資源簡(jiǎn)介

第3章 第1節(jié)　重組DNA技術(shù)的基本工具
課標(biāo)內(nèi)容要求
1.概述基因工程是在遺傳學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的。
2．闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。
核心素養(yǎng)對(duì)接
1.科學(xué)思維：模擬重組DNA分子的操作過(guò)程，說(shuō)出合成新DNA分子的基本原理。
2．社會(huì)責(zé)任：關(guān)注基因工程的社會(huì)議題，參與討論基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展如何催生基因工程。
自主學(xué)習(xí)
一、基因工程及其誕生與發(fā)展
1．基因工程的概念 (1)操作場(chǎng)所： 。 (2)操作技術(shù)： 等技術(shù)。
(3)操作結(jié)果：賦予生物新的 ，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的 和生物產(chǎn)品。
(4)操作水平： 水平。
2．基因工程的誕生和發(fā)展
(1)基因工程的誕生
①1944年，艾弗里等人通過(guò)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明了 ，還證明了
。
②1953年，沃森和克里克建立了 模型并提出了 的假說(shuō)。
③1961年，尼倫伯格和馬太破譯了 。
④20世紀(jì)70年代初， 、 和 被相繼發(fā)現(xiàn)，為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。
⑤1973年，科學(xué)家證明 可以作為基因工程的載體，構(gòu)建 ，使外源基因在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)物種間的基因交流。
(2)基因工程的發(fā)展
①1982年，第一個(gè)基因工程藥物—— 被批準(zhǔn)上市。
②1984年，我國(guó)科學(xué)家朱作言領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)培育出 。
③1985年，穆里斯等人發(fā)明 ，為獲取目的基因提供了有效手段。
④1990年， 計(jì)劃啟動(dòng)。2003年，該計(jì)劃的測(cè)序任務(wù)順利完成。
⑤21世紀(jì)以來(lái)，科學(xué)家發(fā)明了多種 ，可以實(shí)現(xiàn)低成本測(cè)定大量核酸序列，加速了人們對(duì)基因序列的了解。
⑥2013年，華人科學(xué)家張鋒及其團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道利用最新的 技術(shù)編輯了哺乳動(dòng)物基因組。
二、DNA重組技術(shù)的基本工具
1．限制性內(nèi)切核酸酶(又稱限制酶)—“分子手術(shù)刀”
(1)來(lái)源：主要來(lái)自 。
(2)功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定 ，并使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的 鍵斷開。
(3)結(jié)果：產(chǎn)生 。
(4)應(yīng)用：已知限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為G↓AATTC和CCC↓GGG，在圖中寫出兩種限制酶切割DNA后產(chǎn)生的末端并寫出末端的種類。
EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶識(shí)別的 不同，切割位點(diǎn) (填“相同”或“不同”)，說(shuō)明限制酶具有 。
2．DNA連接酶—“分子縫合針”
(1)作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的 。
(2)種類[填表]
種類 比較 E.coli DNA連接酶 T4 DNA連接酶
來(lái)源
特點(diǎn) 只能連接 既可以連接黏性末端，又可以連接
3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”
(1)質(zhì)粒
①質(zhì)粒的本質(zhì)：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，獨(dú)立于 之外，并具有 能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。
②質(zhì)粒適于作基因運(yùn)載體的特點(diǎn)
Ⅰ.質(zhì)粒分子上有一個(gè)至多個(gè) 位點(diǎn)，供外源DNA片段插入其中。
Ⅱ.攜帶外源DNA片段的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后，能在細(xì)胞中 ，或 上，
同步復(fù)制。
Ⅲ.人工改造的質(zhì)粒常帶有 ，便于 。
(2)噬菌體、動(dòng)植物病毒等。
三、重組DNA分子的模擬操作
1．材料用具：剪刀代表EcoR_Ⅰ，透明膠條代表 。
2．切割位點(diǎn)
(1)分別從兩塊硬紙板上的一條DNA鏈上找出 序列，并選 之間作切口進(jìn)行“切割”。
(2)再?gòu)牧硪粭l鏈上 之間尋找EcoR Ⅰ相應(yīng)的切口剪開。
3．操作結(jié)果：若操作正確，不同顏色的黏性末端應(yīng)能 ；否則，說(shuō)明操作有誤。
四、DNA的粗提取與鑒定
1．實(shí)驗(yàn)原理
(1) 不溶于酒精， 溶于酒精。
(2)DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于 溶液。
(3)在一定溫度下，DNA 試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。
2．實(shí)驗(yàn)步驟
(1)稱取30 g洋蔥，切碎，加入10 mL研磨液，充分研磨。
↓
(2)漏斗中墊 ，將研磨液過(guò)濾到燒杯中， ℃處理，取上清液。
↓
(3)在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的 溶液，靜置2～3 min，用玻璃棒沿同一方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去水分。
↓
(4)取兩支20 ml的試管編號(hào)A、B，各加入2 mol/L的 溶液5 mL，將絲狀物溶于B試管的NaCl溶液中。然后向兩支試管中各加入4 mL的 。混勻后，將試管置于沸水中加熱5 min。
↓
(5)結(jié)果觀察：A試管 ，B試管 。
基礎(chǔ)診斷
判斷對(duì)錯(cuò)(正確的打“√”，錯(cuò)誤的打“×”)
1．基因工程的原理是基因重組，不過(guò)在這里這種變異是定向的。 ( )
2．DNA聚合酶也可以用作DNA重組技術(shù)的工具。 ( )
提示：DNA重組技術(shù)的工具有限制酶、DNA連接酶和載體，沒有DNA聚合酶。
3．限制酶在原來(lái)的原核細(xì)胞內(nèi)對(duì)細(xì)胞自身有害。 ( )
提示：限制酶在原來(lái)的原核細(xì)胞內(nèi)用于切割外源DNA，使之失效，從而保護(hù)自身。
4．不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端相同。 ( )
5．DNA連接酶既能連接黏性末端，又能連接平末端。 ( )
提示：E.coli DNA連接酶不能連接平末端。
6．載體的種類有質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等，其中動(dòng)植物病毒必須是DNA病毒。 ( )
核心突破
　基因工程的工具酶
1．限制性內(nèi)切核酸酶
(1)作用特點(diǎn)：具有專一性，表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面
①能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列。 ②能夠切割特定序列中的特定位點(diǎn)。
(2)識(shí)別序列的特點(diǎn)：遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，無(wú)論是奇數(shù)個(gè)堿基還是偶數(shù)個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，如圖，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。如以中心線為軸，兩側(cè)堿基互補(bǔ)對(duì)稱；以為軸，兩側(cè)堿基互補(bǔ)對(duì)稱。
(3)作用產(chǎn)物：黏性末端或平末端。
①黏性末端：是限制性內(nèi)切核酸酶在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時(shí)形成的，如圖所示：
②平末端：是限制性內(nèi)切核酸酶在它識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)形成的，如圖所示：
2．限制性內(nèi)切核酸酶與DNA連接酶的關(guān)系
(1)區(qū)別：
作用 應(yīng)用
限制性內(nèi)切核酸酶 使特定部位的磷酸二酯鍵斷裂 用于提取目的基因和切割載體
DNA連接酶 在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵 用于目的基因和載體的連接
(2)兩者的關(guān)系可表示為：
3．DNA連接酶與DNA聚合酶的比較
比較項(xiàng)目 DNA連接酶 DNA聚合酶
相同點(diǎn) 作用實(shí)質(zhì)相同，都是催化磷酸二酯鍵的形成
不同點(diǎn) 是否需要模板 不需要 需要
接DNA鏈 雙鏈 單鏈
作用過(guò)程 在兩個(gè)DNA片段間形成磷酸二酯鍵 將單個(gè)核苷酸加到已存在的DNA單鏈片段上，形成磷酸二酯鍵
作用結(jié)果 將已存在的DNA片段連接 合成新的DNA分子
用途 基因工程 DNA復(fù)制
合作探究：(1)為什么限制酶主要從原核生物中分離純化而來(lái)？推測(cè)它在原核生物中的作用是什么？它會(huì)不會(huì)切割自己的DNA分子？
提示：原核細(xì)胞容易受到外源DNA的入侵，原核細(xì)胞中的限制酶能夠切割入侵的外源DNA而保護(hù)自身。原核細(xì)胞中的限制酶不會(huì)切割自己的DNA分子，因?yàn)槊妇哂袑Ｒ恍曰蜃约旱腄NA分子已被修飾而不被識(shí)別。
(2)限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶的作用是否都體現(xiàn)了酶的專一性？
提示：限制性內(nèi)切核酸酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開，體現(xiàn)了酶的專一性。E.coli DNA連接酶能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來(lái)，對(duì)末端的堿基序列沒有要求；T4 DNA連接酶既可以連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA分子的平末端，都對(duì)末端的堿基序列沒有要求，因此DNA連接酶的作用沒有體現(xiàn)酶的專一性。
練習(xí)一：
1．限制酶a和b的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如圖所示，下列有關(guān)說(shuō)法正確的是(　　)
A．一個(gè)DNA分子中，酶a與酶b的識(shí)別序列可能有多個(gè)
B．酶a與酶b切出的黏性末端不能相互連接
C．酶a與酶b切斷的化學(xué)鍵不完全相同
D．用酶a切割有3個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的質(zhì)粒，得到4種切割產(chǎn)物
2．下列有關(guān)DNA連接酶的敘述，正確的是(　　)
A．T4 DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間連接起來(lái)
B．E.coli DNA連接酶能將雙鏈DNA片段平末端之間進(jìn)行連接
C．DNA連接酶能恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵
D．DNA連接酶可連接DNA雙鏈的氫鍵，使雙鏈延伸
3．下列關(guān)于幾種酶作用的敘述，錯(cuò)誤的是(　　)
A．DNA連接酶能使不同脫氧核苷酸的磷酸與脫氧核糖連接
B．RNA聚合酶能與基因的特定位點(diǎn)結(jié)合，催化遺傳信息的轉(zhuǎn)錄
C．一種限制酶能識(shí)別多種核苷酸序列，并切割出多種目的基因
D．DNA聚合酶能把單個(gè)脫氧核苷酸分子連接成一條DNA單鏈
　基因工程中的載體
1．種類
(1)常用載體：質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。
(2)其他載體：噬菌體、動(dòng)植物病毒等。
2．具備條件
(1)能自我復(fù)制：能夠在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進(jìn)行同步復(fù)制。
(2)有切割位點(diǎn)：有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源基因插入。
(3)具有標(biāo)記基因：具有特殊的標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。
(4)無(wú)毒害作用：對(duì)受體細(xì)胞無(wú)毒害作用，否則受體細(xì)胞將受到損傷甚至死亡。
說(shuō)明：一般來(lái)說(shuō)，天然載體不能同時(shí)滿足所有條件，要對(duì)其進(jìn)行人工改造才可以使用。
3．作用
(1)用它作為運(yùn)輸工具，將目的基因送入受體細(xì)胞中。
(2)利用它在受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。
合作探究：1.細(xì)胞膜上的載體與基因工程中的載體有什么不同？
提示：(1)化學(xué)本質(zhì)不同：細(xì)胞膜上的載體化學(xué)成分是蛋白質(zhì)；基因工程中的載體可能是物質(zhì)，如質(zhì)粒(DNA)、λ噬菌體的衍生物，也可能是生物，如動(dòng)植物病毒等。
(2)功能不同：細(xì)胞膜上的載體功能是協(xié)助細(xì)胞膜控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞；基因工程中的載體是一種“分子運(yùn)輸車”，把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。
2．標(biāo)記基因標(biāo)記的原理是什么？
提示：(1)前提：載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。
(2)過(guò)程：含有某抗生素抗性基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，受體細(xì)胞對(duì)該抗生素產(chǎn)生抗性，因此培養(yǎng)受體細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入該種抗生素即可篩選。
(3)結(jié)果：在培養(yǎng)基上，被抗生素殺死的是沒有抗性的受體細(xì)胞，沒被殺死的具有抗性的受體細(xì)胞得以篩選。
原理如圖所示：
練習(xí)二：
1．作為基因的運(yùn)輸工具——載體，必須具備的條件之一及理由是(　　)
A．能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來(lái)并大量復(fù)制，以便提供大量的目的基因
B．具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便于目的基因的表達(dá)
C．具有某些標(biāo)記基因，以使目的基因能夠與其結(jié)合
D．對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)傷害，以便于重組DNA的鑒定和選擇
2．限制酶Mun Ⅰ和限制酶EcoR Ⅰ的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)分別是。下圖表示四種質(zhì)粒和目的基因，其中，質(zhì)粒上箭頭所指部位為酶的識(shí)別位點(diǎn)，陰影部分表示標(biāo)記基因。適于作為圖示目的基因載體的質(zhì)粒是(　　)
A　[用限制酶Mun Ⅰ切割A(yù)質(zhì)粒后，不會(huì)破壞標(biāo)記基因，而且還能產(chǎn)生與目的基因兩側(cè)黏性末端相同的末端，適于作為目的基因的載體。B項(xiàng)中質(zhì)粒沒有標(biāo)記基因，不適于作為目的基因的載體。C、D質(zhì)粒含有標(biāo)記基因，但用限制酶切割后會(huì)被破壞，因此不適于作為目的基因的載體。]
3．某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamH Ⅰ酶切后，與用BamH Ⅰ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問題：
(1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有___(答出兩點(diǎn)即可)。而作為基因表達(dá)載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動(dòng)子和終止子。
(2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是_________；并且__________和_________的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是______________________。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有________的固體培養(yǎng)基。
(3)基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復(fù)制所需的原料來(lái)自________。
[課堂小結(jié)]
課堂檢測(cè)
1．下列對(duì)基因工程的說(shuō)法，錯(cuò)誤的是(　　)
A．基因工程是在分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工
B．基因工程產(chǎn)生的變異屬于染色體變異
C．基因工程可以導(dǎo)入不同種生物的基因
D．基因工程可定向改變生物性狀
2．“分子縫合針”——DNA連接酶“縫合”的部位是(　　)
A．堿基對(duì)之間的氫鍵 B．堿基與脫氧核糖
C．雙鏈DNA片段間的磷酸二酯鍵 D．脫氧核糖與脫氧核糖
3．質(zhì)粒是基因工程最常用的載體，下列有關(guān)質(zhì)粒的說(shuō)法錯(cuò)誤的是(　　)
A．質(zhì)粒不僅存在于細(xì)菌中，某些病毒也具有
B．質(zhì)粒作為載體時(shí)，應(yīng)具有標(biāo)記基因和多個(gè)限制酶切點(diǎn)
C．質(zhì)粒為小型環(huán)狀DNA分子，存在于擬核(區(qū))外的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中
D．質(zhì)粒能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定保存，并在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制
4．下列是基因工程的有關(guān)問題，請(qǐng)回答：
(1)限制性內(nèi)切核酸酶可以識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的________(填化學(xué)鍵名稱)斷裂，形成的末端總體可分為兩種類型，分別是________________。
(2)目的基因和載體重組時(shí)需要的工具酶是________，與限制性內(nèi)切核酸酶相比，它對(duì)所重組的DNA
答 案
一、1． (1)生物體外。 (2)轉(zhuǎn)基因 (3)遺傳特性 生物類型 (4) DNA分子
2．(1) ①遺傳物質(zhì)是DNA DNA可以在同種生物的不同個(gè)體之間轉(zhuǎn)移
②DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) 遺傳物質(zhì)自我復(fù)制 ③第一個(gè)編碼氨基酸的密碼子
④多種限制酶、DNA連接酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 ⑤質(zhì)粒 重組DNA
(2) ①重組人胰島素 ②世界上第一條轉(zhuǎn)基因魚 ③PCR
④人類基因組 ⑤高通量測(cè)序技術(shù) ⑥基因組編輯
二、1．(1)原核生物 (2)核苷酸序列 磷酸二酯鍵
(3)黏性末端或平末端 (4)堿基序列 不同 專一性
2．(1)磷酸二酯鍵 (2) ①大腸桿菌 ②T4噬菌體 ③黏性末端 ④平末端
3.(1)質(zhì)粒①真核細(xì)胞的細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA 自我復(fù)制
②Ⅰ.限制酶切割 Ⅱ.進(jìn)行自我復(fù)制 整合到受體DNA上 隨受體細(xì)胞DNA
Ⅲ.標(biāo)記基因 重組DNA分子的篩選
三、1． DNA連接酶 2．(1) G—A—A—T—T—C G—A (2)互補(bǔ)的堿基
3．互補(bǔ)配對(duì)
四、1．(1)DNA 蛋白質(zhì) (2) 2_mol/L的NaCl (3)遇二苯胺
2.(2)紗布 4 (3)酒精 (4) NaCl 二苯胺試劑 沸水 (5)不變藍(lán) 變藍(lán)色
基礎(chǔ)診斷：1．√ 2.× 3.× 4.√ 5.× 6.√
練習(xí)一：1．A 2.C 3.C
練習(xí)二：1．A 2.A 3. (1)能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因　 (2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)　 含有質(zhì)粒載體　 含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒(或含有重組質(zhì)粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng) 　四環(huán)素　(3)受體細(xì)胞
課堂檢測(cè)：1．B 2.C 3.A
4. (1)磷酸二酯鍵　 黏性末端和平末端　 (2)DNA連接酶 　 無(wú)
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