生物純化技術
【易錯提醒】　
(1)為了確定培養基的滅菌是否合格，微生物實驗一般會設置空白對照：隨機取若干滅菌后的空白平板培養基在適宜條件下培養一段時間，觀察培養基上是否有菌落生成。
(2)觀察菌落需用固體培養基，因此培養基要添加凝固劑，如瓊脂。
(3)倒平板的溫度一般在50 ℃左右較為適宜，溫度過高會燙手，溫度過低培養基又會凝固。
3．微生物分離與計數的實例
（2024·陜西商洛·模擬預測）反硝化細菌是一類能將硝態氮（NO3-—N）通過一系列中間產物（NO2-、NO、N2O）還原為氣態氮（N2）的細菌群，反硝化作用也是產堿過程。反硝化細菌對于解決水體富營養化和亞硝酸鹽對水生動物的毒害，具有十分重要的意義。某課題小組通過采集活性污泥樣品，并從中分離反硝化細菌，研究影響菌株反硝化作用的主要環境因素，為反硝化細菌在養殖廢水處理應用中提供理論指導。反硝化細菌的分離和鑒定流程如下，回答下列問題：
(1)將采集的活性污泥樣品1mL加入到裝有9mL、pH7．2的磷酸鹽緩沖液的l00mL燒杯中，取樣接種到富集培養基中培養，富集培養基的成分有：KNO32g，FeSO40．2g，KH2PO41．0g，MgSO40．5g，NaCl2g，CaCO35g，其中為反硝化細菌提供氮源的是 ，富集培養的目的是 。
(2)將富集后的樣品進行梯度稀釋后，使用 （填工具）將樣液均勻涂布在BTB培養基（BTB培養基初始pH=6．8，BTB是酸堿指示劑，酸性條件下為黃色，中性條件下為綠色，堿性條件下為藍色）上，每個稀釋度下涂布3個培養基是為了 ，放在30℃環境中培養2~3天后，挑選周圍顯 色的單菌落在固體培養基上劃線分離，獲得純菌株。
(3)將液體培養基導入大試管中，將杜氏小試管倒立放入大試管中，試管中的氣體排盡，接入純菌株，30℃恒溫培養5~7d，觀察到小管內有氣泡，檢測到N20，即可鑒定純菌株為目的菌。不能依據培養液中硝酸鹽的濃度變低來鑒定目的菌，原因是 。
(4)向幾組等量的滅菌后的反硝化培養基中分別以1%、3%、5%、7%和10%的接種量接入菌株N1，在30℃，120r/min搖床震蕩培養，24h后測量NO3-—N等指標，結果如右圖所示：
①本研究的目的是 。
②當投菌量達到 時，反硝化效果最好，NO3-—N和總脫氮率均較高。當投菌量繼續增加，NO3-—N和總脫氮率反而下降，推測可能的原因是 （答1點）。
典例二：基因工程與生物技術的安全性與倫理性
1.（2023·遼寧·高考真題）天然β淀粉酶大多耐熱性差，不利于工業化應用。我國學者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并將改造的基因與pLN23質粒重組后導入大腸桿菌，最終獲得耐高溫的β-淀粉酶。回答下列問題：
(1)上述過程屬于 工程。
(2)PCR中使用的聚合酶屬于 （填寫編號）。
①以DNA為模板的RNA聚合酶 ②以RNA為模板的RNA聚合酶
③以DNA為模板的DNA聚合酶 ④以RNA為模板的DNA聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484個氨基酸構成，研究發現，將該酶第476位天冬氨酸替換為天冬酰胺，耐熱性明顯提升。在圖1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替換堿基的引物是 （填寫編號）。

(4)為了使上述改造后的基因能在大腸桿菌中高效表達，由圖2所示的pLN23質粒構建得到基因表達載體。除圖示信息外，基因表達載體中還應該有目的基因（即改造后的基因）和 。

(5)目的基因（不含EcoRI酶切位點）全長為1．5kb，將其插入BamH I位點。用EcoR I酶切來自于不同大腸桿菌菌落的質粒DNA，經瓊脂糖凝膠電泳確定DNA片段長度，這一操作的目的是 。正確連接的基因表達載體被EcoR Ⅰ酶切后長度為 kb。
(6)采用PCR還能在分子水平上確定目的基因是否轉錄，根據中心法則，可通過 反應獲得PCR的模板。
2.（2023·河北·高考真題）單細胞硅藻具有生產生物柴油的潛在價值。研究者將硅藻脂質合成相關的蘋果酸酶（ME）基因構建到超表達載體，轉入硅藻細胞，以期獲得高產生物柴油的硅藻品系。
回答下列問題：
(1)根據DNA和蛋白質在特定濃度乙醇溶液中的 差異獲得硅藻粗提DNA，PCR擴增得到目的基因。
(2)超表達載體的基本組件包括復制原點、目的基因、標記基因、 和 等。本研究中目的基因為 。
(3)PCR擴增時引物通過 原則與模板特異性結合。根據表達載體序列設計了圖1所示的兩條引物，對非轉基因硅藻品系A和轉ME基因硅藻候選品系B進行PCR檢測，擴增產物電泳結果見圖2。其中，樣品1為本實驗的 組，樣品2有特異性擴增產物，結果表明 。

(4)利用單細胞硅藻生產生物柴油的影響因素包括胞內脂質含量和繁殖速率等。圖3為硅藻胞內脂質含量檢測結果。據圖分析，相對于品系A，品系B的胞內脂質含量平均水平明顯 。同時，還需測定 以比較在相同發酵條件下品系A與B的繁殖速率。

(5)胞內脂質合成需要大量ATP。ME催化蘋果酸氧化脫羧反應產生NADH。研究表明，品系B線粒體中ME含量顯著高于品系A。據此分析，ME基因超表達使線粒體中NADH水平升高， ，最終促進胞內脂質合成。
(6)相對于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻進行生物柴油生產的優勢之處為
。（答出兩點即可）
1．基因工程的3種基本工具
2.熟記基因工程的四個操作步驟
3．PCR技術原理與條件
4．PCR技術的過程
5．治療性克隆與生殖性克隆的關系
類型 項目 治療性克隆 生殖性克隆
區別 目的 利用克隆技術產生特定的細胞、組織和器官，用于醫學研究和治療 利用克隆技術產生獨立生存的新個體，獲得人的復制品
水平 細胞水平 個體水平
聯系 都屬于無性生殖；產生的新細胞、組織、器官或新個體，遺傳信息相同
6.區分試管嬰兒和設計試管嬰兒
(1)設計試管嬰兒比試管嬰兒多出的是過程④(遺傳學診斷)。
(2)試管嬰兒主要解決不孕夫婦的生育問題，設計試管嬰兒用于白血病、貧血癥等疾病的治療。
(3)兩者都是體外受精，并進行體外早期胚胎培養，都要經過胚胎移植，都是有性生殖。
（2024·山東煙臺·一模）哺乳動物體內一定含量的w-3多不飽和脂肪酸(LCPUFA)可以起到預防心血管疾病的作用，但LCPUFA在大多數動物體內不能合成，只能從食物中攝取。科研人員從秀麗隱桿線蟲中獲得LCPUFA合成酶基因fat-1(1229bp),培育轉fat-1基因家兔，其部分流程如圖一所示。
(1)PCR擴增fat-1基因的前提是 ，以用于特異性制備PCR擴增需要的引物。PCR擴增過程中，經過4輪循環后，得到的產物中只含一種引物的DNA分子占比為 。
(2)在構建PEBf質粒時，為確保fat-1基因按正確方向插入，需要雙酶切，還需對fat-1基因的引物進行相應設計。已知fat-1基因轉錄的模板鏈為a鏈，與b鏈結合的引物5'端添加了限制酶識別序列GAATTC,則另一引物5’端需添加的限制酶識別序列為 ,理由是
。
(3)轉染是將外源分子如DNA、RNA等導入真核細胞的技術。為了檢驗圖一家兔成纖維細胞是否轉染成功，科研人員分別提取培養液中各細胞的DNA，利用fat-1基因引物進行PCR擴增后電泳，部分結果如圖二所示。據圖分析，1組和2組分別是 細胞組PCR產物。
(4)檢測轉基因家兔細胞中是否含有LCPUFA合成酶，可采用 技術。如果fat-1基因已正確插入PEB質粒且成功轉染，但在轉基因家兔細胞中沒有檢測到LCPUFA合成酶，從構建基因表達載體的角度分析，可能的原因是 。
典例三：細胞工程與基因工程綜合考查
1.（2023·海南·高考真題）基因遞送是植物遺傳改良的重要技術之一，我國多個實驗室合作開發了一種新型基因遞送系統（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，簡稱CDB法）。圖1與圖2分別是利用常規轉化法和CDB法在某植物中遞送基因的示意圖。

回答下列問題。
(1)圖1中，從外植體轉變成愈傷組織的過程屬于 ；從愈傷組織到幼苗的培養過程需要的激素有生長素和 ，該過程還需要光照，其作用是 。
(2)圖1中的愈傷組織，若不經過共培養環節，直接誘導培養得到的植株可以保持植株A的 。圖1中，含有外源基因的轉化植株A若用于生產種子，其包裝需標注 。
(3)圖1與圖2中，農桿菌侵染植物細胞時，可將外源基因遞送到植物細胞中的原因是 。
(4)已知某酶（PDS）缺失會導致植株白化。某團隊構建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體（含有綠色熒光蛋白標記基因），利用圖2中的CDB法將該重組載體導入植株B，長出毛狀根，成功獲得轉化植株B．據此分析，從毛狀根中獲得陽性毛狀根段的方法是 ，圖2中，鑒定導入幼苗中的基因編輯載體是否成功發揮作用的方法是 ，依據是
。
與常規轉化法相比，采用CDB法進行基因遞送的優點是
（答出2點即可）。
2.（2022·福建·高考真題）美西螈具有很強的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬細胞在斷肢再生的早期起重要作用。為研究巨噬細胞的作用機制，科研人員制備了抗巨噬細胞表面標志蛋白CD14的單克隆抗體，具體方法如下。回答下列問題：
（一）基因工程抗原的制備
(1)根據美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR擴增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3’—OH與加入的脫氧核苷酸的5’—P形成磷酸二酯鍵，則新合成鏈的延伸方向是 （填“ 5’→3’ ”或“ 3’→5’ ”）。

(2)載體和CD14片段的酶切位點及相應的酶切 抗性基因序列如圖1所示。用Xho I和Sal 1分別酶切CD14和載體后連接，CD14接入載體時會形成正向連接和反向連接的兩種重組DNA．可進一步用這兩種限制酶對CD14的連接方向進行鑒定，理由是 。
培養能表達CD14蛋白的大腸桿菌，分離純化目的蛋白。
（二）抗CD14單克隆抗體的制備流程如圖2所示：

(3)步驟①和步驟⑤分別向小鼠注射 和 。
(4)步驟②所用的SP2/0細胞的生長特點是 。
(5)吸取③中的上清液到④的培養孔中，根據抗原—抗體雜交原理，需加入 進行專一抗體檢測，檢測過程發現有些雜交瘤細胞不能分泌抗CD14抗體，原因是
。
(6)步驟⑥從 中提取到大量的抗CD14抗體，用于檢測巨噬細胞。
3.（2022·全國·高考真題）某牧場引進一只產肉性能優異的良種公羊，為了在短時間內獲得具有該公羊優良性狀的大量后代，該牧場利用胚胎工程技術進行了相關操作。回答下列問題，
(1)為了實現體外受精需要采集良種公羊的精液，精液保存的方法是 。在體外受精前要對精子進行獲能處理，其原因是 ；精子體外獲能可采用化學誘導法，誘導精子獲能的藥物是 （答出1點即可）。利用該公羊的精子進行體外受精需要發育到一定時期的卵母細胞，因為卵母細胞達到 時才具備與精子受精的能力。
(2)體外受精獲得的受精卵發育成囊胚需要在特定的培養液中進行，該培養液的成分除無機鹽、激素、血清外，還含的營養成分有 （答出3點即可）等。將培養好的良種囊胚保存備用。
(3)請以保存的囊胚和相應數量的非繁殖期受體母羊為材料進行操作，以獲得具有該公羊優良性狀的后代。主要的操作步驟是 。
1．植物組織培養的過程——原理：植物細胞的全能性
(1)植物組織培養中添加蔗糖的目的是提供營養和調節滲透壓。
(2)脫分化階段不需要光，再分化階段需要光。
(3)生長素與細胞分裂素的比值高時，促進根的分化、抑制芽的形成；比值低時，促進芽的分化、抑制根的形成。
(4)體內細胞未表現全能性的原因：基因的表達具有選擇性。
2．植物體細胞雜交技術——原理：植物細胞的全能性、細胞膜的流動性
3．動物細胞培養(以貼壁細胞為例)——原理：細胞增殖
(1)動物細胞培養過程
①動物細胞培養中兩次使用胰蛋白酶的作用不同：第一次：處理剪碎的組織，使其分散成單個細胞；第二次：使貼壁生長的細胞從瓶壁上脫落下來分散成單個細胞。
②保障無菌、無毒的措施：對培養液和培養用具進行滅菌處理及在無菌條件下進行操作，定期更換培養液。
③區分原代培養和傳代培養的關鍵：是否分瓶培養。
4.單克隆抗體的制備——原理：細胞膜的流動性、細胞的增殖
(1)3種細胞特點不同：①B淋巴細胞：能產生抗體，不能大量增殖。②骨髓瘤細胞：能迅速大量增殖，不能產生抗體。③雜交瘤細胞：既能產生抗體，又能迅速大量增殖。
(2)兩次篩選目的不同：①第1次：獲得雜交瘤細胞。②第2次：獲得能分泌所需特異性抗體的雜交瘤細胞。
5．動物體細胞核移植技術——原理：動物細胞核的全能性
(1)核移植獲得的克隆動物與提供細胞核的親本性狀可能不同的三個原因：①克隆動物遺傳物質來自兩個親本。②發育過程中可能發生基因突變或染色體變異。③外界環境可能引起不可遺傳的變異。
(2)克隆動物的產生是無性繁殖，而試管動物則是在體外受精形成受精卵，由受精卵發育成的個體，因此屬于有性繁殖。
6．準確記憶哺乳動物的早期胚胎發育過程
(1)受精過程中的兩個標志：受精的標志是觀察到兩個極體或雌雄原核；受精完成的標志是雌雄原核融合完成。
(2)桑葚胚是由受精卵分裂形成的，沒有分化；而囊胚期雖然已進行細胞分化，但囊胚的內細胞團仍具有全能性。
7．胚胎移植的操作流程
(1)胚胎移植過程中的兩次檢查：第一次對收集的胚胎進行檢查；第二次對受體母畜是否妊娠進行檢查。
(2)胚胎移植產生的后代是有性生殖還是無性生殖，取決于胚胎發育的起點。若后代是由受精卵形成的，則為有性生殖；若后代是由核移植技術形成的重組細胞或胚胎分割形成的胚胎發育而成，則為無性生殖。
(3)用于移植的胚胎來源：體內正常受精的胚胎、核移植的胚胎和體外受精獲得的胚胎、轉基因獲得的胚胎、胚胎分割獲得的胚胎等。
(4)胚胎存活的基礎：受體不會對來自供體的胚胎發生免疫排斥反應。
（2024·湖南衡陽·模擬預測）雙特異性單克隆抗體是指可同時與癌細胞和藥物結合的特異性抗體。下圖是科研人員通過雜交瘤細胞技術（免疫的B細胞和骨髓瘤細胞雜交技術）生產能同時識別癌胚抗原和長春堿（一種抗癌藥物）的雙特異性單克隆抗體的部分過程。回答下列問題：

(1)過程①處理后 （填“需要”或“不需要”）對小鼠進行抗體檢測，理由是 。
(2)過程②常用滅活的病毒來誘導融合，其作用機理是 。
(3)過程③得到的雜交瘤細胞的特征是 。
(4)過程④一般在多孔細胞培養板上進行：先將細胞懸浮液稀釋到7～10個細胞/mL，再在每個培養孔中滴入0．1mL細胞稀釋液，其目的是 。
(5)請簡述圖中過程⑤的操作目的 。
1．（2023·北京·高考真題）自然界中不同微生物之間存在著復雜的相互作用。有些細菌具有溶菌特性，能夠破壞其他細菌的結構使細胞內容物釋出。科學家試圖從某湖泊水樣中分離出有溶菌特性的細菌。
(1)用于分離細菌的固體培養基包含水、葡萄糖、蛋白胨和瓊脂等成分，其中蛋白胨主要為細菌提供
和維生素等。
(2)A菌通常被用做溶菌對象。研究者將含有一定濃度A菌的少量培養基傾倒在固體培養平板上，凝固形成薄層。培養一段時間后，薄層變渾濁（如圖），表明 。
(3)為分離出具有溶菌作用的細菌，需要合適的菌落密度，因此應將含菌量較高的湖泊水樣 后，依次分別涂布于不同的渾濁薄層上。培養一段時間后，能溶解A菌的菌落周圍會出現 。采用這種方法，研究者分離、培養并鑒定出P菌。
(4)為探究P菌溶解破壞A菌的方式，請提出一個假設，該假設能用以下材料和設備加以驗證（主要實驗材料和設備：P菌、A菌、培養基、圓形濾紙小片、離心機和細菌培養箱）
。
2．（2023·重慶·高考真題）妊娠與子宮內膜基質細胞的功能密切相關。某研究小組通過如圖所示的實驗流程獲得了子宮內膜基質細胞，以期用于妊娠相關疾病的研究。

(1)手術獲得的皮膚組織需在低溫下運至實驗室，低溫對細胞中各種蛋白質的作用為 。
(2)過程①中，誘導形成PS細胞時，需提高成纖維細胞中4個基因的表達量，可采用 技術將這些基因導入該細胞。這4個基因的主要作用為：M基因促進增殖，S基因和C基因控制干細胞特性，K基因抑制凋亡和衰老。若成纖維細胞形成腫瘤細胞，最有可能的原因是 基因過量表達。
(3)培養iPS細胞時，應對所處環境定期消毒以降低細胞被污染風險。可用紫外線進行消毒的是_ ____（多選）。
A．培養基 B．培養瓶 C．細胞培養室 D．CO2培養箱
(4)過程②中，iPS細胞經歷的生命歷程為 。PCR技術可用于檢測子宮內膜基質細胞關鍵基因的mRNA水平，mRNA需經過 才能作為PCR擴增的模板。
3．（2023·天津·高考真題）基因工程：制備新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉發酵，則應導入多步分解淀粉所需的多種酶，推測這些酶生效的場所應該是 （填“細胞內”和“細胞外”）
(2)同源切割是一種代替限制酶、DNA連接酶將目的基因導入基因表達載體的方法。當目的基因兩側的小段序列與基因表達載體上某序列相同時，就可以發生同源切割，將目的基因直接插入。研究人員，運用同源切割的方式，在目的基因兩端加上一組同源序列A．B，已知酵母菌體內DNA有許多A-B序列位點可以同源切割插入。構建完成的目的基因結構如圖，則應選擇圖中的引物 對目的基因進行PCR。

(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作標記基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸轉化為對酵母菌有毒物質。
（i）導入目的基因的酵母菌應在 的培養基上篩選培養。由于需要導入多種酶基因，需要多次篩選，因此在導入一種目的基因后，要切除UGA基因，再重新導入。研究人員在UGA基因序列兩端加上酵母菌DNA中不存在的同源C．C’序列，以便對UGA基因進行切除。C．C’的序列方向將影響切割時同源序列的配對方式，進而決定DNA片段在切割后是否可以順利重連，如圖，則應選擇方式 進行連接。

（ii）切去UGA基因的酵母菌應在 的培養基上篩選培養。
(4)綜上，目的基因、標記基因和同源序列在導入酵母菌的基因表達載體上的排列方式應該如圖 。

4．（2023·北京·高考真題）變胖過程中，胰島B細胞會增加。增加的B細胞可能源于自身分裂（途徑I），也可能來自胰島中干細胞的增殖、分化（途徑Ⅱ）。科學家采用胸腺嘧啶類似物標記的方法，研究了L基因缺失導致肥胖的模型小鼠IK中新增B細胞的來源。
(1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶類似物，能很快進入細胞并摻入正在復制的DNA中，摻入DNA的EdU和BrdU均能與 互補配對，并可以被分別檢測。未摻入的EdU和BrdU短時間內即被降解。
(2)將處于細胞周期不同階段的細胞混合培養于多孔培養板中，各孔同時加入EdU，隨后每隔一定時間向一組培養孔加入BrdU，再培養十幾分鐘后收集該組孔內全部細胞，檢測雙標記細胞占EdU標記細胞的百分比（如圖）。圖中反映DNA復制所需時長的是從 點到 點。

(3)為研究變胖過程中B細胞的增殖，需使用一批同時變胖的小鼠。為此，本實驗使用誘導型基因敲除小鼠，即飼喂誘導物后小鼠的L基因才會被敲除，形成小鼠IK。科學家利用以下實驗材料制備小鼠IK：
①純合小鼠Lx：小鼠L基因兩側已插入特異DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌體，其編碼的酶進入細胞核后作用于x，導致兩個x間的DNA片段丟失；③Er基因：編碼的Er蛋白位于細胞質，與Er蛋白相連的物質的定位由Er蛋白決定；④口服藥T：小分子化合物，可誘導Er蛋白進入細胞核。請完善制備小鼠IK的技術路線： →連接到表達載體→轉入小鼠Lx→篩選目標小鼠→ →獲得小鼠IK。
各種細胞DNA復制所需時間基本相同，但途徑I的細胞周期時長（t1）是途徑Ⅱ細胞周期時長（t2）的三倍以上。據此，科學家先用EdU飼喂小鼠IK，t2時間后換用BrdU飼喂，再過t2時間后檢測B細胞被標記的情況。研究表明，變胖過程中增加的B細胞大多數來源于自身分裂，與之相應的檢測結果應是
。
5．（2023·山東·高考真題）科研人員構建了可表達J-V5融合蛋白的重組質粒并進行了檢測，該質粒的部分結構如圖甲所示，其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。

(1)與圖甲中啟動子結合的酶是 。除圖甲中標出的結構外，作為載體，質粒還需具備的結構有 （答出2個結構即可）。
(2)構建重組質粒后，為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物 。已知J基因轉錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的 （填“a鏈”或“b鏈”）相應部分的序列相同。
(3)重組質粒在受體細胞內正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應蛋白是否表達以及表達水平，結果如圖乙所示。其中，出現條帶1證明細胞內表達了 ，條帶2所檢出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重組質粒上的J基因表達的。
6．（2023·浙江·高考真題）賴氨酸是人體不能合成的必需氨基酸，而人類主要食物中的賴氨酸含量很低，利用生物技術可提高食物中賴氨酸含量。回答下列問題：
(1)植物細胞合成的賴氨酸達到一定濃度時，能抑制合成過程中兩種關鍵酶的活性，導致賴氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調節方式屬于 。根據這種調節方式，在培養基中添加 ，用于篩選經人工誘變的植物懸浮細胞，可得到抗賴氨酸類似物的細胞突變體，通過培養獲得再生植株。
(2)隨著轉基因技術與動物細胞工程結合和發展，2011年我國首次利用轉基因和體細胞核移植技術成功培育了高產賴氨酸轉基因克隆奶牛。其基本流程為：
①構建乳腺專一表達載體。隨著測序技術的發展，為獲取富含賴氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通過檢索 獲取其編碼序列，用化學合成法制備得到。再將獲得的目的基因與含有乳腺特異性啟動子的相應載體連接，構建出乳腺專一表達載體。
②表達載體轉入牛胚胎成纖維細胞（BEF）。將表達載體包裹到磷脂等構成的脂質體內，與BEF膜發生
，表達載體最終進入細胞核，發生轉化。
③核移植。將轉基因的BEF作為核供體細胞，從牛卵巢獲取卵母細胞，經體外培養及去核后作為 。將兩種細胞進行電融合，電融合的作用除了促進細胞融合，同時起到了 重組細胞發育的作用。
④重組細胞的體外培養及胚胎移植。重組細胞體外培養至 ，植入代孕母牛子宮角，直至小牛出生。
⑤檢測。DNA水平檢測：利用PCR技術，以非轉基因牛耳組織細胞作為陰性對照，以 為陽性對照，檢測到轉基因牛耳組織細胞中存在目的基因。RNA水平檢測：從非轉基因牛乳汁中的脫落細胞、轉基因牛乳汁中的脫落細胞和轉基因牛耳組織細胞，提取總RNA，對總RNA進行 處理，以去除DNA污染，再經逆轉錄形成cDNA，并以此為 ，利用特定引物擴增目的基因片段。結果顯示目的基因在轉基因牛乳汁中的脫落細胞內表達，而不在牛耳組織細胞內表達，原因是什么？ 。
7．（2023·全國·高考真題）接種疫苗是預防傳染病的一項重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的傳播，降低乙型肝炎發病率。乙肝病毒是一種DNA病毒。重組乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技術獲得的乙肝病毒表面抗原（一種病毒蛋白）。回答下列問題。
(1)接種上述重組乙肝疫苗不會在人體中產生乙肝病毒，原因是 。
(2)制備重組乙肝疫苗時，需要利用重組表達載體將乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）導入酵母細胞中表達。重組表達載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能識別載體中的啟動子并驅動目的基因轉錄的酶是 。
(3)目的基因導入酵母細胞后，若要檢測目的基因是否插入染色體中，需要從酵母細胞中提取 進行DNA分子雜交，DNA分子雜交時應使用的探針是 。
(4)若要通過實驗檢測目的基因在酵母細胞中是否表達出目的蛋白，請簡要寫出實驗思路。
。
8．（2023·湖南·高考真題）某些植物根際促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列問題：
(1)若從植物根際土壤中篩選分解淀粉的固氮細菌，培養基的主要營養物質包括水和 。
(2)現從植物根際土壤中篩選出一株解淀粉芽孢桿菌H，其產生的抗菌肽抑菌效果見表。據表推測該抗菌肽對 的抑制效果較好，若要確定其有抑菌效果的最低濃度，需在 μg·mL-1濃度區間進一步實驗。
測試菌 抗菌肽濃度/（ g mL-1）
55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86
金黃色葡萄球菌 - - - - - + +
枯草芽孢桿菌 - - - - - + +
禾谷鐮孢菌 - + + + + + +
假絲酵母 - + + + + + +
注：“+”表示長菌，“-”表示未長菌。
(3)研究人員利用解淀粉芽孢桿菌H的淀粉酶編碼基因M構建高效表達質粒載體，轉入大腸桿菌成功構建基因工程菌A。在利用A菌株發酵生產淀粉酶M過程中，傳代多次后，生產條件未變，但某子代菌株不再產生淀粉酶M。分析可能的原因是 （答出兩點即可）。
(4)研究人員通過肺上皮干細胞誘導生成肺類器官，可自組裝或與成熟細胞組裝成肺類裝配體，如圖所示。肺類裝配體培養需要滿足適宜的營養、溫度、滲透壓、pH以及 （答出兩點）等基本條件。肺類裝配體形成過程中是否運用了動物細胞融合技術 （填“是”或“否”）。

(5)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是一種耐藥菌，嚴重危害人類健康。科研人員擬用MRSA感染肺類裝配體建立感染模型，來探究解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽是否對MRSA引起的肺炎有治療潛力。以下實驗材料中必備的是 。
①金黃色葡萄球菌感染的肺類裝配體 ②MRSA感染的肺類裝配體 ③解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽 ④生理鹽水 ⑤青霉素（抗金黃色葡萄球菌的藥物） ⑥萬古霉素（抗MRSA的藥物）
9.（2022·湖南·高考真題）黃酒源于中國，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大發酵酒。發酵酒的釀造過程中除了產生乙醇外，也產生不利于人體健康的氨基甲酸乙酯（EC）。EC主要由尿素與乙醇反應形成，各國對酒中的EC含量有嚴格的限量標準。回答下列問題:
(1)某黃酒釀制工藝流程如圖所示，圖中加入的菌種a是 ，工藝b是 （填“消毒”或“滅菌”），采用工藝b的目的是 。
(2)以尿素為唯一氮源的培養基中加入 指示劑，根據顏色變化，可以初步鑒定分解尿素的細菌。尿素分解菌產生的脲酶可用于降解黃酒中的尿素，脲酶固定化后穩定性和利用效率提高，固定化方法有 （答出兩種即可）。
(3)研究人員利用脲酶基因構建基因工程菌L，在不同條件下分批發酵生產脲酶，結果如圖所示。推測 是決定工程菌L高脲酶活力的關鍵因素，理由是 。
(4)某公司開發了一種新的黃酒產品，發現EC含量超標。簡要寫出利用微生物降低該黃酒中EC含量的思路 。
10.（2023·湖北·高考真題）某病毒對動物養殖業危害十分嚴重。我國學者擬以該病毒外殼蛋白A為抗原來制備單克隆抗體，以期快速檢測該病毒，其主要技術路線如圖所示。

回答下列問題：
(1)與小鼠骨髓瘤細胞融合前，已免疫的脾細胞（含漿細胞） （填“需要”或“不需要”）通過原代培養擴大細胞數量；添加脂溶性物質PEG可促進細胞融合，該過程中PEG對細胞膜的作用是 。
(2)在雜交瘤細胞篩選過程中，常使用特定的選擇培養基（如HAT培養基），該培養基對 和 生長具有抑制作用。
(3)單克隆抗體篩選中，將抗體與該病毒外殼蛋白進行雜交，其目的是 。
(4)構建重組質粒需要使用DNA連接酶。下列屬于DNA連接酶底物的是 。

1.（2024·云南昭通·模擬預測）今年4月27日，大熊貓“丫丫”回國在社會上引起了巨大反響。自然狀態下的大熊貓繁殖能力較低，曾一度瀕臨滅絕，我國科學家利用胚胎工程的技術手段大大提高了熊貓的繁殖率，目前我國的熊貓數量已經有2400余只。請回答下列問題：
(1)大熊貓主要以竹子為食，研究人員為了從大熊貓糞便中篩選出纖維素分解菌，將大熊貓新鮮糞便樣品稀釋液接種至以 為唯一碳源的固體培養基上進行培養。配制的培養基可用 方法進行滅菌處理。檢測固體培養基滅菌效果的常用方法是 。
(2)大熊貓體內受精受孕率低，可利用體外受精。受精前需要對采集的精子進行 處理，收集的卵母細胞要培養至 期。
(3)為了進一步提高熊貓的產子率，科學家用了胚胎分割技術，該技術屬于 （填“有性”或“無性”）生殖，進行胚胎分割時，應選擇發育良好、形態正常的 。胚胎移植前有時需進行性別鑒定，目前SRY-PCR技術是哺乳動物性別鑒定最有效的方法，操作的基本程序是：從被測的囊胚中取 細胞，提取DNA，然后用位于Y染色體上的性別決定基因（即SRY基因）的一段堿基序列作為 ，用被測胚胎DNA作模板進行PCR擴增，若通過鑒定，出現陽性反應的胚胎為雄性。
2．（2024·河南開封·二模）蘋果不僅味道香甜，還具有很高的營養價值。用蘋果發酵的果酒具有加速新陳代謝、活血通絡、通便減肥等多種作用。圖1為簡易的發酵瓶，圖2為細胞呼吸的相關代謝途徑。請回答下列問題。
(1)從微生物培養的角度看，作為培養基的蘋果汁能夠為酵母菌提供的營養物質有 。
(2)將蘋果汁、酵母菌等原料裝入圖1所示發酵瓶，然后塞好瓶塞，夾緊進氣管和出氣管，在適宜的溫度條件下靜置。該過程中，發酵瓶內酵母菌可進行圖2中的 （選填編號）過程。
(3)請在坐標圖中，繪制釀造蘋果酒的過程中發酵瓶內酵母菌的種群數量變化曲線（繪出變化趨勢即可） 。酵母菌的數量測定可以用稀釋涂布平板法進行，其中使酵母菌液在培養基表面均勻分布的操作是 。也可以用 計數板對酵母菌進行計數。
(4)若將釀好的蘋果酒置于30～35℃溫度條件下，將發酵瓶的進氣管、出氣管分別 ，再加入適量的醋酸菌，一段時間后酒味會逐漸消失并出現醋酸味，蘋果酒逐漸轉變為蘋果醋。其主要原因是 。
(5)若在制作蘋果酒之前，打開圖1中進氣管、出氣管一段時間，其意圖與發酵工程基本環節中的
目的一致。
3．（2024·北京密云·模擬預測）三白草和魚腥草是同科不同屬的兩種藥用植物，二者因療效相近且具有疊加效應常被用作“藥對”。科研人員將復方的配伍（兩種或兩種以上藥物配合使用）用到個體生長或生產過程，并實現有效成分的工廠化生產的具體操作如圖1，進一步研究不同的原生質體密度對三白草和魚腥草原生質體融合率的影響，結果如圖2。

(1)圖1中①過程通過酶解法去除 獲取原生質體，并向三白草和魚腥草細胞酶解液中分別加入紅、綠熒光色素（帶熒光色素的原生質體仍能融合和再生）。過程②利用化學誘導劑 誘導融合，隨后在熒光顯微鏡下選擇帶 的雜種原生質體。
(2)由圖2可知，促進三白草和魚腥草原生質體融合的最適密度為 個/mL。
(3)通常情況下，能增加免疫器官的重量表明該物質具有一定的增強免疫力的作用。為判斷融合體對動物免疫力的影響，科研人員取同種小鼠30只，雌雄各半，隨機均分為三組，實驗處理如下表。
組別 A組 B組 C組（空白對照組）
實驗處理 三白草和魚腥草雜種愈傷組織的蒸餾水提取物 三白草和魚腥草直接混合后的蒸餾水提取物
每天一次等量灌胃，連續一周，檢測各組小鼠的胸腺重量
①表格中C組的實驗處理為 。
②若實驗結果為 ，則支持利用原生質體融合技術將復方的配伍提前并實現有效成分的工廠化生產。
4.（2023·山西太原·二模）科學家計劃將發光基因導入夾竹桃，將發光的夾竹桃種植到高速公路的兩旁，到那時，每當夜幕降臨，公路兩旁的夾竹桃熒光閃閃，樹樹相連，公路將變成美麗的熒光世界。下圖是轉基因發光夾竹桃的培育過程，含發光基因的DNA片段和Ti質粒上的箭頭表示相關限制酶的酶切位點。請分析并回答下列問題：
(1)若發光基因是從螢火蟲細胞內提取的mRNA逆轉錄形成的，則發光基因中 （填“含有”或“不含”）啟動子。利用PCR技術擴增發光基因時，需依據 合成引物，擴增發光基因的過程中，DNA解旋為單鏈后要適當 （填“升高”或“降低”）反應體系溫度，以便引物與模板結合。
(2)發光基因應導入Ti質粒的 上，用圖中的Ti質粒和發光基因構建重組質粒時，不宜僅使用BamHⅠ酶切割，原因是 ，應選用 酶對外源DNA片段、Ti質粒進行切割。
(3)Ti質粒上的四環素抗性基因的作用是 ，將轉基因發光夾竹桃細胞培養成幼苗，要經過⑤⑥ 兩個過程。
5．（2024·寧夏銀川·一模）我國科學家突破了體細胞克隆猴的世界難題，成功培育出世界上首個體細胞克隆猴——“中中”和“華華”。這標志著我國將率先開啟以獼猴作為實驗動物模型的時代。如圖為克隆猴的流程示意圖。請回答下列問題：

(1)我國克隆猴利用的是猴胎兒成纖維細胞，該細胞是一種已分化的體細胞，從理論上分析，它具有細胞的全能性，這是因為 。
(2)克隆猴時需要進行“去核”操作，即去掉卵母細胞的細胞核。先在體外培養卵母細胞讓其分裂，一般選擇 的細胞進行去核操作；然后進行“核移植”，即將體細胞的細胞核移到去核卵母細胞中形成重組細胞；此時采用的技術是 ；得到的重組細胞再進行人工激活使其分裂形成胚胎。
(3)科學家將79枚克隆胚胎移植到21只代孕母猴中，最終只有兩只母猴正常懷孕產下“中中”和“華華”，它倆的性別是否一致？ ；原因是 。
(4)克隆動物有很多優點：①可以加速家畜遺傳改良進程，促進優良畜群繁育；② 。
6．（2024·甘肅·一模）利用體細胞核移植來克隆高產奶牛的大致流程如下圖，其中 Kdm4d為組蛋白去甲基化酶。回答下列問題：
過程①應選用處于 的卵母細胞，采用顯微操作法去“核”，其實是去除
。
(2)重構細胞經分裂、發育至 時期，可移植到受體母牛子宮中。移植之前，需要對受體母牛進行 處理。若要獲得遺傳性狀完全相同的多只犢牛，可對重構胚進行 ，再進行移植。犢牛的表型不完全與高產奶牛 致，原因可能是 (答兩點)。
(3)科研人員為確定 Kdm4d的 mRNA 的作用，進行了如下實驗，其中 A 組用正常培養液培養重構胚，B組用正常培養液培養注入了 Kdm4d 的 mRNA 的重構胚，實驗結果如圖所示。根據實驗結果推測 Kdm4d的mRNA的作用是 。
7．（2024·貴州·模擬預測）在植物基因工程中外源基因表達量不足是目前利用轉基因植物生產植物疫苗時存在的問題之一。研究表明，啟動子的串聯能增強外源基因的表達，研究人員擬構建含有兩個35s啟動子（35s啟動子是花椰菜花葉病毒的一種強啟動子）串聯的轉基因苜蓿。一個35s啟動子包括1個A區和2個B區。圖甲表示35s啟動子及其附近區域分布的限制酶識別位點，已知不同限制酶切割后得到的黏性末端各不相同。圖乙表示待轉入第二個35s啟動子的重組質粒的構成組件及其上的限制酶識別位點。
(1)利用PCR技術可以擴增35s啟動子，PCR技術的原理是 ，此技術設計引物很關鍵，引物是 。利用此技術擴增的35s啟動子可以在PCR擴增儀中自動完成，完成以后，常采用 來鑒定PCR的產物。
(2)根據限制酶識別位點，為了讓第二個35s啟動子準確串聯在待轉入的重組質粒上，應選擇 限制酶切割圖甲的DNA片段。
(3)為了篩選出正確串聯了兩個35s啟動子的新重組質粒菌落，研究人員用含有不同抗生素的平板進行篩選，平板類型丙和丁加入的抗生素分別是 、 ，得到①②③三類菌落，其生長狀況如下表（+代表生長，-表示不生長）。根據表中結果判斷，應選擇的菌落是 （填“①”“②”或“③”）類。若新獲得的轉基因苜蓿中目的基因的表達量大幅增加，可以說明串聯兩個35s啟動子能 。
平板類型 ① ② ③
甲：無抗生素 + + +
乙：卡那霉素 - - +
丙：？ - + +
丁：？ - - +
8．（2024·山東聊城·一模）易錯PCR是利用低保真的Taq酶和改變PCR的反應條件，降低DNA復制的準確性，在新DNA鏈的合成過程中增加堿基錯配，從而使擴增產物出現較多點突變的一種體外誘導DNA序列變異的方法。從自然界中的生物體內分離得到的天然酶，在工業生產環境中催化效率往往較低。下圖是研究人員利用易錯PCR技術對某種天然酶進行改造，獲得了高催化效率的酶的流程示意圖。回答下列問題：

(1)在體外利用PCR技術擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是 。PCR反應體系中需添加引物，引物的作用是 。
(2)圖中步驟①為易錯PCR過程，其擴增過程中需要加入Taq酶，這是因為Taq酶具有 的特點。圖中步驟②是將構建的重組質粒溶于緩沖液中與用 處理的受體菌混合，在一定溫度下完成轉化。轉化是指 。
(3)Taq酶的某一區域負責將堿基與模板鏈正確地互補配對，Mn2+可以降低這一功能；非互補的堿基對由于氫鍵不易形成，穩定性差，Mg2+可以提高該錯配區的穩定性。因此，與普通PCR相比，易錯PCR的反應體系中應適當 （填“提高”或“降低”）Mn2+濃度、 （填“提高”或“降低”）Mg2+濃度。
(4)闡述通過易錯PCR技術改造天然酶與通過蛋白質工程改造天然酶原理的本質區別
。
9．（2024·陜西商洛·模擬預測）乙肝基因工程疫苗是用基因工程技術將乙型肝炎表面抗原基因片段（轉錄以β鏈為模板）重組到中國倉鼠卵巢細胞（CHO）內，通過細胞培養，使其大量分泌乙肝表面抗原（HBsAg）于培養液中，經純化加佐劑氫氧化鋁后制成。利用基因工程技術生產乙肝疫苗流程。回答下列問題：
限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ MfeⅠ KpnⅠ HindⅢ
識別序列和切割位點 G↓GATCC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT
(1)根據圖表，應使用限制酶 切割圖中質粒，使用限制酶 切割圖中含乙型肝炎表面抗原基因的DNA片段，以獲得能正確表達乙型肝炎表面抗原基因的重組質粒。
(2)研究人員欲對乙型肝炎表面抗原基因的mRNA進行RT—PCR，已知其mRNA的序列為5＇-UGAACGCUA…（中間序列）…GUCGACUCG-3＇。為了便于將擴增后的基因和載體成功構建成重組質粒，用于PCR擴增的引物應為 。PCR反應體系中，需要加入Mg2+，目的是 。至少經過 次循環才能獲得雙鏈等長的乙型肝炎表面抗原基因。
(3)培養小鼠卵巢細胞時，首先應保證其處于 的環境，除了適宜的營養物質、溫度等條件外，還需要控制的氣體條件是 。檢測小鼠卵巢細胞是否產生HBsAg，常用的方法是 。
10．（23-24高三下·湖南·階段練習）在未斷奶的小牛胃中存在一種凝乳酶，被廣泛應用于奶酪和酸奶的生產。科學家將編碼牛凝乳酶的基因（長度1.5kb）導入大腸桿菌獲得工程菌，再通過工業發酵批量生產凝乳酶。
(1)提取小牛胃黏膜組織中的mRNA，經逆轉錄得到cDNA，選擇合適的引物進行PCR擴增，PCR引物堿基數一般在20～30個之間，過短則導致 。
(2)如表為操作過程中可能用到的限制酶，圖1為獲得的目的基因及末端（除黏性末端序列外，其他堿基序列省略），圖2為要使用的質粒，其中的Tetr、Ampr分別為四環素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因。對質粒進行切割時，選用的兩種限制酶為 。目的基因和質粒能連接成重組質粒的原因是
，導入的目的基因在受體細胞中能成功表達的理論基礎是 。
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
識別位點及切割位點 —G↓GATCC— —T↓GATCG— —CCC↓GGG— —↓GATC—
(3)將轉化后的大腸桿菌接種在含 的培養基上進行培養，隨機挑取菌落（分別編號為1、2、3、4）培養并提取質粒，用（2）中選用的兩種限制酶進行酶切，酶切產物經電泳分離，結果如下圖， 號菌落的質粒很可能是含目的基因的重組質粒。
注：M為指示分子大小的標準參照物；小于0.2kb的DNA分子條帶未出現在圖中
(4)已知凝乳酶第20、24位氨基酸變成半胱氨酸，其活性可顯著提高。科研人員希望運用蛋白質工程技術獲得活性更強的凝乳酶，請選用合適的措施編號并排序： 。（用箭頭表示）
①重組DNA分子導入大腸桿菌
②隨機改變凝乳酶基因的序列
③分析突變蛋白功能，設計結構
④改變凝乳酶基因的特定序列
⑤培養細胞后提純突變蛋白
⑥將改變后的凝乳酶基因與質粒重組大題05 生物技術與工程
【高考真題分布】
考點 考向 高考考題分布
生物技術與工程 發酵工程綜合考查； 細胞工程與基因工程綜合考查； 基因工程與生物技術的安全性與倫理性 2023山東卷 2023湖南卷 2023遼寧卷 2023北京卷 2023天津卷 2023重慶卷 2023浙江卷 2023湖北卷 2023海南卷 2023河北卷 2022全國卷 2022湖南卷 2022福建卷 2022廣東
【題型解讀】
一、現代生物科技專題部分包括發酵工程、細胞工程和基因工程三大部分，是每年高考必考的內容。通過近3年試題分析發現，應用微生物的分離純化技術以及基因工程、細胞工程和胚胎工程相結合的技術，可以解決很多社會關注度高的生產、生活、健康方面的熱點問題。這使得生物技術與工程在贏得普通大眾關注的同時，也贏得了高考命題專家的青睞，成為當下熱門的高頻考點。
二、生物科技專題題目呈現方式也多種多樣，有坐標曲線，有圖表，還有流程圖及文字介紹。這些新情境類題目一般具有很高的陌生度，特別是山東卷等大量的專業術語和未知的新技術、新流程的出現，往往讓考生不知所措。生物技術主要考察傳統發酵技術和微生物培養兩部分。傳統發酵技術與生產生活實際聯系密切，題目一般以生活、學習和實踐作為學科情景來考察考生分析解決問題的能力。微生物培養對知識要點和操作的要求更高，題目難度也相應大一些。題目一般以科學實驗和探究作為學科情境，考察考生的邏輯推理能力和實驗探究能力。生物技術與工程方面的考題可以很好的考察考生在新情境下獲取信息的理解能力、解決問題能力、實驗探究能力和創新能力。生物工程主要考察細胞工程、胚胎工程和基因工程三部分內容。細胞工程主要考察動物細胞工程中單克隆抗體的相關知識；胚胎工程主要結合優良牲畜的繁育情境進行綜合進行考察，與生產生活聯系密切；基因工程因其與遺傳部分聯系密切，成為高考必考內容，而且難度一般較大，題目情景也較為復雜，與當前前沿科技聯系密切。
三、備考時要注意關注生產生活實踐，關注傳統文化；關注科學實驗、科技前沿。眾多科學實驗為實驗探究類題目提供了情景載體，此類題目綜合考察考生在新情境下獲取信息的理解能力，綜合運用知識解決問題的能力，進行實驗設計、分析等的實驗探究能力和創新能力；關注生態問題，倡導綠色發展理念，提升生態意識。從近幾年高考題變化來看，要以教材為基礎，抓牢基礎知識和基本概念的教學。試題對教材中概念的細節考察越來越突出，生物學關鍵詞更是得分要點。教學中應引導學生關注教材細節內容，落實好對基本概念、基礎知識的學習、理解和應用。
典例一：發酵工程
1.（2021·湖南·高考真題）大熊貓是我國特有的珍稀野生動物，每只成年大熊貓每日進食竹子量可達12~38kg。大熊貓可利用竹子中8%的纖維素和27%的半纖維素。研究人員從大熊貓糞便和土壤中篩選纖維素分解菌。回答下列問題：
（1）纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即 。為篩選纖維素分解菌，將大熊貓新鮮糞便樣品稀釋液接種至以 為唯一碳源的固體培養基上進行培養，該培養基從功能上分類屬于 培養基。
（2）配制的培養基必須進行 滅菌處理，目的是 。檢測固體培養基滅菌效果的常用方法是 。
（3）簡要寫出測定大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌活菌數的實驗思路 。
（4）為高效降解農業秸稈廢棄物，研究人員利用從土壤中篩選獲得的3株纖維素分解菌，在37℃條件下進行玉米秸稈降解實驗，結果如表所示。在該條件下纖維素酶活力最高的是菌株 ，理由是 。
菌株 秸稈總重(g) 秸稈殘重(g) 秸稈失重（%） 纖維素降解率（%）
A 2.00 1.51 24.50 16.14
B 2.00 1.53 23.50 14.92
C 2.00 1.42 29.00 23.32
【答案】
C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶 纖維素 選擇
高壓蒸汽
為了殺死培養基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子） 不接種培養（或空白培養 ）
將大熊貓新鮮糞便樣液稀釋適當倍數后，取0.1mL涂布到若干個平板（每個稀釋度至少涂布三個平板），對菌落數在30～300的平板進行計數，則可根據公式推測 大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌活菌數
C 接種C菌株后秸稈失重最多，纖維素降解率最大
【分析】
1、分解纖維素的微生物分離的實驗原理：
（1）土壤中存在著大量纖維素分解酶，包括真菌、細菌和放線菌等，它們可以產生纖維素酶。纖維素酶是一種復合酶，可以把纖維素分解為纖維二糖，進一步分解為葡萄糖使微生物加以利用，故在用纖維素作為唯一碳源的培養基中，纖維素分解菌能夠很好地生長，其他微生物則不能生長；
（2）在培養基中加入剛果紅，可與培養基中的纖維素形成紅色復合物，當纖維素被分解后，紅色復合物不能形成，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈，從而可篩選纖維素分解菌。
2、消毒和滅菌：
消毒 滅菌
概念 使用較為溫和的物理或化學方法殺死物體表面或內部的部分微生物（不包芽孢和孢子） 使用強烈的理化因素殺死物體內外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化學藥劑消毒法、紫外線消毒法 灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌
適用對象 操作空間、某些液體、雙手等 接種環、接種針、玻璃器皿、培養基等
【詳解】
（1）纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。在用纖維素作為唯一碳源的培養基中，纖維素分解菌能夠很好地生長，其他微生物則不能生長。為篩選纖維素分解菌，將大熊貓新鮮糞便樣品稀釋液接種至以纖維素為唯一碳源的固體培養基上進行培養；培養基從功能上分類可分為選擇培養基和鑒別培養基，故該培養基從功能上分類屬于選擇培養基。
（2）配制培養基的常用高壓蒸汽滅菌，即將培養基置于壓力100 kPa、溫度121℃條件下維持15～30分鐘，目的是為了殺死培養基中的所有微生物（微生物和芽孢、孢子）。為檢測滅菌效果可對培養基進行空白培養，即將未接種的培養基在適宜條件下培養一段時間，若在適宜條件下培養無菌落出現，說明培養基滅菌徹底，否則說明培養基滅菌不徹底。
（3）為測定大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌活菌數，常采用稀釋涂布平板法，在適宜的條件下對大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌進行純化并計數時，對照組應該涂布等量的無菌水。將大熊貓新鮮糞便樣液稀釋適當倍數后，取0.1mL涂布到若干個平板（每個稀釋度至少涂布三個平板），對菌落數在30～300的平板進行計數，則可根據公式推測大熊貓新鮮糞便中纖維素分解菌活菌數。
（4）測定酶活力時可以用單位時間內、單位體積中反應物的減少量或產物的增加量來表示。由表格可知，在適宜的條件下，C菌株在相同的溫度和時間下，秸稈失重最多，纖維素降解率最大，說明該菌株的纖維素分解菌產生的纖維素酶活力最大。
【點睛】本題考查微生物的實驗室培養，要求考生識記計數微生物的方法；識記培養基的種類及功能；掌握纖維素分解分離和鑒別的原理，能結合所學的知識準確答題。
2.（2023·全國·高考真題）某研究小組設計了一個利用作物秸稈生產燃料乙醇的小型實驗。其主要步驟是：先將粉碎的作物秸稈堆放在底部有小孔的托盤中，噴水浸潤、接種菌T，培養一段時間后，再用清水淋洗秸稈堆（清水淋洗時菌T不會流失），在裝有淋洗液的瓶中接種酵母菌，進行乙醇發酵（酒精發酵）。實驗流程如圖所示。

回答下列問題。
在粉碎的秸稈中接種菌T，培養一段時間后發現菌T能夠將秸稈中的纖維素大量分解，其原因是
。
采用液體培養基培養酵母菌，可以用淋洗液為原料制備培養基，培養基中還需要加入氮源等營養成分，氮源的主要作用是 （答出1點即可）。通常，可采用高壓蒸汽滅菌法對培養基進行滅菌。在使用該方法時，為了達到良好的滅菌效果，需要注意的事項有
（答出2點即可）。
(3)將酵母菌接種到滅菌后的培養基中，擰緊瓶蓋，置于適宜溫度下培養、發酵。擰緊瓶蓋的主要目的是 。但是在酵母菌發酵過程中，還需適時擰松瓶蓋，原因是 。發酵液中的乙醇可用 溶液檢測。
(4)本實驗收集的淋洗液中的 可以作為酵母菌生產乙醇的原料。與以糧食為原料發酵生產乙醇相比，本實驗中乙醇生產方式的優點是 。
【答案】
(1)菌T能夠分泌纖維素酶
(2)為合成微生物細胞結構提供原料（微生物細胞中的含氮物質，如核酸、蛋白質、磷脂） ①把鍋內的水加熱煮沸，將其中原有的冷空氣徹底排除；②為達到良好的滅菌效果，一般在壓力為100 kPa，溫度為121℃的條件下，維持15~30 min；③無菌包不宜過大，不宜過緊，各包裹間要有間隙，使蒸汽能對流易滲透到包裹中央，有利于蒸汽流通；④滅菌完成后，應使鍋內蒸氣壓力緩慢降低，排氣時間不少于10一12分鐘。
(3) 制造無氧環境 排出二氧化碳 酸性的重鉻酸鉀溶液
(4) 葡萄糖 節約糧食、廢物利用、清潔環保、不污染環境、生產成本低、原料來源廣
【分析】果酒的制作離不開酵母菌，酵母菌是兼性厭氧微生物，在有氧條件下，酵母菌進行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在無氧條件下，酵母菌能進行酒精發酵。故果酒的制作原理是酵母菌無氧呼吸產生酒精，酵母菌最適宜生長繁殖的溫度范圍是18～30℃；生產中是否有酒精的產生，可用酸性重鉻酸鉀來檢驗，該物質與酒精反應呈現灰綠色。
【詳解】
（1）菌T能夠分泌纖維素酶，纖維素酶能將纖維素最終分解為葡萄糖，因此在粉碎的秸稈中接種菌T，培養一段時間后發現菌T能夠將秸稈中的纖維素大量分解。
（2）培養基的主要成分：水、碳源、氮源、無機鹽，其中氮源主要為合成微生物的細胞結構提供原料（微生物細胞中的含氮物質，如核酸、蛋白質、磷脂）。 高壓蒸汽滅菌法的注意的事項有①把鍋內的水加熱煮沸，將其中原有的冷空氣徹底排除后，將鍋密閉，如果高壓鍋內的空氣未排除或未完全排除，則蒸汽不能達到飽和，蒸汽的溫度未達到要求的高度，結果導致滅菌的失敗；②為達到良好的滅菌效果，一般在壓力為100 kPa，溫度為121℃的條件下，維持15~30 min；③無菌包不宜過大，不宜過緊，各包裹間要有間隙，使蒸汽能對流易滲透到包裹中央，有利于蒸汽流通；④滅菌完成后，應使鍋內蒸氣壓力緩慢降低，排氣時間不少于10一12分鐘，否則鍋內蒸氣壓力突然降低，液體突然沸騰，沖走瓶蓋，使液體噴出或使容器破裂。
（3）果酒的制作原理是酵母菌無氧呼吸產生酒精，將酵母菌接種到滅菌后的培養基中進行酒精發酵，酒精發酵需要在無氧的條件下進行，此時擰緊瓶蓋的主要目的是制造無氧環境。酵母菌進行無氧呼吸產生酒精和二氧化碳，在發酵過程中密閉，所以需要根據發酵進程適時擰松瓶蓋放出二氧化碳，酒精可用酸性重鉻酸鉀溶液來檢測，該物質與酒精反應呈現灰綠色。
（4）與以糧食為原料發酵生產乙醇相比，利用纖維素為原料生產乙醇具有節約糧食、廢物利用、清潔環保、不污染環境、生產成本低、原料來源廣等優點。
1．理清“3”種傳統食品的制作技術
2．培養基制備與微生物純化技術
【易錯提醒】　
(1)為了確定培養基的滅菌是否合格，微生物實驗一般會設置空白對照：隨機取若干滅菌后的空白平板培養基在適宜條件下培養一段時間，觀察培養基上是否有菌落生成。
(2)觀察菌落需用固體培養基，因此培養基要添加凝固劑，如瓊脂。
(3)倒平板的溫度一般在50 ℃左右較為適宜，溫度過高會燙手，溫度過低培養基又會凝固。
3．微生物分離與計數的實例
（2024·陜西商洛·模擬預測）反硝化細菌是一類能將硝態氮（NO3-—N）通過一系列中間產物（NO2-、NO、N2O）還原為氣態氮（N2）的細菌群，反硝化作用也是產堿過程。反硝化細菌對于解決水體富營養化和亞硝酸鹽對水生動物的毒害，具有十分重要的意義。某課題小組通過采集活性污泥樣品，并從中分離反硝化細菌，研究影響菌株反硝化作用的主要環境因素，為反硝化細菌在養殖廢水處理應用中提供理論指導。反硝化細菌的分離和鑒定流程如下，回答下列問題：
(1)將采集的活性污泥樣品1mL加入到裝有9mL、pH7．2的磷酸鹽緩沖液的l00mL燒杯中，取樣接種到富集培養基中培養，富集培養基的成分有：KNO32g，FeSO40．2g，KH2PO41．0g，MgSO40．5g，NaCl2g，CaCO35g，其中為反硝化細菌提供氮源的是 ，富集培養的目的是 。
(2)將富集后的樣品進行梯度稀釋后，使用 （填工具）將樣液均勻涂布在BTB培養基（BTB培養基初始pH=6．8，BTB是酸堿指示劑，酸性條件下為黃色，中性條件下為綠色，堿性條件下為藍色）上，每個稀釋度下涂布3個培養基是為了 ，放在30℃環境中培養2~3天后，挑選周圍顯 色的單菌落在固體培養基上劃線分離，獲得純菌株。
(3)將液體培養基導入大試管中，將杜氏小試管倒立放入大試管中，試管中的氣體排盡，接入純菌株，30℃恒溫培養5~7d，觀察到小管內有氣泡，檢測到N20，即可鑒定純菌株為目的菌。不能依據培養液中硝酸鹽的濃度變低來鑒定目的菌，原因是 。
(4)向幾組等量的滅菌后的反硝化培養基中分別以1%、3%、5%、7%和10%的接種量接入菌株N1，在30℃，120r/min搖床震蕩培養，24h后測量NO3-—N等指標，結果如右圖所示：
①本研究的目的是 。
②當投菌量達到 時，反硝化效果最好，NO3-—N和總脫氮率均較高。當投菌量繼續增加，NO3-—N和總脫氮率反而下降，推測可能的原因是 （答1點）。
【答案】
(1) KNO3 對反硝化細菌進行擴增
(2) 涂布器 設置重復，取平均值，減少實驗誤差 藍
(3)其他微生物也能利用硝酸鹽進行代謝，硝酸鹽濃度同樣會降低
(4) 探究反硝化細菌投菌量（接種量）對反硝化效果的影響 5% 投菌量過大，使培養基中的碳源很快消耗完，細菌數量下降；或是由于投菌量過大，耗氧速度加快，使體系中氧氣供應不足，不利于細菌生長和代謝
【分析】微生物接種常用的兩種方法：①平板劃線法：將已經熔化的培養基倒入培養皿制成平板，接種，劃線，在恒溫箱里培養。在線的開始部分，微生物往往連在一起生長，隨著線的延伸，菌數逐漸減少，最后可能形成單個菌落。②稀釋涂布平板法：將待分離的菌液經過足夠稀釋后，均勻涂布在培養皿表面，經培養后，可形成單菌落。
【詳解】
（1）培養基的成分主要包括碳源、氮源、水、無機鹽等，培養基中KNO3含有N，可以提供氮源。富集培養的目的是對反硝化細菌進行擴增，增加目的菌落的數量。
（2）稀釋涂布平板法用到涂布器將樣液均勻涂布在BTB培養基上，每個稀釋度下涂布3個培養基是為了設置重復，取平均值，減少實驗誤差；分析題干，反硝化細菌可以產生堿性物質，BTB是酸堿指示劑堿性條件下為藍色，放在30℃環境中培養2~3天后，挑選周圍顯藍色的單菌落在固體培養基上劃線分離，獲得純菌株。
（3）反硝化細菌和其他微生物都能利用硝酸鹽進行代謝，硝酸鹽濃度同樣會降低，因此不能依據培養液中硝酸鹽的濃度變低來鑒定目的菌。
（4）①分析題干，該實驗的自變量是菌株N1的接種量，因變量是反硝化效果，因此可知，本研究的目的是探究反硝化細菌投菌量（接種量）對反硝化效果的影響；
②分析圖，當投菌量達到5%時，反硝化效果最好，NO3-—N和總脫氮率均較高。當投菌量繼續增加，NO3-—N和總脫氮率反而下降，因為投菌量過大，使培養基中的碳源很快消耗完，細菌數量下降；或是由于投菌量過大，耗氧速度加快，使體系中氧氣供應不足，不利于細菌生長和代謝。
典例二：基因工程與生物技術的安全性與倫理性
1.（2023·遼寧·高考真題）天然β淀粉酶大多耐熱性差，不利于工業化應用。我國學者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并將改造的基因與pLN23質粒重組后導入大腸桿菌，最終獲得耐高溫的β-淀粉酶。回答下列問題：
(1)上述過程屬于 工程。
(2)PCR中使用的聚合酶屬于 （填寫編號）。
①以DNA為模板的RNA聚合酶 ②以RNA為模板的RNA聚合酶
③以DNA為模板的DNA聚合酶 ④以RNA為模板的DNA聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484個氨基酸構成，研究發現，將該酶第476位天冬氨酸替換為天冬酰胺，耐熱性明顯提升。在圖1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替換堿基的引物是 （填寫編號）。

(4)為了使上述改造后的基因能在大腸桿菌中高效表達，由圖2所示的pLN23質粒構建得到基因表達載體。除圖示信息外，基因表達載體中還應該有目的基因（即改造后的基因）和 。

(5)目的基因（不含EcoRI酶切位點）全長為1．5kb，將其插入BamH I位點。用EcoR I酶切來自于不同大腸桿菌菌落的質粒DNA，經瓊脂糖凝膠電泳確定DNA片段長度，這一操作的目的是 。正確連接的基因表達載體被EcoR Ⅰ酶切后長度為 kb。
(6)采用PCR還能在分子水平上確定目的基因是否轉錄，根據中心法則，可通過 反應獲得PCR的模板。
【答案】
(1)蛋白質
(2)③
(3)②
(4)標記基因
(5) 篩選導入目的基因的大腸桿菌 5.7
(6)逆轉錄
【分析】基因工程技術的基本步驟：
1、目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。2、基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。3、將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。4、目的基因的檢測與鑒定：（1）分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。（2）個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。
【詳解】
（1）根據蛋白質的功能改變基因的結構，最終獲得耐高溫的β-淀粉酶，這屬于蛋白質工程。
（2）PCR的原理是DNA雙鏈復制，利用的酶是耐熱的DNA聚合酶，合成子鏈時是以DNA為模板。
（3）根據β-淀粉酶的編碼序列，替換的堿基在編碼序列中，則利用的引物應該把編碼序列全部擴增在內，則所用的引物是②③。含已替換堿基的引物是②。
（4）作為基因工程載體的質粒應該包含：復制原點、限制酶的切割位點、標記基因、啟動子和終止子，根據圖示的表達載體可知應還要包括目的基因和標記基因。
（5）目的基因通過表達載體導入大腸桿菌中，大腸桿菌菌落的質粒DNA，經瓊脂糖凝膠電泳確定DNA片段長度，這一操作的目的是篩選出導入目的基因的大腸桿菌。正確連接的基因表達載體只有一個EcoR Ⅰ酶切位點，則切割后的長度為4.2+1.5=5.7kb。
（6）轉錄是以DNA為模板合成RNA的過程，通過PCR在分子水平上確定目的基因是否轉錄，則需要以RNA為模板逆轉錄出DNA作為PCR反應的模板。
2.（2023·河北·高考真題）單細胞硅藻具有生產生物柴油的潛在價值。研究者將硅藻脂質合成相關的蘋果酸酶（ME）基因構建到超表達載體，轉入硅藻細胞，以期獲得高產生物柴油的硅藻品系。
回答下列問題：
(1)根據DNA和蛋白質在特定濃度乙醇溶液中的 差異獲得硅藻粗提DNA，PCR擴增得到目的基因。
(2)超表達載體的基本組件包括復制原點、目的基因、標記基因、 和 等。本研究中目的基因為 。
(3)PCR擴增時引物通過 原則與模板特異性結合。根據表達載體序列設計了圖1所示的兩條引物，對非轉基因硅藻品系A和轉ME基因硅藻候選品系B進行PCR檢測，擴增產物電泳結果見圖2。其中，樣品1為本實驗的 組，樣品2有特異性擴增產物，結果表明 。

(4)利用單細胞硅藻生產生物柴油的影響因素包括胞內脂質含量和繁殖速率等。圖3為硅藻胞內脂質含量檢測結果。據圖分析，相對于品系A，品系B的胞內脂質含量平均水平明顯 。同時，還需測定 以比較在相同發酵條件下品系A與B的繁殖速率。

(5)胞內脂質合成需要大量ATP。ME催化蘋果酸氧化脫羧反應產生NADH。研究表明，品系B線粒體中ME含量顯著高于品系A。據此分析，ME基因超表達使線粒體中NADH水平升高， ，最終促進胞內脂質合成。
(6)相對于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻進行生物柴油生產的優勢之處為
。（答出兩點即可）
【答案】
(1)溶解度
(2) 啟動子 終止子（答案“啟動子”和“終止子”不分順序） 蘋果酸酶基因（或“ME基因”）
(3) 堿基互補配對 對照 引物間的載體序列整合到硅藻細胞基因組中（或“ME基因序列整合到硅藻細胞基因組中”）
(4) 增加 細胞數量
(5)有氧呼吸生成的ATP增多
(6)節約土地資源、不受季節和氣候限制（或“節約糧食資源”或“節約淡水”或“能夠通過發酵大量生產”）
【分析】
1、PCR的含義：PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫，它是一項根據DNA半保留復制的原理，在生物體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。
2、PCR原理：DNA半保留復制。
3、PCR基本條件：DNA模板、4種脫氧核苷三磷酸、2種引物、耐高溫的DNA聚合酶、緩沖液。
【詳解】
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA和蛋白質。因此，根據DNA和蛋白質在特定濃度乙醇溶液中的溶解度差異可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到的粗提DNA可以作為PCR擴增目的基因的模板。
（2）基因表達載體除目的基因、標記基因外，還必須有啟動子、終止子等。啟動子和終止子均為一段有特殊序列結構的DNA片段。它們分別位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是來源于硅藻的蘋果酸酶（ME）基因。
（3）PCR是一項根據DNA半保留復制原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。對照實驗一般要設置對照組和實驗組。本實驗的對照組中以非轉基因的硅藻細胞基因組DNA作為PCR模板，而在實驗組中以轉ME基因的硅藻細胞基因組DNA作為模板。如此比較兩個實驗擴增結果可以判定引物間的載體序列是否整合到硅藻細胞的基因組中，從而推測ME基因序列是否整合到硅藻細胞基因組中。
（4）硅藻細胞內的脂質含量和繁殖速率是利用單細胞硅藻生產生物柴油的兩個重要影響因素。據圖3分析可知，相對于非轉基因硅藻細胞品系A，轉基因硅藻細胞品系B的胞內脂質含量平均值顯著提高。在測定硅藻細胞內脂質含量的同時，還需測定在相同發酵條件下品系A與B的硅藻細胞數量，從而可篩選獲得高產生物柴油的優良硅藻細胞品系。
（5）細胞內脂質的合成需要大量ATP。蘋果酸酶（ME）可催化蘋果酸生成NADH。研究表明，品系B線粒體中ME含量顯著高于品系A。據此分析可知，ME基因的超表達導致線粒體中的NADH水平升高，NADH進一步通過有氧呼吸產生大量ATP，最終促進細胞內脂質的合成。
（6）相對于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻進行生物柴油生產的優勢為：能夠通過發酵大量生產、不受季節和氣候限制、節約土地資源、節約淡水以及節約糧食資源等。
1．基因工程的3種基本工具
2.熟記基因工程的四個操作步驟
3．PCR技術原理與條件
4．PCR技術的過程
5．治療性克隆與生殖性克隆的關系
類型 項目 治療性克隆 生殖性克隆
區別 目的 利用克隆技術產生特定的細胞、組織和器官，用于醫學研究和治療 利用克隆技術產生獨立生存的新個體，獲得人的復制品
水平 細胞水平 個體水平
聯系 都屬于無性生殖；產生的新細胞、組織、器官或新個體，遺傳信息相同
6.區分試管嬰兒和設計試管嬰兒
(1)設計試管嬰兒比試管嬰兒多出的是過程④(遺傳學診斷)。
(2)試管嬰兒主要解決不孕夫婦的生育問題，設計試管嬰兒用于白血病、貧血癥等疾病的治療。
(3)兩者都是體外受精，并進行體外早期胚胎培養，都要經過胚胎移植，都是有性生殖。
（2024·山東煙臺·一模）哺乳動物體內一定含量的w-3多不飽和脂肪酸(LCPUFA)可以起到預防心血管疾病的作用，但LCPUFA在大多數動物體內不能合成，只能從食物中攝取。科研人員從秀麗隱桿線蟲中獲得LCPUFA合成酶基因fat-1(1229bp),培育轉fat-1基因家兔，其部分流程如圖一所示。
(1)PCR擴增fat-1基因的前提是 ，以用于特異性制備PCR擴增需要的引物。PCR擴增過程中，經過4輪循環后，得到的產物中只含一種引物的DNA分子占比為 。
(2)在構建PEBf質粒時，為確保fat-1基因按正確方向插入，需要雙酶切，還需對fat-1基因的引物進行相應設計。已知fat-1基因轉錄的模板鏈為a鏈，與b鏈結合的引物5'端添加了限制酶識別序列GAATTC,則另一引物5’端需添加的限制酶識別序列為 ,理由是
。
(3)轉染是將外源分子如DNA、RNA等導入真核細胞的技術。為了檢驗圖一家兔成纖維細胞是否轉染成功，科研人員分別提取培養液中各細胞的DNA，利用fat-1基因引物進行PCR擴增后電泳，部分結果如圖二所示。據圖分析，1組和2組分別是 細胞組PCR產物。
(4)檢測轉基因家兔細胞中是否含有LCPUFA合成酶，可采用 技術。如果fat-1基因已正確插入PEB質粒且成功轉染，但在轉基因家兔細胞中沒有檢測到LCPUFA合成酶，從構建基因表達載體的角度分析，可能的原因是 。
【答案】
(1) 獲得一段已知目的基因的序列 1/8
(2) GGATCC 另一引物應和a鏈配對，且轉錄的模板鏈是a鏈，則a鏈引物所在一側應靠近啟動子，所以應選擇BamH I限制酶的序列作為引物5’端序列，即另一引物5’端需添加的限制酶序列為GGATCC
(3)未成功轉染和成功轉染
(4) 抗原-抗體雜交 重組質粒缺少啟動子和終止子，無法正常轉錄
【分析】
1、PCR擴增：目的基因DNA受熱變性后解為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合；然后以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此循環多次。
2、選擇合適的限制酶對目的基因和質粒進行切割的原則：①不能破壞目的基因；②不能破壞所有的抗性基因；③最好選擇兩種限制酶分別切割質粒和目的基因，防止目的基因和質粒反向連接，同時要防止目的基因自身環化和質粒的自身環化。
【詳解】
（1）在進行PCR擴增目的基因時，需要加入引物，引物是根據一段已知目的基因的序列合成的DNA片段。PCR擴增過程中，經過4輪循環后，得到16個DNA分子，其中有2個DNA分子只有含有母鏈，且該DNA分子只含一種引物，故得到的產物中只含一種引物的DNA分子占比為1/8。
（2）在構建PEBf質粒時，為確保fat-1基因按正確方向插入，需要雙酶切，還需對fat-1基因的引物進行相應設計。已知fat-1基因轉錄的模板鏈為a鏈，與b鏈結合的引物5'端添加了限制酶識別序列GAATTC,另一引物應和a鏈配對，且轉錄的模板鏈是a鏈，則a鏈引物所在一側應靠近啟動子，所以應選擇BamH I限制酶的序列作為引物5’端序列，即另一引物5’端需添加的限制酶識別序列序列為GGATCC。
（3）據圖分析，M2組和1組沒有擴增出DNA片段，故細胞內不存在目的基因，即可能是細胞內導入PEB質粒或者未成功轉染，而M2組是PEB質粒轉染細胞PCR產物，故1組是未轉染細胞PCR產物，2組出現一條DNA條帶，即為目的基因條帶，則細胞內導入的是PEBf質粒，1組和2組分別是未成功轉染和成功轉染細胞組PCR產物。
（4）檢測轉基因家兔細胞中是否含有LCPUFA合成酶，可采用抗原-抗體雜交技術。如果fat-1基因已正確插入PEB質粒且成功轉染，但在轉基因家兔細胞中沒有檢測到LCPUFA合成酶，從構建基因表達載體的角度分析，基因正確插入卻無法檢測到相應蛋白質，考慮目的基因未正確表達，從構建基因表達載體的角度分析，可能的原因是重組質粒缺少啟動子和終止子，無法正常轉錄。
典例三：細胞工程與基因工程綜合考查
1.（2023·海南·高考真題）基因遞送是植物遺傳改良的重要技術之一，我國多個實驗室合作開發了一種新型基因遞送系統（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，簡稱CDB法）。圖1與圖2分別是利用常規轉化法和CDB法在某植物中遞送基因的示意圖。

回答下列問題。
(1)圖1中，從外植體轉變成愈傷組織的過程屬于 ；從愈傷組織到幼苗的培養過程需要的激素有生長素和 ，該過程還需要光照，其作用是 。
(2)圖1中的愈傷組織，若不經過共培養環節，直接誘導培養得到的植株可以保持植株A的 。圖1中，含有外源基因的轉化植株A若用于生產種子，其包裝需標注 。
(3)圖1與圖2中，農桿菌侵染植物細胞時，可將外源基因遞送到植物細胞中的原因是 。
(4)已知某酶（PDS）缺失會導致植株白化。某團隊構建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體（含有綠色熒光蛋白標記基因），利用圖2中的CDB法將該重組載體導入植株B，長出毛狀根，成功獲得轉化植株B．據此分析，從毛狀根中獲得陽性毛狀根段的方法是 ，圖2中，鑒定導入幼苗中的基因編輯載體是否成功發揮作用的方法是 ，依據是
。
與常規轉化法相比，采用CDB法進行基因遞送的優點是
（答出2點即可）。
【答案】
(1) 脫分化 細胞分裂素 誘導葉綠素的形成；滿足葉綠體利用光能制造有機物的需要
(2) 遺傳特性 轉基因標識
(3)Ti質粒中的T-DNA能將外源基因遞送到植物細胞中，并與植物細胞的染色體DNA整合到一起
(4) 熒光檢測選擇帶有綠色熒光標記的毛狀根 觀察幼苗是否表現出白化特征 PDS缺失會導致植株白化，白化苗的出現意味著通過基因編輯技術成功實現PDS基因的敲除
(5)操作方法簡單，不需要借助植物組織培養技術進行操作，且培養周期較短。
【分析】植物組織培養過程是：離體的植物器官、組織或細胞脫分化形成愈傷組織，然后再分化生成根、芽，最終形成植物體。植物組織培養依據的原理是植物細胞的全能性。
【詳解】
（1）圖1中，從外植體轉變成愈傷組織的過程屬于脫分化過程，該過程的本質是使細胞失去原來特定的結構和功能；從愈傷組織到幼苗的培養過程需要的激素有生長素和細胞分裂素，這兩種激素的比值能調控愈傷組織的分化方向，該過程還需要光照，因為葉綠素的形成需要光；且葉綠體利用光能制造有機物，供試管苗生長發育。
（2）圖1中的愈傷組織，若不經過共培養環節，直接誘導培養得到的植株可以保持植株A的遺傳特性。圖1中，含有外源基因的轉化植株A若用于生產種子，其包裝需標注轉基因種子，即進行轉基因標識。
（3）圖1與圖2中，農桿菌侵染植物細胞時，利用了農桿菌含有的Ti質粒的作用，Ti質粒中的T-DNA能將外源基因遞送到植物細胞中，并與植物細胞的染色體DNA整合到一起。
（4）已知某酶（PDS）缺失會導致植株白化。某團隊構建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體（含有綠色熒光蛋白標記基因），利用圖2中的CDB法將該重組載體導入植株B，長出毛狀根，成功獲得轉化植株B，該過程中通過熒光檢測選擇帶有綠色熒光標記的毛狀根即為陽性毛狀根段，圖2中，鑒定導入幼苗中的基因編輯載體是否成功發揮作用的方法是觀察幼苗是否表現出白化特征，因為PDS缺失會導致植株白化，而白化苗的出現意味著通過基因編輯技術成功實現PDS基因的敲除。
（5）與常規轉化法相比，采用CDB法進行基因遞送的優點主要表現在操作方法簡單，不需要借助植物組織培養技術進行操作，且培養周期較短。
2.（2022·福建·高考真題）美西螈具有很強的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬細胞在斷肢再生的早期起重要作用。為研究巨噬細胞的作用機制，科研人員制備了抗巨噬細胞表面標志蛋白CD14的單克隆抗體，具體方法如下。回答下列問題：
（一）基因工程抗原的制備
(1)根據美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR擴增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3’—OH與加入的脫氧核苷酸的5’—P形成磷酸二酯鍵，則新合成鏈的延伸方向是 （填“ 5’→3’ ”或“ 3’→5’ ”）。

(2)載體和CD14片段的酶切位點及相應的酶切 抗性基因序列如圖1所示。用Xho I和Sal 1分別酶切CD14和載體后連接，CD14接入載體時會形成正向連接和反向連接的兩種重組DNA．可進一步用這兩種限制酶對CD14的連接方向進行鑒定，理由是 。
培養能表達CD14蛋白的大腸桿菌，分離純化目的蛋白。
（二）抗CD14單克隆抗體的制備流程如圖2所示：

(3)步驟①和步驟⑤分別向小鼠注射 和 。
(4)步驟②所用的SP2/0細胞的生長特點是 。
(5)吸取③中的上清液到④的培養孔中，根據抗原—抗體雜交原理，需加入 進行專一抗體檢測，檢測過程發現有些雜交瘤細胞不能分泌抗CD14抗體，原因是
。
(6)步驟⑥從 中提取到大量的抗CD14抗體，用于檢測巨噬細胞。
【答案】
(1)5'→3'
(2)正向連接的重組DNA有這兩種酶切位點（限制酶的識別序列）；而反向連接的重組DNA會形成新的序列，沒有這兩種酶的酶切位點（沒有限制酶的識別序列）
(3) CD14蛋白/CD14抗原 分泌抗CD14抗體的雜交瘤細胞
(4)能在體外無限增殖
(5) CD14蛋白 參與形成雜交瘤細胞的B淋巴細胞種類多，有的不能分泌抗CD14抗體
(6)小鼠腹水
【分析】
1、PCR原理：在解旋酶作用下，打開DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4種游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端自3'端延伸的。實際上就是在體外模擬細胞內DNA的復制過程。DNA的復制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈。
2、單克隆抗體制備流程：先給小鼠注射特定抗原使之發生免疫反應，之后從小鼠脾臟中獲取已經免疫的B淋巴細胞；誘導B細胞和骨髓瘤細胞融合，利用選擇培養基篩選出雜交瘤細胞；進行抗體檢測，篩選出能產生特定抗體的雜交瘤細胞；進行克隆化培養，即用培養基培養和注入小鼠腹腔中培養；最后從培養液或小鼠腹水中獲取單克隆抗體。
【詳解】
（1）PCR擴增時，DNA聚合酶催化引物的3'-OH與加入的脫氧核苷酸的5'-P形成磷酸二酯鍵，因此新鏈合成的方向是從5'→3'。
（2）可進一步用限制酶XhoⅠ和SalⅠ對CD14的連接方向進行鑒定，是因為正向連接的重組DNA有這兩種酶切位點（限制酶的識別序列）；而反向連接的重組DNA會形成新的序列，沒有這兩種酶的酶切位點（沒有限制酶的識別序列）。
（3）步驟①是注射特定抗原，針對本實驗目的可知，要獲得抗CD14單克隆抗體，故應該注射CD14蛋白/CD14抗原；步驟⑤是將分泌抗CD14抗體的雜交瘤細胞注入小鼠體內培養，以獲得大量單克隆抗體。
（4）步驟②所用的SP2/0細胞是骨髓瘤細胞，特點是能在體外無限增殖。
（5）根據抗原—抗體雜交原理，應該用CD14蛋白檢測其中是否含抗CD14蛋白的抗體。因為形成雜交瘤細胞的B淋巴細胞種類很多，因此有些雜交瘤細胞不能分泌抗CD14抗體。
（6）從制備單克隆抗體的流程可知，將雜交瘤細胞注射到小鼠腹腔后，最終要從小鼠的腹水中提取抗CD14抗體。
3.（2022·全國·高考真題）某牧場引進一只產肉性能優異的良種公羊，為了在短時間內獲得具有該公羊優良性狀的大量后代，該牧場利用胚胎工程技術進行了相關操作。回答下列問題，
(1)為了實現體外受精需要采集良種公羊的精液，精液保存的方法是 。在體外受精前要對精子進行獲能處理，其原因是 ；精子體外獲能可采用化學誘導法，誘導精子獲能的藥物是 （答出1點即可）。利用該公羊的精子進行體外受精需要發育到一定時期的卵母細胞，因為卵母細胞達到 時才具備與精子受精的能力。
(2)體外受精獲得的受精卵發育成囊胚需要在特定的培養液中進行，該培養液的成分除無機鹽、激素、血清外，還含的營養成分有 （答出3點即可）等。將培養好的良種囊胚保存備用。
(3)請以保存的囊胚和相應數量的非繁殖期受體母羊為材料進行操作，以獲得具有該公羊優良性狀的后代。主要的操作步驟是 。
【答案】
(1) 冷凍保存 剛排出的精子必須在雌性生殖道內發生相應生理變化后才能獲得受精能力 肝素或鈣離子載體A23187 MⅡ中期
(2)維生素、氨基酸、核苷酸
(3)對受體母羊進行發情處理，合適的時間，將保存的囊胚移植入受體母羊的子宮
【分析】試管動物技術是指通過人工操作使卵子和精子在體外條件下成熟和受精，并通過培養發育為早期胚胎后，再經移植后產生后代的技術。
【詳解】
（1）精液可以冷凍保存，使用前再將精液解凍離心分離。剛排出的精子必須在雌性生殖道內發生相應生理變化后才能獲得受精能力，故在體外受精前要對精子進行獲能處理。通常采用的體外獲能方法有培養法和化學誘導法，化學誘導法是將精子放在一定濃度的肝素或鈣離子載體A23187溶液中，用化學藥物誘導精子獲能。卵母細胞需要培養到減數第二次分裂中期（MⅡ中期）才能具備與精子受精的能力。
（2）進行早期胚胎培養的培養液中，除了無機鹽、激素、血清外，還含有維生素、氨基酸、核苷酸等。
（3）要利用保存的囊胚和相應數量的非繁殖期受體母羊為材料，獲得具有該公羊優良性狀的后代，主要是利用胚胎移植技術，即對受體母羊進行發情處理，將保存的囊胚進行胚胎移植，對受體母羊進行是否妊娠的檢查，一段時間后受體母羊產下具有該公羊優良性狀的后代。
1．植物組織培養的過程——原理：植物細胞的全能性
(1)植物組織培養中添加蔗糖的目的是提供營養和調節滲透壓。
(2)脫分化階段不需要光，再分化階段需要光。
(3)生長素與細胞分裂素的比值高時，促進根的分化、抑制芽的形成；比值低時，促進芽的分化、抑制根的形成。
(4)體內細胞未表現全能性的原因：基因的表達具有選擇性。
2．植物體細胞雜交技術——原理：植物細胞的全能性、細胞膜的流動性
3．動物細胞培養(以貼壁細胞為例)——原理：細胞增殖
(1)動物細胞培養過程
①動物細胞培養中兩次使用胰蛋白酶的作用不同：第一次：處理剪碎的組織，使其分散成單個細胞；第二次：使貼壁生長的細胞從瓶壁上脫落下來分散成單個細胞。
②保障無菌、無毒的措施：對培養液和培養用具進行滅菌處理及在無菌條件下進行操作，定期更換培養液。
③區分原代培養和傳代培養的關鍵：是否分瓶培養。
4.單克隆抗體的制備——原理：細胞膜的流動性、細胞的增殖
(1)3種細胞特點不同：①B淋巴細胞：能產生抗體，不能大量增殖。②骨髓瘤細胞：能迅速大量增殖，不能產生抗體。③雜交瘤細胞：既能產生抗體，又能迅速大量增殖。
(2)兩次篩選目的不同：①第1次：獲得雜交瘤細胞。②第2次：獲得能分泌所需特異性抗體的雜交瘤細胞。
5．動物體細胞核移植技術——原理：動物細胞核的全能性
(1)核移植獲得的克隆動物與提供細胞核的親本性狀可能不同的三個原因：①克隆動物遺傳物質來自兩個親本。②發育過程中可能發生基因突變或染色體變異。③外界環境可能引起不可遺傳的變異。
(2)克隆動物的產生是無性繁殖，而試管動物則是在體外受精形成受精卵，由受精卵發育成的個體，因此屬于有性繁殖。
6．準確記憶哺乳動物的早期胚胎發育過程
(1)受精過程中的兩個標志：受精的標志是觀察到兩個極體或雌雄原核；受精完成的標志是雌雄原核融合完成。
(2)桑葚胚是由受精卵分裂形成的，沒有分化；而囊胚期雖然已進行細胞分化，但囊胚的內細胞團仍具有全能性。
7．胚胎移植的操作流程
(1)胚胎移植過程中的兩次檢查：第一次對收集的胚胎進行檢查；第二次對受體母畜是否妊娠進行檢查。
(2)胚胎移植產生的后代是有性生殖還是無性生殖，取決于胚胎發育的起點。若后代是由受精卵形成的，則為有性生殖；若后代是由核移植技術形成的重組細胞或胚胎分割形成的胚胎發育而成，則為無性生殖。
(3)用于移植的胚胎來源：體內正常受精的胚胎、核移植的胚胎和體外受精獲得的胚胎、轉基因獲得的胚胎、胚胎分割獲得的胚胎等。
(4)胚胎存活的基礎：受體不會對來自供體的胚胎發生免疫排斥反應。
（2024·湖南衡陽·模擬預測）雙特異性單克隆抗體是指可同時與癌細胞和藥物結合的特異性抗體。下圖是科研人員通過雜交瘤細胞技術（免疫的B細胞和骨髓瘤細胞雜交技術）生產能同時識別癌胚抗原和長春堿（一種抗癌藥物）的雙特異性單克隆抗體的部分過程。回答下列問題：

(1)過程①處理后 （填“需要”或“不需要”）對小鼠進行抗體檢測，理由是 。
(2)過程②常用滅活的病毒來誘導融合，其作用機理是 。
(3)過程③得到的雜交瘤細胞的特征是 。
(4)過程④一般在多孔細胞培養板上進行：先將細胞懸浮液稀釋到7～10個細胞/mL，再在每個培養孔中滴入0．1mL細胞稀釋液，其目的是 。
(5)請簡述圖中過程⑤的操作目的 。
【答案】
(1) 需要 確保小鼠已產生分泌識別癌胚抗原（相應）抗體的漿細胞（B淋巴細胞）
(2)使細胞互相凝集，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合
(3)既能迅速大量繁殖，又能產生抗體
(4)使每個培養孔盡量只接種一個雜交瘤細胞
(5)獲取能產所需雙特異性單克隆抗體的單克隆雜交-雜交瘤細胞
【分析】單克隆抗體制備流程：
對小鼠注射特定的抗原使小鼠產生免疫反應；
從小鼠脾臟中獲取已經免疫的B淋巴細胞；
將小鼠骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合，再用特定的選擇培養基進行篩選；
在該培養基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜種細胞才能生長；
對上述雜交瘤細胞還需進行克隆化培養和抗體檢測，經多次篩選就可獲得足量的能分泌所需抗體的細胞；
（6）最后，將雜交瘤細胞在體外條件下做大規模培養，或注射到小鼠腹腔內增殖。這樣從細胞培養液或小鼠腹水中，就可以提取出大量的單克隆抗體。
【詳解】
（1）分析題圖可知，過程①是給小鼠注射癌胚抗原，其目的是使小鼠產生能分泌識別癌胚抗原抗體的漿細胞，處理后需要對小鼠進行抗體檢測，因為抗體和抗原的結合具有特異性，故可以通過抗體檢測確保小鼠已產生分泌識別癌胚抗原（相應）抗體的漿細胞（B淋巴細胞）。
（2）分析題圖可知，過程①是誘導小鼠骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合，常用滅活的病毒來誘導融合，作用機理為使細胞互相凝集，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合。
（3）分析題圖可知，過程③使用的HAT培養基為選擇性培養基，通過篩選，只有雜交瘤細胞可以在此培養基生長，其他細胞如B淋巴細胞和骨髓瘤細胞均不能在HAT培養基上生長。故過程③得到的雜交瘤細胞的特征是既能迅速大量繁殖，又能產生抗體
（4）過程④一般在多孔細胞培養板上對過程③獲得的雜交瘤細胞進行篩選和培養，可以獲得產生單克隆抗體的細胞，在此過程中需要保證使每個培養孔盡量只接種一個雜交瘤細胞。
（5）過程⑤的操作目的是：獲取能同時識別癌胚抗原和長春堿的雙特異性單克隆抗體的單克隆雜交-雜交瘤細胞。
1．（2023·北京·高考真題）自然界中不同微生物之間存在著復雜的相互作用。有些細菌具有溶菌特性，能夠破壞其他細菌的結構使細胞內容物釋出。科學家試圖從某湖泊水樣中分離出有溶菌特性的細菌。
(1)用于分離細菌的固體培養基包含水、葡萄糖、蛋白胨和瓊脂等成分，其中蛋白胨主要為細菌提供
和維生素等。
(2)A菌通常被用做溶菌對象。研究者將含有一定濃度A菌的少量培養基傾倒在固體培養平板上，凝固形成薄層。培養一段時間后，薄層變渾濁（如圖），表明 。
(3)為分離出具有溶菌作用的細菌，需要合適的菌落密度，因此應將含菌量較高的湖泊水樣 后，依次分別涂布于不同的渾濁薄層上。培養一段時間后，能溶解A菌的菌落周圍會出現 。采用這種方法，研究者分離、培養并鑒定出P菌。
(4)為探究P菌溶解破壞A菌的方式，請提出一個假設，該假設能用以下材料和設備加以驗證（主要實驗材料和設備：P菌、A菌、培養基、圓形濾紙小片、離心機和細菌培養箱）
。
【答案】
(1)氮源、碳源
(2)A菌能在培養平板中生長繁殖
(3) 稀釋 溶菌圈
(4)假設P菌通過分泌某種化學物質使A菌溶解破裂
【分析】微生物的營養成分主要有碳源、氮源、水和無機鹽等。微生物的培養基按其特殊用途可分為選擇性培養基和鑒別培養基，培養基按其物理狀態可分為固體培養基、液體培養基和半固體培養基三類。
【詳解】
（1）蛋白胨主要為細菌提供氮源、碳源和維生素等。
（2）將含有一定濃度A菌的少量培養基傾倒在固體培養平板上，凝固形成薄層。培養一段時間后，薄層變渾濁，表明A菌能在培養平板中生長繁殖。
（3）將含菌量較高的湖泊水樣稀釋后，依次分別涂布于不同的渾濁薄層上。培養一段時間后，能溶解A菌的菌落周圍會出現溶菌圈。　
（4）根據實驗實驗材料和設備，圓形濾紙小片可用于吸收某種物質，離心機可用于分離菌體和細菌分泌物，為探究P菌溶解破壞A菌的方式，可假設P菌通過分泌某種化學物質使A菌溶解破裂。
2．（2023·重慶·高考真題）妊娠與子宮內膜基質細胞的功能密切相關。某研究小組通過如圖所示的實驗流程獲得了子宮內膜基質細胞，以期用于妊娠相關疾病的研究。

(1)手術獲得的皮膚組織需在低溫下運至實驗室，低溫對細胞中各種蛋白質的作用為 。
(2)過程①中，誘導形成PS細胞時，需提高成纖維細胞中4個基因的表達量，可采用 技術將這些基因導入該細胞。這4個基因的主要作用為：M基因促進增殖，S基因和C基因控制干細胞特性，K基因抑制凋亡和衰老。若成纖維細胞形成腫瘤細胞，最有可能的原因是 基因過量表達。
(3)培養iPS細胞時，應對所處環境定期消毒以降低細胞被污染風險。可用紫外線進行消毒的是_ ____（多選）。
A．培養基 B．培養瓶 C．細胞培養室 D．CO2培養箱
(4)過程②中，iPS細胞經歷的生命歷程為 。PCR技術可用于檢測子宮內膜基質細胞關鍵基因的mRNA水平，mRNA需經過 才能作為PCR擴增的模板。
【答案】
(1)抑制酶的活性（降低蛋白質或酶的活性），防止蛋白質變性
(2) 轉基因 M
(3)CD
(4) 增殖分化 逆轉錄/反轉錄
【分析】
1、構建基因表達載體的目的是使目的基因在受體細胞中穩定存在并且可以遺傳給下一代并表達和發揮作用。基因表達載體的組成：復制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因。
2、動物細胞培養的條件：
（1）無菌、無毒的環境：①消毒、滅菌；②添加一定量的抗生素；③定期更換培養液，以清除代謝廢物。
（2）營養物質：糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等，還需加入血清、血漿等天然物質。
（3）溫度和pH：36.5℃±0.5℃；適宜的pH：7.2～7.4。
（4）氣體環境：95%空氣（細胞代謝必需的）和5%的CO2（維持培養液的pH）。
【詳解】
（1）低溫可以抑制酶的活性，防止蛋白質變性，使細胞中的蛋白質維持正常的生理功能。
（2）將外源基因導入細胞內，通常需要轉基因技術。即過程①中，誘導形成PS細胞時，需提高成纖維細胞中4個基因的表達量，可采用轉基因技術將這些基因導入該細胞。M基因促進增殖，S基因和C基因控制干細胞特性，K基因抑制凋亡和衰老。腫瘤細胞（癌細胞）具有無限增殖的能力，因此若成纖維細胞形成腫瘤細胞，最有可能的原因是M基因過量表達造成的。
（3）培養iPS細胞時，應對所處環境定期消毒以降低細胞被污染風險。可用紫外線對細胞培養室和CO2培養箱進行消毒處理，而對培養基和培養瓶需要進行滅菌處理，因此AB錯誤，CD正確。
故選CD。
（4）由圖可知，過程②中，iPS細胞經過細胞的分裂分化，即增殖分化，形成了體腔上皮。PCR擴增的模板為DNA，因此若想利用PCR技術檢測子宮內膜基質細胞關鍵基因的mRNA水平，mRNA需經過逆轉錄過程形成DNA，才可作為PCR的模板。
3．（2023·天津·高考真題）基因工程：制備新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉發酵，則應導入多步分解淀粉所需的多種酶，推測這些酶生效的場所應該是 （填“細胞內”和“細胞外”）
(2)同源切割是一種代替限制酶、DNA連接酶將目的基因導入基因表達載體的方法。當目的基因兩側的小段序列與基因表達載體上某序列相同時，就可以發生同源切割，將目的基因直接插入。研究人員，運用同源切割的方式，在目的基因兩端加上一組同源序列A．B，已知酵母菌體內DNA有許多A-B序列位點可以同源切割插入。構建完成的目的基因結構如圖，則應選擇圖中的引物 對目的基因進行PCR。

(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作標記基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸轉化為對酵母菌有毒物質。
（i）導入目的基因的酵母菌應在 的培養基上篩選培養。由于需要導入多種酶基因，需要多次篩選，因此在導入一種目的基因后，要切除UGA基因，再重新導入。研究人員在UGA基因序列兩端加上酵母菌DNA中不存在的同源C．C’序列，以便對UGA基因進行切除。C．C’的序列方向將影響切割時同源序列的配對方式，進而決定DNA片段在切割后是否可以順利重連，如圖，則應選擇方式 進行連接。

（ii）切去UGA基因的酵母菌應在 的培養基上篩選培養。
(4)綜上，目的基因、標記基因和同源序列在導入酵母菌的基因表達載體上的排列方式應該如圖 。


【答案】
(1)細胞外
(2)P1和P6
(3) 缺乏尿嘧啶 方式二 含有5-氟乳清酸
(4)圖3
【分析】 基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，通過體外DNA重組和轉基因技術，賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品．基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，又叫做DNA重組技術。
【詳解】
（1）由于酵母菌不能吸收淀粉，所以導入分解淀粉的酶發揮作用的場所在細胞外。
（2）根據題干信息“當目的基因兩側的小段序列與基因表達載體上某序列相同時，就可以發生同源切割，將目的基因直接插入”，要保證目的基因兩側的小段序列與基因表達載體上某序列相同，需要選擇P1和P6這對引物進行PCR。
（3）（i）選擇了尿嘧啶合成基因（UGA）常用作標記基因，則應該將酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培養基上培養，如果導入成功，則形成菌落；如果沒有導入，則缺乏尿嘧啶，不能生存；
方式一，C和C'方向相反，如果切割，則末端在一條鏈上，不能連接，所以選擇方式二，連接方向相同，切割后形成末端，便于連接。
（ii）由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸轉化為對酵母菌有毒物質，所以應該在含有5-氟乳清酸的培養基上，如果切割成功，則不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，則會產生有毒物質，不能形成菌落。
（4）根據前面分析，C和C'的中間插入UGA，A和B之間插入的目的基因，所以圖3正確。
4．（2023·北京·高考真題）變胖過程中，胰島B細胞會增加。增加的B細胞可能源于自身分裂（途徑I），也可能來自胰島中干細胞的增殖、分化（途徑Ⅱ）。科學家采用胸腺嘧啶類似物標記的方法，研究了L基因缺失導致肥胖的模型小鼠IK中新增B細胞的來源。
(1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶類似物，能很快進入細胞并摻入正在復制的DNA中，摻入DNA的EdU和BrdU均能與 互補配對，并可以被分別檢測。未摻入的EdU和BrdU短時間內即被降解。
(2)將處于細胞周期不同階段的細胞混合培養于多孔培養板中，各孔同時加入EdU，隨后每隔一定時間向一組培養孔加入BrdU，再培養十幾分鐘后收集該組孔內全部細胞，檢測雙標記細胞占EdU標記細胞的百分比（如圖）。圖中反映DNA復制所需時長的是從 點到 點。

(3)為研究變胖過程中B細胞的增殖，需使用一批同時變胖的小鼠。為此，本實驗使用誘導型基因敲除小鼠，即飼喂誘導物后小鼠的L基因才會被敲除，形成小鼠IK。科學家利用以下實驗材料制備小鼠IK：
①純合小鼠Lx：小鼠L基因兩側已插入特異DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌體，其編碼的酶進入細胞核后作用于x，導致兩個x間的DNA片段丟失；③Er基因：編碼的Er蛋白位于細胞質，與Er蛋白相連的物質的定位由Er蛋白決定；④口服藥T：小分子化合物，可誘導Er蛋白進入細胞核。請完善制備小鼠IK的技術路線： →連接到表達載體→轉入小鼠Lx→篩選目標小鼠→ →獲得小鼠IK。
各種細胞DNA復制所需時間基本相同，但途徑I的細胞周期時長（t1）是途徑Ⅱ細胞周期時長（t2）的三倍以上。據此，科學家先用EdU飼喂小鼠IK，t2時間后換用BrdU飼喂，再過t2時間后檢測B細胞被標記的情況。研究表明，變胖過程中增加的B細胞大多數來源于自身分裂，與之相應的檢測結果應是
。
【答案】
(1)A/腺嘌呤
(2) Q R
(3) 將Ce酶基因和Er基因連接 飼喂口服藥T
(4)大多數B細胞沒有被BrdU標記
【分析】DNA分子的復制時間：有絲分裂和減數分裂間期；條件：模板（DNA的雙鏈）、能量（ATP水解提供）、酶（解旋酶和DNA聚合酶等）、原料（游離的脫氧核苷酸）；過程：邊解旋邊復制；結果：一條DNA復制出兩條DNA；特點：半保留復制。
【詳解】
（1）分析題意可知，EdU和BrdU都是胸腺嘧啶（T）類似物，根據堿基互補配對的原則可知，摻入DNA的EdU和BrdU均能與A（腺嘌呤）互補配對，并可以被分別檢測。
（2）DNA分子復制時會發生模板鏈與子鏈的堿基互補配對，據題可知，將處于細胞周期不同階段的細胞混合培養于多孔培養板中，各孔同時加入EdU，則EdU會與A結合，導致子鏈出現放射性，隨后每隔一定時間向一組培養孔加入BrdU，則BrdU也會與A結合，使放射性增強，最終實現雙標記，隨復制完成達到峰值，故結合題圖可知，圖中反映DNA復制所需時長的是從Q點到R點。　
（3）分析題意，要制備IK小鼠，需要用誘導型基因敲除小鼠，而飼喂誘導物后小鼠的L基因才會被敲除，結合所給實驗材料及藥物可知，制備小鼠IK的技術路線為：將Ce酶基因和Er基因連接（Ce酶可作用于x，導致兩個x間的DNA片段丟失）→連接到表達載體→轉入小鼠Lx→篩選目標小鼠→飼喂口服藥T（誘導Er蛋白進入細胞核）→獲得小鼠IK。
（4）據題可知，變胖過程中增加的B細胞可能源于自身分裂（途徑I），也可能來自胰島中干細胞的增殖、分化（途徑Ⅱ），由于但途徑I的細胞周期時長（t1）是途徑Ⅱ細胞周期時長（t2）的三倍以上，若先用EdU飼喂小鼠IK，各種細胞DNA復制所需時間基本相同，t2時間已經經過一個細胞周期，所有的細胞應都含有EdU標記，實驗假設是變胖過程中增加的B細胞大多數來源于自身分裂，即來源于途徑I，該過程已經復制的B細胞直接分裂，不會再有DNA復制過程，故t2時間后用BrdU飼喂則不起作用，即大多數B細胞沒有被BrdU標記。
5．（2023·山東·高考真題）科研人員構建了可表達J-V5融合蛋白的重組質粒并進行了檢測，該質粒的部分結構如圖甲所示，其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。

(1)與圖甲中啟動子結合的酶是 。除圖甲中標出的結構外，作為載體，質粒還需具備的結構有 （答出2個結構即可）。
(2)構建重組質粒后，為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物 。已知J基因轉錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的 （填“a鏈”或“b鏈”）相應部分的序列相同。
(3)重組質粒在受體細胞內正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應蛋白是否表達以及表達水平，結果如圖乙所示。其中，出現條帶1證明細胞內表達了 ，條帶2所檢出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重組質粒上的J基因表達的。
【答案】
(1) RNA聚合酶 限制酶切割位點、標記基因、復制原點等
(2) F2和R1或F1與R2 a鏈
(3) J-V5融合蛋白 不是
【分析】基因工程的關鍵步驟是構建基因表達載體，基因表達載體主要由啟動子、目的基因、標記基因和終止子組成，其中標記基因用于篩選重組DNA分子，可以是四環素、氨芐青霉素等抗性基因，也可以是熒光蛋白基因或產物能顯色的基因。
【詳解】
（1）基因表達載體的構建啟動子是為了啟動下游基因的“表達”，表達首先需要轉錄，因此RNA聚合酶識別和結合的部位才是轉錄的起始。作為運載體必須具備的條件：①要具有限制酶的切割位點；②要有標記基因（如抗性基因），以便于重組后重組子的篩選；③能在宿主細胞中穩定存在并復制；④是安全的，對受體細胞無害，而且要易從供體細胞分離出來，圖中甲有啟動子和終止子等，因此質粒還需具備的結構有限制酶的切割位點、標記基因、復制原點等。
（2）據圖甲可知，引物F2與R1或F1與R2結合部位包含J基因的堿基序列，因此推測為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，進行PCR檢測時，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物F2和R1或F1與R2。b是模板鏈，而根據圖上啟動子和終止子的位置可知轉錄方向是圖上從左向右，對應的模板鏈方向應該是3’-5'，非模板鏈（也就是a鏈）是5'-3'；考慮到DNA復制的方向是子鏈的5’-3'，引物基礎上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物結合的單鏈其方向是3'-5'；圖中F1是前引物，在左側，所以其配對的單鏈是3’-5'的b鏈，故其序列應該與a鏈相應部分的序列相同。
（3）據圖乙可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測，均出現條帶1，說明條帶1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗體檢測出現條帶2，抗V5抗體檢測不出現條帶2，說明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質粒上的融合的J基因表達的。
6．（2023·浙江·高考真題）賴氨酸是人體不能合成的必需氨基酸，而人類主要食物中的賴氨酸含量很低，利用生物技術可提高食物中賴氨酸含量。回答下列問題：
(1)植物細胞合成的賴氨酸達到一定濃度時，能抑制合成過程中兩種關鍵酶的活性，導致賴氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調節方式屬于 。根據這種調節方式，在培養基中添加 ，用于篩選經人工誘變的植物懸浮細胞，可得到抗賴氨酸類似物的細胞突變體，通過培養獲得再生植株。
(2)隨著轉基因技術與動物細胞工程結合和發展，2011年我國首次利用轉基因和體細胞核移植技術成功培育了高產賴氨酸轉基因克隆奶牛。其基本流程為：
①構建乳腺專一表達載體。隨著測序技術的發展，為獲取富含賴氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通過檢索 獲取其編碼序列，用化學合成法制備得到。再將獲得的目的基因與含有乳腺特異性啟動子的相應載體連接，構建出乳腺專一表達載體。
②表達載體轉入牛胚胎成纖維細胞（BEF）。將表達載體包裹到磷脂等構成的脂質體內，與BEF膜發生
，表達載體最終進入細胞核，發生轉化。
③核移植。將轉基因的BEF作為核供體細胞，從牛卵巢獲取卵母細胞，經體外培養及去核后作為 。將兩種細胞進行電融合，電融合的作用除了促進細胞融合，同時起到了 重組細胞發育的作用。
④重組細胞的體外培養及胚胎移植。重組細胞體外培養至 ，植入代孕母牛子宮角，直至小牛出生。
⑤檢測。DNA水平檢測：利用PCR技術，以非轉基因牛耳組織細胞作為陰性對照，以 為陽性對照，檢測到轉基因牛耳組織細胞中存在目的基因。RNA水平檢測：從非轉基因牛乳汁中的脫落細胞、轉基因牛乳汁中的脫落細胞和轉基因牛耳組織細胞，提取總RNA，對總RNA進行 處理，以去除DNA污染，再經逆轉錄形成cDNA，并以此為 ，利用特定引物擴增目的基因片段。結果顯示目的基因在轉基因牛乳汁中的脫落細胞內表達，而不在牛耳組織細胞內表達，原因是什么？ 。
【答案】
(1) 負反饋調節 過量賴氨酸類似物
(2) 基因數據庫 融合 核受體細胞 激活 早期囊胚 轉基因BEF
DNA酶
PCR的模板 構建的表達載體只含有乳腺特異性啟動子，只能在乳腺細胞中啟動轉錄，而在牛耳細胞中不能表達。
【分析】負反饋調節是指在一個系統中，系統工作的效果，反過來又作為信息調節該系統的工作，并且使系統工作的效果減弱或受到限制，有助于系統保持穩定。基因工程技術的基本步驟：(1)目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成；(2)基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等；(3)將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣.將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法；(4)目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因-DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA-分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗原抗體雜交技術.個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。
【詳解】
（1）負反饋調節是指在一個系統中，系統工作的效果，反過來又作為信息調節該系統的工作，并且使系統工作的效果減弱或受到限制，有助于系統保持穩定。植物細胞合成的賴氨酸達到一定濃度時，能抑制合成過程中兩種關鍵酶的活性，導致賴氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調節方式屬于負反饋調節。如果想得到抗賴氨酸類似物的細胞突變體可在培養基中添加過量賴氨酸類似物。
（2）①從基因數據庫獲取獲取目的基因編碼序列，用化學合成法制備可得到目的基因。
②表達載體包裹到磷脂等構成的脂質體內，根據細胞膜成分，其與BEF膜發生融合。
③去核的卵母細胞作為受體細胞，其處于減數第二次分裂中期，因為卵母細胞中含有促使細胞核表達全能性的物質和營養條件。電融合的作用除了促進細胞融合，同時起到了激活重組細胞發育的作用。
④胚胎發育到適宜階段可取出向受體移植。牛、羊一般要培養到桑椹胚或囊胚階段；植入代孕母牛子宮角，直至小牛出生。
⑤陽性對照：按照當前實驗方案一定能得到正面預期結果的對照實驗。陽性對照是已知的對測量結果有影響的因素，目的是確定實驗程序無誤。陰性對照和陽性對照相反，按照當前的實驗方案一定不能得到正面預期結果的對照實驗。排除未知變量對實驗產生的不利影響。本實驗以非轉基因牛耳組織細胞作為陰性對照，為了檢測到轉基因牛耳組織細胞中存在目的基因。應該以含有目的基因的牛耳組織細胞為陽性對照。為了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。經逆轉錄形成cDNA，并以此為PCR的模板進行擴增。目的基因在轉基因牛乳汁中的脫落細胞內表達，而不在牛耳組織細胞內表達，原因是構建的表達載體只含有乳腺特異性啟動子，只能在乳腺細胞中啟動轉錄，而在牛耳細胞中不能表達。
7．（2023·全國·高考真題）接種疫苗是預防傳染病的一項重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的傳播，降低乙型肝炎發病率。乙肝病毒是一種DNA病毒。重組乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技術獲得的乙肝病毒表面抗原（一種病毒蛋白）。回答下列問題。
(1)接種上述重組乙肝疫苗不會在人體中產生乙肝病毒，原因是 。
(2)制備重組乙肝疫苗時，需要利用重組表達載體將乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）導入酵母細胞中表達。重組表達載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能識別載體中的啟動子并驅動目的基因轉錄的酶是 。
(3)目的基因導入酵母細胞后，若要檢測目的基因是否插入染色體中，需要從酵母細胞中提取 進行DNA分子雜交，DNA分子雜交時應使用的探針是 。
(4)若要通過實驗檢測目的基因在酵母細胞中是否表達出目的蛋白，請簡要寫出實驗思路。
。
【答案】
(1)重組乙肝疫苗成分為蛋白質，無法獨立在宿主體內增殖
(2) 篩選 RNA聚合酶
(3) 核染色體DNA 被標記的目的基因的單鏈DNA片段
(4)通過使用相應抗體，利用抗原-抗體雜交技術，檢測mRNA是否翻譯形成蛋白質
【分析】基因工程的操作步驟：（1）目的基因的獲取；方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成；（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟。基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等；（3）將目的基因導入受體細胞；根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣，將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法；（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因-DNA分子雜交技術②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA-分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質：抗原-抗體雜交技術；個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。
【詳解】
（1）重組乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一種病毒蛋白。蛋白質注入人體后，無法完成病毒遺傳物質的復制與蛋白質的合成，無法獨立增殖。
（2）抗生素抗性基因作為標記基因，用于轉化細胞的篩選。
RNA聚合酶結合目的基因啟動子并驅動轉錄。
（3）檢測的對象是目的基因是否插入染色體中，故提取酵母細胞染色體進行目的基因鑒定。
基因探針是一段帶有檢測標記，且順序已知的，與目的基因互補的核酸序列。
（4）要檢測出目的基因是否表達，除了需要檢測目的基因是否插入染色體外，還需要檢查目的基因是否轉錄與表達。檢測是否轉錄，用核酸分子雜交技術，檢測是否翻譯用抗原-抗體雜交技術。
8．（2023·湖南·高考真題）某些植物根際促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列問題：
(1)若從植物根際土壤中篩選分解淀粉的固氮細菌，培養基的主要營養物質包括水和 。
(2)現從植物根際土壤中篩選出一株解淀粉芽孢桿菌H，其產生的抗菌肽抑菌效果見表。據表推測該抗菌肽對 的抑制效果較好，若要確定其有抑菌效果的最低濃度，需在 μg·mL-1濃度區間進一步實驗。
測試菌 抗菌肽濃度/（ g mL-1）
55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86
金黃色葡萄球菌 - - - - - + +
枯草芽孢桿菌 - - - - - + +
禾谷鐮孢菌 - + + + + + +
假絲酵母 - + + + + + +
注：“+”表示長菌，“-”表示未長菌。
(3)研究人員利用解淀粉芽孢桿菌H的淀粉酶編碼基因M構建高效表達質粒載體，轉入大腸桿菌成功構建基因工程菌A。在利用A菌株發酵生產淀粉酶M過程中，傳代多次后，生產條件未變，但某子代菌株不再產生淀粉酶M。分析可能的原因是 （答出兩點即可）。
(4)研究人員通過肺上皮干細胞誘導生成肺類器官，可自組裝或與成熟細胞組裝成肺類裝配體，如圖所示。肺類裝配體培養需要滿足適宜的營養、溫度、滲透壓、pH以及 （答出兩點）等基本條件。肺類裝配體形成過程中是否運用了動物細胞融合技術 （填“是”或“否”）。

(5)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是一種耐藥菌，嚴重危害人類健康。科研人員擬用MRSA感染肺類裝配體建立感染模型，來探究解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽是否對MRSA引起的肺炎有治療潛力。以下實驗材料中必備的是 。
①金黃色葡萄球菌感染的肺類裝配體 ②MRSA感染的肺類裝配體 ③解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽 ④生理鹽水 ⑤青霉素（抗金黃色葡萄球菌的藥物） ⑥萬古霉素（抗MRSA的藥物）
【答案】
(1)無機鹽、淀粉
(2) 金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌 1.73~3.45
(3)淀粉酶編碼基因M發生突變；重組質粒在大腸桿菌分裂過程中丟失
(4) 無菌、無毒環境，含95%空氣和5%CO2的氣體環境 否
(5)②③④⑥
【分析】動物培養的條件：
1、營養：在使用合成培養基時，通常需要加入血清等一些天然成分。
2、無菌、無毒的環境：對培養液和所有培養用具進行滅菌處理以及在無菌環境下進行操作:定期更換培養液，以便清除代謝產物，防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害。
3、適宜溫度、pH和滲透壓：哺乳動物細胞培養的溫度多為(36.5±0.5)℃；pH多為7.2~7.4；動物細胞培養還需要考慮滲透壓。
4、氣體環境：O2：細胞代謝所必需的；CO2：維持培養液pH。
【詳解】
（1）由題意可知，根際促生菌具有固氮作用，可利用空氣中的氮氣作為氮源，因此用于篩選根際促生菌的培養基的主要營養物質包括水、無機鹽和淀粉。
（2）由題表可知，在抗菌肽濃度為3.45-55.20 μg·mL-1范圍內，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均不能生長，表明該抗菌肽對它們的抑菌效果較好；因為抗菌肽的濃度為1.73μg·mL-1時，它們均能生長，所以要確定抗菌肽抑菌效果的最低濃度，應在1.73~3.45 μg·mL-1的濃度區間進一步實驗。
（3）在利用A菌株發酵生產淀粉酶M過程中，傳代多次后，生產條件未變，但某子代菌株不再產生淀粉酶M，可能的原因是淀粉酶編碼基因M發生突變；或者是重組質粒在大腸桿菌分裂過程中丟失。
（4）肺類裝配體培養需要滿足適宜的營養、溫度、滲透壓、pH以及無菌、無毒環境，含95%空氣和5%CO2的氣體環境等基本條件；由圖示可知，肺類裝配體形成的過程中沒有運用動物細胞融合技術，只涉及了細胞的分裂和分化等內容。
（5）科研人員擬用MRSA感染肺類裝配體建立感染模型，來探究解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽是否對MRSA引起的肺炎有治療潛力，必備實驗材料為：②MRSA感染的肺類裝配體、 ③解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽、④生理鹽水（設置對照實驗使用）、 ⑥萬古霉素（抗MRSA的藥物，比較解淀粉芽孢桿菌H抗菌肽的療效），故選②③④⑥。
9.（2022·湖南·高考真題）黃酒源于中國，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大發酵酒。發酵酒的釀造過程中除了產生乙醇外，也產生不利于人體健康的氨基甲酸乙酯（EC）。EC主要由尿素與乙醇反應形成，各國對酒中的EC含量有嚴格的限量標準。回答下列問題:
(1)某黃酒釀制工藝流程如圖所示，圖中加入的菌種a是 ，工藝b是 （填“消毒”或“滅菌”），采用工藝b的目的是 。
(2)以尿素為唯一氮源的培養基中加入 指示劑，根據顏色變化，可以初步鑒定分解尿素的細菌。尿素分解菌產生的脲酶可用于降解黃酒中的尿素，脲酶固定化后穩定性和利用效率提高，固定化方法有 （答出兩種即可）。
(3)研究人員利用脲酶基因構建基因工程菌L，在不同條件下分批發酵生產脲酶，結果如圖所示。推測 是決定工程菌L高脲酶活力的關鍵因素，理由是 。
(4)某公司開發了一種新的黃酒產品，發現EC含量超標。簡要寫出利用微生物降低該黃酒中EC含量的思路 。
【答案】
(1) 酵母菌 消毒 殺死啤酒的中大多數微生物，并延長其保存期
(2) 酚紅 化學結合法、包埋法、物理吸附法
(3) pH 兩圖中脲酶活力隨時間變化的曲線基本一致，而維持pH在6.5不變與pH從6.5降為4.5相比較而言，酶活力值始終要高
(4)方案一：配置一種選擇培養基，篩選出產生EC降解酶的細菌，從細菌中分離得到EC降解酶，純化的EC降解酶進行固定化操作后，加入該黃酒中。方案二：配置一種選擇培養基，篩選出產生脲酶的細菌，從細菌中分離得到脲酶，純化的脲酶進行固定化操作后，在黃酒工藝流程的發酵環節中加入。
【分析】由于細菌分解在尿素的過程中合成脲酶，脲酶將尿素分解成氨，會使培養基堿性增強，pH升高，所以可以用檢測pH的變化的方法來判斷尿素是否被分解，可在培養基中加入酚紅指示劑，尿素被分解后產生氨，pH升高，指示劑變紅。
【詳解】（1）制造果酒利用的是酵母菌的無氧呼吸，加入的菌種a是酵母菌。過濾能除去啤酒中部分微生物，工藝b是消毒，目的是殺死啤酒的中大多數微生物，并延長其保存期。
（2）由于細菌分解尿素的過程中合成脲酶，脲酶將尿素分解成氨，會使培養基堿性增強，pH升高，所以可以用檢測pH的變化的方法來判斷尿素是否被分解，故在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑可以鑒別尿素分解菌。固定化酶實質上是將相應酶固定在不溶于水的載體上，實現酶的反復利用，并提高酶穩定性，酶的各項特性（如高效性、專一性和作用條件的溫和性）依然保持。固定化酶的方法包括化學結合法、包埋法、物理吸附法等。
（3）對比兩坐標曲線，兩圖中脲酶活力隨時間變化的曲線基本一致，說明培養時間不是決定因素；而維持pH在6.5不變與pH從6.5降為4.5相比較而言，酶活力值始終要高，說明pH為6.5時，有利于酶結構的穩定，故pH是決定工程菌L高脲酶活力的關鍵因素。
（4）從坐標圖形看，利用脲酶消除其前體物質尿素可降低該黃酒中EC含量。配置一種選擇培養基，篩選出產生EC降解酶的細菌，從細菌中分離得到EC降解酶，純化的EC降解酶進行固定化操作后，加入該黃酒中。或者配置一種選擇培養基，篩選出產生脲酶的細菌，從細菌中分離得到脲酶，純化的脲酶進行固定化操作后，在黃酒工藝流程的發酵環節中加入。
10.（2023·湖北·高考真題）某病毒對動物養殖業危害十分嚴重。我國學者擬以該病毒外殼蛋白A為抗原來制備單克隆抗體，以期快速檢測該病毒，其主要技術路線如圖所示。

回答下列問題：
(1)與小鼠骨髓瘤細胞融合前，已免疫的脾細胞（含漿細胞） （填“需要”或“不需要”）通過原代培養擴大細胞數量；添加脂溶性物質PEG可促進細胞融合，該過程中PEG對細胞膜的作用是 。
(2)在雜交瘤細胞篩選過程中，常使用特定的選擇培養基（如HAT培養基），該培養基對 和 生長具有抑制作用。
(3)單克隆抗體篩選中，將抗體與該病毒外殼蛋白進行雜交，其目的是 。
(4)構建重組質粒需要使用DNA連接酶。下列屬于DNA連接酶底物的是 。

【答案】
(1) 不需要
使細胞接觸處的磷脂分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合
(2) 未融合的親本細胞 融合的具有同種核的細胞
(3)通過抗體檢測呈陽性來獲得分泌所需抗體的雜交瘤細胞
(4)④
【分析】單克隆抗體制備流程：先給小鼠注射特定抗原使之發生免疫反應，之后從小鼠脾臟中獲取已經免疫的B淋巴細胞；誘導B細胞和骨髓瘤細胞融合，利用選擇培養基篩選出雜交瘤細胞；進行抗體檢測，篩選出能產生特定抗體的雜交瘤細胞；進行克隆化培養，即用培養基培養和注入小鼠腹腔中培養；最后從培養液或小鼠腹水中獲取單克隆抗體。
【詳解】
（1）漿細胞是高度分化的細胞，不能增殖，所以不需要通過原代培養擴大細胞數量。脂溶性物質PEG可使細胞接觸處的磷脂分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合。
（2）在雜交瘤細胞篩選過程中，用特定的選擇培養基進行篩選，在該培養基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。
（3）單克隆抗體篩選中，將抗體與該病毒外殼蛋白進行雜交，是運用了抗原-抗體雜交技術，抗體檢測呈陽性的細胞，即為所需的雜交瘤細胞。
（4）DNA連接酶能連接DNA片段，脫氧核苷酸的磷酸基團位于5'端，-OH位于3'端，①②③脫氧核苷酸鏈的兩端基團有誤；DNA連接酶能催化合成磷酸二酯鍵，即將一條脫氧核苷酸5'端的磷酸基團與另一條脫氧核苷酸鏈的3'端的-OH相連，④符合題意。
故選④。
1.（2024·云南昭通·模擬預測）今年4月27日，大熊貓“丫丫”回國在社會上引起了巨大反響。自然狀態下的大熊貓繁殖能力較低，曾一度瀕臨滅絕，我國科學家利用胚胎工程的技術手段大大提高了熊貓的繁殖率，目前我國的熊貓數量已經有2400余只。請回答下列問題：
(1)大熊貓主要以竹子為食，研究人員為了從大熊貓糞便中篩選出纖維素分解菌，將大熊貓新鮮糞便樣品稀釋液接種至以 為唯一碳源的固體培養基上進行培養。配制的培養基可用 方法進行滅菌處理。檢測固體培養基滅菌效果的常用方法是 。
(2)大熊貓體內受精受孕率低，可利用體外受精。受精前需要對采集的精子進行 處理，收集的卵母細胞要培養至 期。
(3)為了進一步提高熊貓的產子率，科學家用了胚胎分割技術，該技術屬于 （填“有性”或“無性”）生殖，進行胚胎分割時，應選擇發育良好、形態正常的 。胚胎移植前有時需進行性別鑒定，目前SRY-PCR技術是哺乳動物性別鑒定最有效的方法，操作的基本程序是：從被測的囊胚中取 細胞，提取DNA，然后用位于Y染色體上的性別決定基因（即SRY基因）的一段堿基序列作為 ，用被測胚胎DNA作模板進行PCR擴增，若通過鑒定，出現陽性反應的胚胎為雄性。
【答案】
(1) 纖維素 高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌） 將滅菌后的空白培養基（與接種過的培養基），放在相同且適宜的條件下培養，培養后若空白培養基沒有產生菌落，則說明培養基滅菌徹底
(2) 獲能 MⅡ（期）
(3) 無性 桑葚胚或囊胚 滋養層 引物
【分析】分解纖維素的微生物分離的實驗原理：
土壤中存在著大量纖維素分解酶，包括真菌、細菌和放線菌等，它們可以產生纖維素酶。纖維素酶是一種復合酶，可以把纖維素分解為纖維二糖，進一步分解為葡萄糖使微生物加以利用，故在用纖維素作為唯一碳源的培養基中，纖維素分解菌能夠很好地生長，其他微生物則不能生長；
（2）在培養基中加 入剛果紅，可與培養基中的纖維素形成紅色復合物，當纖維素被分解后，紅色復合物不能形成，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈，從而可篩選纖維素分解菌。
【詳解】
（1）在用纖維素作為唯一碳源的培養基中，纖維素分解菌能夠很好地生長，其他微生物則不能生長。 為篩選纖維素分解菌，將大熊貓新鮮糞便樣品稀釋液接種至以纖維素為唯一碳源的固體培養基上進行培養；配制培養基的常用高壓蒸汽滅菌，即將培養基置于壓力100kPa、溫度121℃條件下維持15~30分鐘，目的是為了殺死培養基中的所有微生物(微生物和芽孢、孢子)。為檢測滅菌效果可對培養基進行空白培養，即將未接種的培養基在放在相同且適宜的條件下培養，若在適宜條件下培養無菌落出現，說明培養基滅菌徹底，否則說明培養基滅菌不徹底。
（2）采集的精子要進行獲能處理，才能用于體外受精，收集的卵母細胞要培養至MII期才能用于體外受精。
（3）胚胎分割技術用一個胚胎培育出多個后代，不經受精作用屬于無性生殖；胚胎分割要在發育程度較低的桑椹胚或囊胚時期進行。胚胎性別鑒定操作的基本程序是從被測的囊胚中取滋養層細胞，提取DNA，取滋養層細胞不會影響到內細胞團；Y染色體上的性別決定基因(即SRY基因)的一段堿基序列設計引物，用被測胚胎DNA作模板進行PCR擴增；若存在Y染色體，則存在SRY基因，PCR是體外進行DNA復制，因此能擴增出相應的條帶，電泳能檢測到相應的基因。
2．（2024·河南開封·二模）蘋果不僅味道香甜，還具有很高的營養價值。用蘋果發酵的果酒具有加速新陳代謝、活血通絡、通便減肥等多種作用。圖1為簡易的發酵瓶，圖2為細胞呼吸的相關代謝途徑。請回答下列問題。
(1)從微生物培養的角度看，作為培養基的蘋果汁能夠為酵母菌提供的營養物質有 。
(2)將蘋果汁、酵母菌等原料裝入圖1所示發酵瓶，然后塞好瓶塞，夾緊進氣管和出氣管，在適宜的溫度條件下靜置。該過程中，發酵瓶內酵母菌可進行圖2中的 （選填編號）過程。
(3)請在坐標圖中，繪制釀造蘋果酒的過程中發酵瓶內酵母菌的種群數量變化曲線（繪出變化趨勢即可） 。酵母菌的數量測定可以用稀釋涂布平板法進行，其中使酵母菌液在培養基表面均勻分布的操作是 。也可以用 計數板對酵母菌進行計數。
(4)若將釀好的蘋果酒置于30～35℃溫度條件下，將發酵瓶的進氣管、出氣管分別 ，再加入適量的醋酸菌，一段時間后酒味會逐漸消失并出現醋酸味，蘋果酒逐漸轉變為蘋果醋。其主要原因是 。
(5)若在制作蘋果酒之前，打開圖1中進氣管、出氣管一段時間，其意圖與發酵工程基本環節中的
目的一致。
【答案】
(1)碳源、氮源、無機鹽、水
(2)①②③
(3) 轉動培養皿，使用涂布器均勻涂布 血細胞
(4) 打開 在氧氣充足的條件下，醋酸菌有氧發酵將乙醇轉變成醋酸
(5)擴大培養
【分析】
1、參與果酒制作的微生物是酵母菌，其新陳代謝類型為異養兼性厭氧型。果酒制作的原理：無氧呼吸產生酒精。
2、參與果醋制作的微生物是醋酸菌，其新陳代謝類型是異養需氧型。果醋制作的原理：當氧氣、糖源都充足時，醋酸菌將葡萄汁中的果糖分解成醋酸。當缺少糖源時，醋酸菌將乙醇變為乙醛，再將乙醛變為醋酸。
【詳解】
（1）從微生物培養的角度看，作為培養基的蘋果汁能夠為酵母菌提供的營養物質有碳源、氮源、無機鹽、水。
（2）將蘋果汁、酵母菌等原料裝入圖1所示發酵瓶，然后塞好瓶塞，夾緊進氣管和出氣管，在適宜的溫度條件下靜置。發酵瓶內保留有一部分空氣，剛開始酵母菌進行有氧呼吸，可以進行圖中①②階段，氧氣耗盡后進行無氧呼吸，可以進行①③階段，總結起來，該過程中，發酵瓶內酵母菌可進行圖2中的①②③過程。
（3）剛開始發酵瓶內營養物質充足，隨著發酵過程不斷進行，種群數量增加，競爭加劇，種群數量呈現S形增長，一段時間后營養物質耗盡，種群數量下降，發酵瓶內酵母菌的種群數量變化曲線如圖：
酵母菌的數量測定可以用稀釋涂布平板法進行，其中使酵母菌液在培養基表面均

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