資源簡介

3.2基因工程的基本操作程序學案
【預習新知】
（一）第一步：目的基因的篩選與獲取
1．基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的__________。
(2)____________的構建。
(3)將目的基因導入________。
(4)目的基因的____________。
2．目的基因
(1)目的基因：用于__________等的基因。主要是指____________的基因。
(2)篩選合適的目的基因
①較為有效的方法：從相關的________和________的基因中進行篩選。
②認識基因結構和功能的技術方法：________技術、________數據庫、________工具。
3．獲取目的基因的途徑
(1)________目的基因。
(2)構建基因文庫獲取目的基因。
(3)________獲取目的基因。
4．利用PCR獲取和擴增目的基因
(1)PCR是________________的縮寫。
(2)PCR原理：________________。
(3)PCR條件：一定的緩沖溶液、________、分別與兩條模板鏈結合的________、4種脫氧核苷酸和________________酶。
(4)每次循環的過程：變性→復性→延伸。
①變性：加熱至90 ℃以上時，________________。
②復性：冷卻至____℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。
③延伸：加熱至72 ℃左右時，4種脫氧核苷酸在耐高溫的__________的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。
(5)特點：上一輪循環的產物作為下一輪反應的________，每一次循環后，目的基因的量可以________，即成________形式擴增(約為2n，n為擴增循環的次數)。
(6)鑒定：常用____________來鑒定PCR的產物。
（二）第二步：基因表達載體的構建
1.操作目的
使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠
作用。
2.基因表達載體的組成及其作用
一個基因表達載體的組成，除了 、 外，還必須有 、 等(如圖所示)。
3.基因表達載體的構建過程
(1)用一定的 切割載體，使其出現一個有黏性末端(或平末端)的切口。
(2)用 種或 的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)加入適量 ，使切下的目的基因片段拼接到載體的切口處。
（三）第三步：將目的基因導入受體細胞
1.將目的基因導入植物細胞
（1）花粉管通道法（受體細胞：__________）
①用微量注射器將含__________的DNA溶液直接注入_____中；
②在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助__________通道進入胚囊。
（2）農桿菌轉化法
①轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程。此處“轉化”與肺炎鏈球菌轉化實驗中的“轉化”含義相同，實質都是__________。
②特點：a.能在自然條件下侵染_____植物和_____植物，而對大多數_____植物沒有侵染能力。b.農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的_________（_______的DNA）轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的__________上。
③實驗思路（過程）：將目的基因插入Ti質粒的_____中，通過農桿菌的_____作用，就可以使目的基因進入植物細胞，并整合到受體細胞的__________上，使目的基因能夠維持_____和_____。
④具體轉化方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農桿菌共培養，然后篩選__________，并再生成植株。b.可以將_____直接浸沒在含有農桿菌的溶液中一段時間，然后培養植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定等。
2.將目的基因導入動物細胞——__________法
（1）受體細胞：__________。因為__________容易表現出__________。
（2）過程：構建基因表達載體并提純→利用__________將基因表達載體注入動物的__________中→早期胚胎培養→__________→獲得具有新性狀的動物。
3.將目的基因導入微生物細胞——__________法
（1）受體細胞：常用__________作為受體細胞，其中以__________最廣泛。優點：繁殖_____、單細胞、遺傳物質__________、易于培養。
（2）__________法（__________法）的一般過程
Ca2+處理大腸桿菌（Ca2+的作用：增加_______________）→使細胞處于一種能吸收周圍環境中__________的生理狀態（這種細胞稱為__________細胞）→將重組的_____________導入其中。
（四）第四步：目的基因的檢測與鑒定
1.分子水平的檢測
(1)導入水平
①技術手段： 等技術。
②檢測目的：檢測受體細胞的 上是否插入了 。
(2)轉錄水平
①技術手段： 等技術。
②檢測目的：檢測目的基因是否轉錄出了 。
(3)翻譯水平
①技術手段： 技術。
②檢測目的：檢測目的基因是否 。
2.個體水平的鑒定
(1)鑒定方法：例如通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲
(2)鑒定目的：確定目的基因是否賦予了轉基因生物特定的 及程度。
【鞏固訓練】
1.下列哪一種方法不能用于檢測目的基因是否成功導入或表達( )
A.在顯微鏡下直接觀察受體細胞中是否含有目的基因
B.通過PCR等技術檢測受體細胞的DNA分子上是否含有目的基因
C.提取受體細胞合成的相應蛋白質,利用抗原一抗體雜交技術進行檢測
D.抗蟲基因導入植物細胞后，檢測植物是否具有抗蟲特性
2.像BclⅠ（-T↓GATCA-）、BglⅡ（-A↓GATCT-）、MboI（-↓GATC-）這樣，識別序列不同，但能產生相同的黏性末端的一類限制酶被稱為同尾酶。如圖表示目的基因及質粒上的酶切位點。選用不同的限制酶對質粒和目的基因進行切割，并用DNA連接酶進行連接。下列分析錯誤的是( )
A.不同的限制酶有不同的識別序列和切割位點
B.用限制酶切割外源DNA分子中部獲得一個目的基因時，被水解的磷酸二酯鍵有4個
C.用BclI和BglⅡ切割質粒和目的基因時，形成的重組質粒的堿基排列順序一定相同
D.用MboI切割質粒，用BclⅠ和BglⅡ切割目的基因，形成的重組質粒可被MboI再次切開
3.為了在大腸桿菌細胞中成功表達人胰島素基因，首先需要提取細胞的mRNA，經逆轉錄等過程來獲取目的基因。下列相關敘述錯誤的是( )
A.逆轉錄過程需要四種游離的核糖核苷酸作為原料
B.用于逆轉錄的mRNA只能從胰島B細胞中獲取
C.經逆轉錄得到的目的基因可經過PCR技術進行擴增
D.逆轉錄獲取目的基因時遵循堿基互補配對原則
4.天然的玫瑰沒有藍色花，這是由于缺少控制藍色色素合成的基因B，而開藍色花的矮牽牛中存在序列已知的基因B。現用基因工程技術培育藍玫瑰，下列操作正確的是( )
A.提取矮牽牛藍色花的mRNA，從而獲得互補DNA，再擴增基因B
B.利用DNA連接酶從開藍色花矮牽牛的基因文庫中可以獲取基因B
C.利用DNA聚合酶將基因B與質粒連接后導入玫瑰細胞
D.將基因B直接導入大腸桿菌，然后感染并轉入玫瑰細胞
5.如圖為轉基因抗凍番茄培育過程的示意圖（其中AmpR為抗氨芐青霉素基因）。下列敘述正確的是( )
A.可同時選用限制酶PstⅠ,SmaⅠ對含目的基因的DNA進行切割
B.過程2中，可直接將過程①得到的產物注入受體細胞
C.過程③需要用到纖維素酶和果膠酶，以便獲得并培養活的原生質體
D.過程④中，若利用探針在試管苗細胞內檢測到目的基因，則轉基因成功
6.下列關于PCR操作過程的敘述，錯誤的是( )
A.PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌
B.PCR所用的緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存
C.將PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出，放在高溫環境中迅速融化
D.在微量離心管中添加反應成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換
7.CRISPR/Cas13d技術是一項以向導RNA(gRNA)引導Cas13d蛋白定向作用于靶向RNA的新興技術。研究人員設計了若干個gRNA，分別靶向新冠病毒RNA基因組的不同肽編碼區，但不影響人體細胞的RNA，作用機理如圖所示。下列相關敘述錯誤的是( )
A.gRNA通過與靶向RNA堿基互補配對將Cas13d蛋白引導至特定位點
B.Cas13d蛋白能定向切開相鄰兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵
C.與限制性內切核酸酶相比，Cas13d蛋白不具有特異性識別能力
D.該技術有望成為一種能定向、靈活治療RNA病毒感染的新方法
8.下列關于基因工程及其應用的敘述正確的是( )
A.若要生產轉基因抗病水稻，可先將目的基因導入大腸桿菌中，再轉入水稻細胞
B.用氨基酸序列推測合成的目的基因與原基因的編碼區中的外顯子一致
C.用PCR技術能檢測飲用水中重金屬物質的含量
D.作為運載體要有多種限制酶的切點，但對一種限制酶而言，最好只有一個切點
9.大腸桿菌pUC118質粒具有氨芐青霉素抗性基因,某限制酶唯一切點位于該質粒的lacZ基因中。在特定的選擇培養基中,若lacZ基因沒有被破壞,則大腸桿菌菌落呈藍色;若lacZ基因被破壞,則菌落呈白色。如圖表示轉基因操作過程,下列說法錯誤的是( )
A.作為受體大腸桿菌應不含氨芐青霉素抗性基因,以便于篩選
B.若大腸桿菌的菌落為藍色,則質粒未導入大腸桿菌
C.選擇培養基中除必需的營養物質外,還應加入適量氨芐青霉素
D.應選擇白色菌落的大腸桿菌進行擴大培養
10.下圖1是某基因工程中構建重組質粒的過程示意圖，其中tetr是四環素抗性基因、ampr是氨芐青霉素抗性基因。下列有關敘述正確的是( )
A.質粒P1經“酶處理”后平末端轉變成黏性末端，有利于與目的基因片段的連接
B.質粒P2和目的基因片段可在DNA聚合酶或DNA連接酶的作用下形成重組質粒
C.若受體微生物能在含有氨芐青霉素的培養基上生長，說明成功導入了重組質粒P3
D.E·coli DNA連接酶既可以連接平末端，又可以連接黏性末端
參考答案
1.答案：A
解析：檢測目的基因是否成功導入或表達的方法有多種。①分子水平上的檢測：通過PCR等技術檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因或檢測目的基因是否轉錄出了mRNA；檢測目的基因是否翻譯成蛋白質用抗原一抗體雜交技術。②個體生物學水平的鑒定；檢測生物個體是否具有抗性及抗性程度；檢測基因工程產品與天然產品的活性是否相同等。在顯微鏡下無法觀察到受體細胞中是否含有目的基因，故選A。
2.答案：C
解析：A、酶具有專一性，不同的限制酶有不同的識別序列和切割位點，A正確；
B、用限制酶切割一個DNA分子中部，獲得一個目的基因時，需要切割目的基因的兩側（兩側的兩條鏈），因此要斷裂4個磷酸二酯鍵，B正確；
C、切割質粒和切割目的基因用均用BclⅠ和BglⅡ，由題干可知，兩種酶切割后產生的黏性末端相同，形成的重組質粒時目的基因可能反向連接，形成的堿基排列順序不一定相同，C錯誤；
D、切割質粒用MboⅠ，產生黏性末端且識別序列為-GATC-，切割目的基因用BclⅠ和BglⅡ，產生黏性末端（-GATC-），形成的重組質粒中原來的BclⅠ和BglⅡ的切割位點的序列發生改變，不能再被這兩種酶切割，但不影響MboⅠ的作用（能識別-GATC-），D正確。
故選C。
3.答案：A
解析：A、逆轉錄過程是以RNA為模板合成DNA的過程,需要以四種游離的脫氧核糖核苷酸為原料,A錯誤;B、由于基因的選擇性表達,所以用于逆轉錄的mRNA只能從胰島B細胞中獲取,B正確;C、經逆轉錄得到的目的基因可經過PCR技術進行擴增,獲得大量的目的基因,C正確;D、逆轉錄獲取目的基因時遵循堿基互補配對原則,即A一T、U—A、G—C、C一G,D正確。故選:A。
4.答案：A
解析：控制藍色色素合成的基因B即為我們所需要的目的基因，可通過逆轉錄法獲得基因B，再進行擴增以增加其數量；基因文庫中保存的是各基因片段，提取時使用限制性核酸內切酶；為使目的基因在受體細胞中穩定存在且能向下一代遺傳，應先在體外使用DNA連接酶構建基因表達載體，然后再導入玫瑰細胞。
5.答案：A
解析：目的基因兩側分別有限制酶SmaⅠ和PstⅠ的識別序列，且質粒上也含有這兩種限制酶的切割位點，所以可同時選用限制酶PstⅠ、SmaⅠ對含目的基因的DNA進行切割，A正確;目的基因不可直接導入植物細胞，常用花粉管通道法或農桿菌轉化法，B錯誤;過程③為植物組織培養，不需要用纖維素酶和果膠酶處理，C錯誤；過程④中，若利用探針在試管苗細胞內檢測到目的基因，不能說明轉基因成功，轉基因成功的標志是目的基因成功表達出相應性狀，D錯誤。
6.答案：C
解析：為了避免外源DNA等因素的影響，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌，A正確；PCR所用的緩沖液和酶一般需要分裝成小份，并在-20 ℃儲存，使用前，將PCR所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化，B正確，C錯誤；為避免試劑的交叉污染，在微量離心管中添加反應成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，D正確。
7.答案：B
解析：向導RNA(gRNA)通過與靶向RNA堿基互補配對，引導Cas13d蛋白定向作用于靶向RNA，切開相鄰兩個核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵，A正確，B錯誤；限制酶通過識別特定的堿基序列起作用，Cas13d蛋白無特異性識別堿基序列的能力，C正確；向導RNA(gRNA)可定向作用于靶向RNA，可用于治療RNA病毒感染，D正確。
8.答案：D
解析：A、水稻屬于單子葉植物，一般利用基因槍法將目的基因導入受體細胞，A錯誤；
B、由于密碼子的簡并性，用氨基酸序列推測合成的目的基因與原基因的編碼區中的外顯子不一定相同，B錯誤；
C、PCR技術的原理是DNA半保留復制，重金屬物質不含DNA，因此用PCR技術不能檢測飲用水中重金屬物質的含量，C錯誤；
D、對某種限制酶而言，運載體最好只有一個限制酶切點，但運載體上還要有其他多種限制酶切點，D正確。
故選D。
9.答案：B
解析：A. 判斷重組質粒是否導入，依據質粒上的氨芐青霉素抗性基因（標記基因），所以受體細胞應不含有氨芐青霉素抗性基因，A正確；
B. 若lacZ基因沒有被破壞，則大腸桿菌菌落呈藍色，因此如果大腸桿菌的菌落為藍色，說明lacZ基因沒有被破壞，因此pUC118質粒已轉入受體菌，但目的基因沒有接入運載體，B錯誤；
C. 選擇培養基中除必需的營養物質外，還應加入適量氨芐青霉素，這樣可以將沒有導入目的基因的大腸桿菌淘汰，C正確；
D. 白色菌落的大腸桿菌是轉入了目的基因的，所以應選擇白色菌落的大腸桿菌進行擴大培養，D正確。
故選：B。
10.答案：A
解析：A、質粒P1經“酶處理”后由平末端轉變成黏性末端,能提高目的基因片段和質粒的連接效率,A正確;B、質粒P2和目的基因片段可在DNA連接酶的作用下形成重組質粒,這里不需要DNA聚合酶,B錯誤;C、圖示的質粒均含有抗氨芐青霉素的基因,因此,若受體微生物能在含有氨芐青霉素的培養基上生長,則不能說明成功導入了重組質粒P3,C錯誤;D、用PCR鑒定篩選出的菌落中是否含正確插入目的基因的重組質粒,應選擇引物乙和丙即可,因為PCR擴增的DNA片段是引物之間的序列,擴增乙和丙之間的序列就包含了目的基因,因而沒有必要擴增更長的序列,D錯誤;故選A。

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