資源簡(jiǎn)介

(共73張PPT)
專題突破10
綜合PCR的基因工程問(wèn)題
闡述常規(guī)PCR、重疊延伸PCR、熒光定量PCR等的過(guò)程與原理，舉例說(shuō)明不同的PCR技術(shù)有著不同的應(yīng)用。
課標(biāo)要求
考情分析
幾種不同PCR的應(yīng)用 2023·江蘇·T22　2023·山東·T25　2022·江蘇·T24　2022·山東·T25
2021·全國(guó)甲·T38　2021·山東·T25　2020·北京·T12　2020·江蘇·T33
類型一　利用PCR技術(shù)獲取目的基因
基本模型
獲取目的基因是基因工程操作的第一步。獲取目的基因的方法有多種，現(xiàn)在常用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因。PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫。它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。該技術(shù)由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
典例突破
1.“X基因”是DNA分子上一個(gè)有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖1所示。下列敘述錯(cuò)誤的是
典例突破
A.第一輪復(fù)制得到2個(gè)DNA分子，即
　①②各一個(gè)
B.第二輪復(fù)制得到4個(gè)DNA分子，即
　①②③④各一個(gè)
C.第四輪復(fù)制得到16個(gè)DNA分子，其
　中有4個(gè)X基因
D.經(jīng)五輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的
　DNA分子
√
據(jù)圖分析可知，第一輪復(fù)制形成2個(gè)DNA分子，即①②各一個(gè)，A正確；
第二輪復(fù)制得到22＝4(個(gè))DNA分子，即①?gòu)?fù)制得①和③、②復(fù)制得②和④，即得到①②③④各一個(gè)，B正確；
典例突破
第四輪復(fù)制得到16個(gè)DNA分子，其中有8個(gè)⑤(X基因)，C錯(cuò)誤；
經(jīng)五輪循環(huán)后共形成32個(gè)DNA分子，其中①②各一個(gè)，③④各四個(gè)，22個(gè)⑤，故產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子，D正確。
典例突破
類型二　利用PCR技術(shù)鑒定目的基因的連接方式
基本模型
檢測(cè)目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)是否穩(wěn)定存在是基因工程操作的重要步驟，可以借助載體上的標(biāo)記基因、PCR技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)等方法鑒定受體細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)入了目的基因。在實(shí)際操作中，PCR技術(shù)不僅可以精準(zhǔn)地鑒定受體細(xì)胞是否轉(zhuǎn)入目的基因，還可以通過(guò)引物的巧妙設(shè)計(jì)鑒定目的基因的連接方式。
2.(2019·江蘇，33節(jié)選)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇
的一對(duì)引物是________。某學(xué)生嘗試用圖中另外
一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400 bp
片段，原因是____________________。
乙、丙
目的基因反向連接
典例突破
分析題圖可知，理論上可以選擇的引物組合有甲和丙、乙和丙兩種情況。如果選擇甲和丙這對(duì)引物，則無(wú)論目的基因是否正確插入，擴(kuò)增的片段都是50＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果選擇乙和丙這對(duì)引物，正向連接和反向連接后所得結(jié)果不
同，所以應(yīng)選擇乙和丙這對(duì)引物進(jìn)行PCR鑒定。如果目的基因和質(zhì)粒反向連接，則引物乙會(huì)出現(xiàn)在重組質(zhì)粒的外側(cè)，此時(shí)若加入引物甲和乙，則可以擴(kuò)增出300＋100＝400(bp)的片段。
典例突破
重疊延伸PCR技術(shù)是指在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的片段重疊拼接起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。該技術(shù)在基因的定點(diǎn)突變、長(zhǎng)片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴(kuò)增等方面有著獨(dú)特的應(yīng)用。
類型三　利用PCR技術(shù)引導(dǎo)基因定點(diǎn)突變
基本模型
3.水蛭素是一種蛋白質(zhì)，可用于預(yù)防和治療血栓。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因中的特定位點(diǎn)引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG)，從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖。
典例突破
注：圖中的引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)。
(1)由以上事例可知，要對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，需要通過(guò)_________
________________來(lái)完成。
(2)若擬突變位點(diǎn)的堿基對(duì)為A－T，則需要讓其突變?yōu)開(kāi)_____________才能達(dá)到目的。引物2的突變位點(diǎn)(突起處)應(yīng)設(shè)計(jì)為_(kāi)______(假設(shè)引物為單鏈DNA)。
典例突破
改造基因
(或基因定點(diǎn)突變)
T－A或C－G
A或G
若擬突變位點(diǎn)的堿基對(duì)為A－T，則需要讓其突變?yōu)門－A或C－G，對(duì)應(yīng)的密碼子由AAU變成AAA或由AAC變成AAG，可使天冬酰胺替換為賴氨酸。
典例突破
(3)在第一階段獲得2種具有重疊片段DNA的過(guò)程中，引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制，共產(chǎn)生____種DNA分子。該階段必須將引物1、2和引物3、4置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中，這是因?yàn)開(kāi)______________________________
________________________________________。
典例突破
3
引物2和3中存在互補(bǔ)配對(duì)片段，置于同一反應(yīng)系統(tǒng)時(shí)會(huì)結(jié)合而失去作用
若兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)均進(jìn)行一次復(fù)制， 則會(huì)產(chǎn)生3種不同的DNA分子，因?yàn)橐?和4產(chǎn)生的DNA分子是一樣的。
典例突破
(4)利用重疊延伸PCR技術(shù)還可以將兩個(gè)不同來(lái)源的DNA片段拼接起來(lái)。有人想利用該技術(shù)把基因M和N拼接在一起，設(shè)計(jì)基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在設(shè)計(jì)這4種引物時(shí)，特別要注意的問(wèn)題是______________________________________________________________。
典例突破
M1、M2中的一種引物與N1、N2中的
一種引物必須具有互補(bǔ)配對(duì)的片段
重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計(jì)是重疊延伸PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵。拼接基因M和N時(shí)，設(shè)計(jì)引物時(shí)需要注意的是，需要找到兩種基因的重疊部分，即M1、M2中的一種引物與N1、N2中的一種引物必須具有互補(bǔ)配對(duì)的片段。
典例突破
利用PCR技術(shù)進(jìn)行基因擴(kuò)增時(shí)，為了便于設(shè)計(jì)引物，要求目的基因兩側(cè)的序列是已知的。當(dāng)DNA的某些序列已知，而需要擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列時(shí)，可采用反向PCR技術(shù)。
類型四　利用PCR技術(shù)擴(kuò)增未知基因序列
基本模型
4.(2020·江蘇，33節(jié)選)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoR Ⅰ酶切為例)：
典例突破
請(qǐng)據(jù)圖回答問(wèn)題：
(1)步驟Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一種________
_______________酶，它通過(guò)識(shí)別特定的____________切割特定位點(diǎn)。
限制性內(nèi)
切核酸(或限制)
核苷酸序列
(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成_____________；PCR循環(huán)中，升溫到95 ℃是為了獲得____________；Taq DNA聚合酶的作用是催化_______
_______________________。
典例突破
磷酸二酯鍵
DNA單鏈
以DNA
為模板的DNA鏈的延伸
(3)若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號(hào))。
典例突破
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
②④
典例突破
PCR過(guò)程中，根據(jù)已知的DNA序列合成兩個(gè)引物，要注意模板鏈和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能夠和相應(yīng)模板的核苷酸序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，環(huán)狀DNA圖中顯示PCR過(guò)程是從已知DNA序列的兩端分別向相反方向形成子鏈，一個(gè)引物是與已知DNA序列的第一條鏈的左端互補(bǔ)結(jié)合，向右側(cè)方向延伸形成子鏈，該引物是④，另一個(gè)引物是與已知DNA序列的第二條鏈的右端互補(bǔ)結(jié)合，向左側(cè)方向延伸形成子鏈，該引物是②。
病原體檢測(cè)是診斷和控制傳染病的重要手段，為迅速而準(zhǔn)確地確定病原體的存在和種類，發(fā)展了許多快速檢測(cè)方法。PCR技術(shù)是一種基于DNA擴(kuò)增原理的快速病原體檢測(cè)方法，它能夠在幾小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增和檢測(cè)極小量的病原體DNA，并且具備高度的特異性和敏感性。
類型五　利用PCR技術(shù)快速檢測(cè)病原體
基本模型
5.(2024·煙臺(tái)高三一模)人類猴痘由Yaba猴病毒(雙鏈DNA病毒)引起，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)可用于Yaba 猴病毒的快速檢測(cè)。進(jìn)行qPCR 時(shí)，在反應(yīng)體系加入Taq man探針，Taq man探針兩端連有熒光基團(tuán)(R)和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團(tuán)(Q)，完整的Taq man探針不發(fā)出熒光，當(dāng)探針被水解后R基團(tuán)會(huì)發(fā)出熒光(如圖所示)，隨循環(huán)次數(shù)的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度增加。
典例突破
(1)采用 qPCR 檢測(cè)Yaba 猴病毒需在一定的______溶液中才能進(jìn)行，反應(yīng)體系中還需提供DNA模板、原料、______、Taq man探針、Taq DNA聚合酶、Mg2＋等。qPCR過(guò)程中，Taq DNA 聚合酶的兩個(gè)作用是_____________
____________________。
典例突破
緩沖
引物
催化合成DNA
子鏈；催化探針?biāo)?br/>(2)qPCR檢測(cè)病毒的核酸一般具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，這與反應(yīng)體系中加入的______和______有關(guān)。但有時(shí)也可能會(huì)出現(xiàn)“假陰性”的結(jié)果。可能的原因有_________
_____________________________________________(答出兩點(diǎn))。
典例突破
引物
探針
取樣不規(guī)
范；取樣所獲樣本量不足；病毒發(fā)生了基因
突變
(3)在PCR反應(yīng)體系中一般都要加入Mg2＋，原因是____________________________。為了探究Mg2＋對(duì)PCR擴(kuò)增效果的影響，科研人員在PCR反應(yīng)體系中加入不同濃度的Mg2＋進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖所示，據(jù)此可得出的結(jié)論有_____________________________________
典例突破
TaqDNA聚合酶需要Mg2＋激活
在不含 Mg2＋的緩沖液中靶基因幾乎無(wú)法
_______________________________________________________________
_____________________。
擴(kuò)增；在不同濃度的Mg2＋緩沖液中靶基因的擴(kuò)增效果不同；在實(shí)驗(yàn)濃度下，4 mM 為最佳濃度
真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶(TaqDNA 聚合酶)都需要Mg2＋激活；分析題圖可知，⑥為陰性對(duì)照組，其熒光強(qiáng)度非常弱，意味著不加 Mg2＋的緩沖液中靶基因幾乎無(wú)法擴(kuò)增；而加了不同濃度的Mg2＋的緩沖液對(duì)應(yīng)的曲線①
②③④⑤熒光強(qiáng)度均高于⑥，且③曲線(Mg2＋濃度為4 mM)的峰值對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度最高，說(shuō)明在不同濃度的Mg2＋緩沖液中靶基因的擴(kuò)增效果不同；在實(shí)驗(yàn)濃度下，4 mM為最佳濃度。
典例突破
課時(shí)精練
一、選擇題
1.(2024·廈門高三質(zhì)檢)如圖表示 PCR 過(guò)程中某個(gè)階段反應(yīng)體系的情況，①②③④表示相關(guān)物質(zhì)，L、R 表示方向。下列敘述正確的是
A.②鏈從L到R的方向?yàn)?′→5′，
①②鏈均可作為子鏈合成的模板
B.PCR 過(guò)程需要通過(guò)解旋酶斷開(kāi)氫
鍵，且為邊解旋邊復(fù)制
C.以1個(gè)DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個(gè)引物③
D.物質(zhì)③的5′端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得該序列的雙
鏈產(chǎn)物
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根據(jù)DNA分子中兩條鏈的反向平行
關(guān)系可判斷，②鏈從L到R的方向?yàn)?br/>5′→3′，A錯(cuò)誤；
PCR過(guò)程是通過(guò)高溫將雙鏈DNA之間的氫鍵斷開(kāi)，并且是全部解旋之后才進(jìn)行復(fù)制，B錯(cuò)誤；
以1個(gè)DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為23＝8，需消耗7個(gè)引物③，C錯(cuò)誤。
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2.(2024·重慶高三質(zhì)檢)不對(duì)稱PCR是利用不等量的一對(duì)引物來(lái)產(chǎn)生大量單鏈DNA(ssDNA)的方法，如圖所示。不對(duì)稱PCR中加入的一對(duì)引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較多的被稱為非限制性引物，兩者的比例通常為1∶100，PCR反應(yīng)最初的若干次循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA(dsDNA)，但當(dāng)限制性引物消耗完后，就會(huì)產(chǎn)生大量的ssDNA。下列相關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是
A.用不對(duì)稱PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)，
不需要知道基因的全部序列
B.進(jìn)行最初若干次循環(huán)的目的是增加
模板DNA的量
C.最后大量獲得的ssDNA與圖中乙鏈
的堿基序列一致
D.因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過(guò)電泳方法將其分離
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不對(duì)稱PCR中加入的一對(duì)引物中含量較多的被稱為非限制性引物，非限制性引物是與乙鏈結(jié)合，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，C錯(cuò)誤。
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3.(2024·無(wú)錫高三模擬)重疊延伸PCR可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因誘變，其操作過(guò)程如圖所示(凸起處代表突變位點(diǎn))。下列說(shuō)法正確的是
A.過(guò)程①需要把兩對(duì)引物同時(shí)加入一
個(gè)擴(kuò)增體系以提高擴(kuò)增效率
B.過(guò)程①需要2輪PCR才能得到圖中所
示PCR產(chǎn)物
C.過(guò)程②的產(chǎn)物都可以完成延伸過(guò)程
D.若過(guò)程④得到16個(gè)突變基因則需要
消耗15個(gè)通用引物RP2
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兩種突變引物能互補(bǔ)配對(duì)，因此過(guò)程①必須分兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行，A錯(cuò)誤；
過(guò)程①至少需要3輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物，B錯(cuò)誤；過(guò)程②獲得的產(chǎn)物不都可以完成延伸過(guò)程，因?yàn)樽渔溨荒軓囊锏?′端開(kāi)始延伸，C錯(cuò)誤；
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若過(guò)程④得到16個(gè)突變基因，由于模板中不含有通用引物，則產(chǎn)生16個(gè)突變基因共需要消耗16×2－2＝30(個(gè))通用引物，而需要通用引物RP2的數(shù)量為30÷2＝15(個(gè))，D正確。
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4.反向PCR是一種通過(guò)已知序列設(shè)計(jì)引物對(duì)未知序列(圖中L、R)進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，其過(guò)程如圖所示。下列相關(guān)敘述不正確的是
A.過(guò)程①用同一種限制酶對(duì)未知序列兩端進(jìn)行切割
B.過(guò)程②需要使用DNA連接酶，形成磷酸二酯鍵
C.過(guò)程③PCR體系需要添加耐高溫的DNA聚合酶
和解旋酶
D.該技術(shù)可檢測(cè)T－DNA整合到植物染色體DNA
的位置
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過(guò)程③即PCR擴(kuò)增，PCR技術(shù)中DNA解旋是在高溫下實(shí)現(xiàn)的，不需要加入解旋酶，C錯(cuò)誤。
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5.IKK激酶參與動(dòng)物體內(nèi)免疫細(xì)胞的分化。臨床上發(fā)現(xiàn)某重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)患兒的IKKβ基因編碼區(qū)第1 183位堿基T突變?yōu)镃。為研究該患兒發(fā)病機(jī)制，研究人員應(yīng)用大引物PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)獲得突變基因，如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是
A.PCR1中使用的引物有引物A、引物C
B.PCR2中使用的引物有引物B、大引物b鏈
C.PCR1過(guò)程需要擴(kuò)增3輪才能獲得目標(biāo)產(chǎn)物
D.PCR2過(guò)程中，為減少錯(cuò)誤DNA片段的產(chǎn)生
可適當(dāng)升高復(fù)性溫度
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在PCR1中，需要兩種引物，將來(lái)在切取IKKβ基因時(shí)，在基因的左側(cè)需要用限制酶Hind Ⅲ來(lái)切割，在基因的右側(cè)用限制酶SacⅠ切割，因此在PCR1中結(jié)合到基因右端的引物選擇引物C，從題圖中看，另一個(gè)引物應(yīng)含有突變堿基C，所以選擇引物A，A正確；
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在PCR2中，有一個(gè)引物結(jié)合到了基因的左端，應(yīng)含有限制酶Hind Ⅲ識(shí)別的序列，所以要用到引物B，而另外的一個(gè)引物就是大引物中的一條鏈，它應(yīng)該結(jié)合到基因的右端，且從5′端到3′端的序列中開(kāi)始部位應(yīng)含有Sac Ⅰ識(shí)別的序列，從圖中看，它是大引物的b鏈，B正確；
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PCR1過(guò)程主要是為了獲得大引物，則擴(kuò)增2輪即可獲得目標(biāo)產(chǎn)物，C錯(cuò)誤；
由于大引物較長(zhǎng)，含C與G的堿基較多，為減少非目的基因的獲得，在PCR2復(fù)性過(guò)程中應(yīng)適當(dāng)提高溫度，便于引物與模板鏈的結(jié)合，D正確。
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6.(2024·安順高三調(diào)研)熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測(cè)樣本中DNA含量，用于病毒檢測(cè)。其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時(shí)，加入與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針。當(dāng)耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會(huì)水解探針，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成(如圖)。通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，可得Ct值(熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù))。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是
A.PCR每個(gè)循環(huán)包括變性、復(fù)性(引物和模板結(jié)
合)、延伸3個(gè)階段
B.耐高溫的DNA聚合酶在該反應(yīng)中的作用是形
成磷酸二酯鍵
C.最終監(jiān)測(cè)的熒光強(qiáng)度與起始時(shí)反應(yīng)管內(nèi)樣本
DNA的含量呈正相關(guān)
D.Ct值越大表示被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越多，患者危險(xiǎn)性更高
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Ct值越小，說(shuō)明所需循環(huán)的次數(shù)越少，被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越多，D錯(cuò)誤。
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7.(2024·襄陽(yáng)高三模擬)通過(guò)設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)誘變。如圖為基因工程中獲取突變基因的過(guò)程，其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段配對(duì)，但不影響引物與模板鏈的整體配對(duì)，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5′端分別設(shè)計(jì)增加限制酶a和限制酶b的識(shí)別位點(diǎn)。下列有關(guān)敘述不正確的是
A.引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)有利于目的
基因定向插入
B.復(fù)性溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致引物不能與模板牢固結(jié)
合，PCR擴(kuò)增效率下降
C.第3輪PCR，引物1能與圖中②結(jié)合并且形成
兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因
D.第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等
長(zhǎng)的DNA占1/2
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√
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引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)，可以配合載體的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，幫助目的基因定向插入載體，避免發(fā)生自身連接，A正確；
PCR技術(shù)中，復(fù)性溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致引物不能與互補(bǔ)DNA鏈(模板)牢固結(jié)合，PCR擴(kuò)增效率下降，B正確；
第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA有1個(gè)，而子代DNA有23＝8(個(gè))，故含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA占1/8，D錯(cuò)誤。
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8.(2024·南通高三調(diào)研)如圖是被農(nóng)桿菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者將其連接成環(huán)，并以此環(huán)為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出T－DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，據(jù)此來(lái)確定T－DNA插入的具體位置。下列有關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是
A.農(nóng)桿菌在自然條件下主
要侵染雙子葉植物和裸
子植物，T－DNA存在于其Ti質(zhì)粒上
B.利用圖中的引物②③組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列
C.若擴(kuò)增循環(huán)n次，需要2n＋1－2個(gè)引物
D.將擴(kuò)增出的未知序列與水稻基因組序列比對(duì)可確定T－DNA的插入位置
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√
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農(nóng)桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力，A正確；
耐高溫的DNA聚合酶可在引物的3′端延伸子鏈，因此利用圖中的引物①④組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列，B錯(cuò)誤；
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擴(kuò)增循環(huán)n次，得到2n個(gè)DNA分子，總單鏈數(shù)為2×2n即2n＋1條，只有最初的2條母鏈不需要引物，因此共需要2n＋1－2個(gè)引物，C正確；
不同的DNA分子或DNA區(qū)段具有特異性，將擴(kuò)增出的未知序列與水稻基因組序列比對(duì)可確定T－DNA的插入位置，D正確。
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9.實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR技術(shù)需要在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加熒光染料或熒光探針，熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈中，從而發(fā)出熒光信號(hào)。在流感流行季節(jié)，對(duì)懷疑流感病毒感染的患者，可以通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR技術(shù)進(jìn)行核酸檢測(cè)。下列相關(guān)敘述不正確的是
A.圖中的探針可能是利用熒光分子標(biāo)記的流感
病毒獨(dú)特的基因序列
B.核酸檢測(cè)是通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)確定樣本中
是否有病毒核酸的
C.PCR技術(shù)利用了DNA雙鏈復(fù)制的原理，需要
解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶的催化
D.用熒光RT－PCR技術(shù)測(cè)定病毒的核酸具有特異性
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√
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PCR技術(shù)利用了DNA雙鏈復(fù)制的原理，不需要解旋酶，可通過(guò)高溫使DNA雙鏈解開(kāi)，但需要耐高溫的DNA聚合酶的催化，C錯(cuò)誤。
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二、非選擇題
10.(2023·江蘇，22節(jié)選)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)，運(yùn)用重組酶技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1
所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
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(1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)，配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有______________，擴(kuò)增程序中最主要的不同是______
______。
模板、引物
引物的
設(shè)計(jì)
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PCR反應(yīng)進(jìn)行的條件：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2＋)。分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)， 配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR過(guò)
程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3′端通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。引物設(shè)計(jì)是決定PCR反應(yīng)成敗的最主要因素。
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(2)將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。這一過(guò)程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程相比，無(wú)需使用的酶主要有_______________________。
限制酶、(T4)DNA連接酶
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傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建需要使用限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)切割質(zhì)粒，使其具有與目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接成重組質(zhì)粒。將PCR產(chǎn)物片段與
線性質(zhì)粒載體混合后，在DNA連接酶的作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，不需要使用限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)。
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(3)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯(cuò)誤的有_______。
A.稀釋涂布平板需控制每個(gè)平
板30～300個(gè)菌落
B.抗性平板上未長(zhǎng)出菌落的原
因一般是培養(yǎng)基溫度太高
C.抗性平板上常常會(huì)出現(xiàn)大量
雜菌形成的菌落
D.抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落無(wú)需進(jìn)一步劃線純化
ABC
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用稀釋涂布平板法培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)，為了使結(jié)果更準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)為30～300的平板，A錯(cuò)誤；
培養(yǎng)基冷卻后才接種，故抗性平板上未長(zhǎng)出菌落不是因?yàn)榕囵B(yǎng)基溫度太高，B錯(cuò)誤；
轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，一般含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能發(fā)展為菌落，故不會(huì)出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落，C錯(cuò)誤；
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稀釋涂布平板法和平板劃線法均為分離純化細(xì)菌的方法，用稀釋涂布平板法接種后在抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落無(wú)需進(jìn)一步劃線純化，D正確。
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(4)為了驗(yàn)證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設(shè)計(jì)，用不同菌落的質(zhì)粒為模板、用引物F1－F和F2－R進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，質(zhì)粒P1～P4的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2。根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有________。
P3、P4
EGFP為720 bp，AnB1為390 bp，二者的總大小為720＋390＝
1 100(bp)，用引物F1－F和F2－R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其大小接近于P1、P2，根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有P3、P4。
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(5)對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過(guò)基因測(cè)序確認(rèn)，原因是_____
___________________________________________________________________。
電泳
只能檢測(cè)DNA分子的大小(長(zhǎng)度)，無(wú)法確定待檢測(cè)DNA分子的堿基序列
瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)僅能用于分析待檢測(cè)DNA分子的大小，無(wú)法確定待檢測(cè)DNA分子的堿基序列，因此對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過(guò)基因測(cè)序確認(rèn)。
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11.基因工程在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用發(fā)展迅速，我國(guó)轉(zhuǎn)基因作物的種植面積在世界有較高排名。請(qǐng)回答下列相關(guān)問(wèn)題：
(1)目的基因的篩選與獲取是基因工程的第一步。為提高機(jī)會(huì)和可能，目的基因往往從相關(guān)的______________________的基因中進(jìn)行篩選。
已知結(jié)構(gòu)和功能清晰
(2)目的基因可以人工合成、從基因文庫(kù)中獲取，還可以利用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增。如圖1展示了PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增目的基因的原理，請(qǐng)分析回答下列問(wèn)題：
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7
①PCR技術(shù)利用了DNA半保留復(fù)制原理和______________原理。PCR的一次循環(huán)包括變性、復(fù)性和延伸三個(gè)過(guò)程，復(fù)性的作用是_____________
__________________________。
②將一個(gè)DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，理論上目的基因最早在第____次循環(huán)后獲得；第5次循環(huán)后，可擴(kuò)增得到______個(gè)目的基因。
堿基互補(bǔ)配對(duì)
使引物通過(guò)堿
基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈結(jié)合
3
22
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(3)反向PCR可用于擴(kuò)增未知序列，其原理如圖所示。圖中鏈狀DNA分子內(nèi)側(cè)是已知序列，外側(cè)為未知序列。請(qǐng)回答相關(guān)問(wèn)題：
①EcoR Ⅰ酶切后得到的—AATT稱為黏性末端，“黏性”的含義是___________________
_________________________，EcoR Ⅰ切割得到黏性末端的原
兩個(gè)末端互補(bǔ)的堿基
之間可以自發(fā)形成氫鍵
因是_________________________________。
切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中心軸線兩側(cè)
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7
②不直接在圖2中DNA分子的兩端設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增，原因是_______________________
__________。
DNA兩端序列未知，無(wú)法
設(shè)計(jì)引物
③圖4中環(huán)狀DNA進(jìn)行PCR的過(guò)程中，沿引物A延伸子鏈的延伸方向是_______(填“順時(shí)針”或“逆時(shí)針”)，PCR產(chǎn)物______(填“含有”或“不含”)EcoR Ⅰ的酶切位點(diǎn)。
逆時(shí)針
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含有
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2
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12.(2024·湖北華中師大附中高三模擬)幽門螺桿菌是一種常見(jiàn)的人類致病菌，其骨架蛋白MreB通過(guò)影響脲酶活性而參與調(diào)控其致病性。為了更準(zhǔn)確地分離出MreB蛋白，用重疊延伸PCR技術(shù)(指在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的片段重疊拼接起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù))，將幽門螺桿菌MreB基因中編碼終止密碼子前的DNA序列與TAP標(biāo)簽(可以標(biāo)記幽門螺桿菌基因組中任何一個(gè)基因，且不會(huì)影響基因的表達(dá))進(jìn)行連接，構(gòu)建了融合表達(dá)蛋白MreB和TAP標(biāo)簽的質(zhì)粒，
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實(shí)驗(yàn)流程如圖所示。據(jù)圖回答下列問(wèn)題：
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7
(1)重疊PCR獲得帶有標(biāo)簽的MreB基因
①獲得兩種具有重疊片段DNA的過(guò)程中，PCR1和PCR2必須在不同的反應(yīng)體系中，原因是_______________________________________________
__________________________________。
引物2和引物3中存在互補(bǔ)配對(duì)的片段，置于同一反應(yīng)
體系時(shí)，它們會(huì)發(fā)生結(jié)合而失去作用
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重疊延伸PCR技術(shù)是指在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的片段重疊拼接起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，引物2和引物3中存在互補(bǔ)配對(duì)的片段，置于同一反應(yīng)體系時(shí)，它們會(huì)發(fā)生結(jié)合而失去作用。
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②PCR3反應(yīng)體系中所加入的引物是______________。
引物1、引物4
分析題意可知，PCR3是為了獲得帶有標(biāo)簽的MreB基因，所以應(yīng)選擇引物1和引物4。
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(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
①為將帶有標(biāo)簽的MreB基因定向插入到pK18mobSacB質(zhì)粒中，需要在引物末端添加限制酶識(shí)別序列，據(jù)圖分析，在引物1添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是________，在引物
SmaⅠ
4添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是_______。經(jīng)過(guò)這兩種酶酶切的帶有標(biāo)簽的MreB基因和pK18mobSacB質(zhì)粒進(jìn)行連接時(shí)，可選用______________
(填“E.coli DNA連接酶”或“T4 DNA連接酶”)。
XhoⅠ
T4 DNA連接酶
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要將帶有標(biāo)簽的MreB基因定向插入到pK18mobSacB質(zhì)粒中的啟動(dòng)子與終止子之間，EcoR Ⅰ在啟動(dòng)子兩側(cè)均有其切割位點(diǎn)，因此不能選擇EcoRⅠ，在引物1添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶只能是SmaⅠ，在引物4添加的序
列所對(duì)應(yīng)的限制酶只能是XhoⅠ；SmaⅠ切割后產(chǎn)生平末端，經(jīng)過(guò)這兩種酶酶切的帶有標(biāo)簽的MreB基因和pK18mobSacB質(zhì)粒進(jìn)行連接時(shí)應(yīng)選擇T4 DNA連接酶。
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②重組質(zhì)粒中，KmR基因的作用是________________________________
_________________________________。
鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)
重組質(zhì)粒中，KmR基因是標(biāo)記基因，其作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。
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12專題突破10　綜合PCR的基因工程問(wèn)題
課標(biāo)要求 闡述常規(guī)PCR、重疊延伸PCR、熒光定量PCR等的過(guò)程與原理，舉例說(shuō)明不同的PCR技術(shù)有著不同的應(yīng)用。
考情分析 幾種不同PCR的應(yīng)用 2023·江蘇·T22　2023·山東·T25　2022·江蘇·T24　2022·山東·T25 2021·全國(guó)甲·T38　2021·山東·T25　2020·北京·T12　2020·江蘇·T33
　　　　　　　　　　　　　　　　
類型一　利用PCR技術(shù)獲取目的基因
基本模型
獲取目的基因是基因工程操作的第一步。獲取目的基因的方法有多種，現(xiàn)在常用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因。PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫。它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。該技術(shù)由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
典例突破
1．“X基因”是DNA分子上一個(gè)有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖1所示。下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．第一輪復(fù)制得到2個(gè)DNA分子，即①②各一個(gè)
B．第二輪復(fù)制得到4個(gè)DNA分子，即①②③④各一個(gè)
C．第四輪復(fù)制得到16個(gè)DNA分子，其中有4個(gè)X基因
D．經(jīng)五輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子
答案　C
解析　據(jù)圖分析可知，第一輪復(fù)制形成2個(gè)DNA分子，即①②各一個(gè)，A正確；第二輪復(fù)制得到22＝4(個(gè))DNA分子，即①?gòu)?fù)制得①和③、②復(fù)制得②和④，即得到①②③④各一個(gè)，B正確；第四輪復(fù)制得到16個(gè)DNA分子，其中有8個(gè)⑤(X基因)，C錯(cuò)誤；經(jīng)五輪循環(huán)后共形成32個(gè)DNA分子，其中①②各一個(gè)，③④各四個(gè)，22個(gè)⑤，故產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子，D正確。
類型二　利用PCR技術(shù)鑒定目的基因的連接方式
基本模型
檢測(cè)目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)是否穩(wěn)定存在是基因工程操作的重要步驟，可以借助載體上的標(biāo)記基因、PCR技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)等方法鑒定受體細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)入了目的基因。在實(shí)際操作中，PCR技術(shù)不僅可以精準(zhǔn)地鑒定受體細(xì)胞是否轉(zhuǎn)入目的基因，還可以通過(guò)引物的巧妙設(shè)計(jì)鑒定目的基因的連接方式。
典例突破
2．(2019·江蘇，33節(jié)選)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是________。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400 bp片段，原因是____________________。
答案　乙、丙　目的基因反向連接
解析　分析題圖可知，理論上可以選擇的引物組合有甲和丙、乙和丙兩種情況。如果選擇甲和丙這對(duì)引物，則無(wú)論目的基因是否正確插入，擴(kuò)增的片段都是50＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果選擇乙和丙這對(duì)引物，正向連接和反向連接后所得結(jié)果不同，所以應(yīng)選擇乙和丙這對(duì)引物進(jìn)行PCR鑒定。如果目的基因和質(zhì)粒反向連接，則引物乙會(huì)出現(xiàn)在重組質(zhì)粒的外側(cè)，此時(shí)若加入引物甲和乙，則可以擴(kuò)增出300＋100＝400(bp)的片段。
類型三　利用PCR技術(shù)引導(dǎo)基因定點(diǎn)突變
基本模型
重疊延伸PCR技術(shù)是指在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的片段重疊拼接起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。該技術(shù)在基因的定點(diǎn)突變、長(zhǎng)片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴(kuò)增等方面有著獨(dú)特的應(yīng)用。
典例突破
3．水蛭素是一種蛋白質(zhì)，可用于預(yù)防和治療血栓。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因中的特定位點(diǎn)引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG)，從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖。
注：圖中的引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)。
(1)由以上事例可知，要對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，需要通過(guò)________________來(lái)完成。
(2)若擬突變位點(diǎn)的堿基對(duì)為A－T，則需要讓其突變?yōu)開(kāi)_____________才能達(dá)到目的。引物2的突變位點(diǎn)(突起處)應(yīng)設(shè)計(jì)為_(kāi)_____________(假設(shè)引物為單鏈DNA)。
(3)在第一階段獲得2種具有重疊片段DNA的過(guò)程中，引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制，共產(chǎn)生____種DNA分子。該階段必須將引物1、2和引物3、4置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中，這是因?yàn)開(kāi)______________________________
______________________________________________________________________________。
(4)利用重疊延伸PCR技術(shù)還可以將兩個(gè)不同來(lái)源的DNA片段拼接起來(lái)。有人想利用該技術(shù)把基因M和N拼接在一起，設(shè)計(jì)基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在設(shè)計(jì)這4種引物時(shí)，特別要注意的問(wèn)題是__________________________________________________
______________________________________________________________________________。
答案　(1)改造基因(或基因定點(diǎn)突變)　(2)T－A或C－G　A或G　(3)3　引物2和3中存在互補(bǔ)配對(duì)片段，置于同一反應(yīng)系統(tǒng)時(shí)會(huì)結(jié)合而失去作用
(4)M1、M2中的一種引物與N1、N2中的一種引物必須具有互補(bǔ)配對(duì)的片段
解析　(2)若擬突變位點(diǎn)的堿基對(duì)為A－T，則需要讓其突變?yōu)門－A或C－G，對(duì)應(yīng)的密碼子由AAU變成AAA或由AAC變成AAG，可使天冬酰胺替換為賴氨酸。(3)若兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)均進(jìn)行一次復(fù)制， 則會(huì)產(chǎn)生3種不同的DNA分子，因?yàn)橐?和4產(chǎn)生的DNA分子是一樣的。(4)重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計(jì)是重疊延伸PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵。拼接基因M和N時(shí)，設(shè)計(jì)引物時(shí)需要注意的是，需要找到兩種基因的重疊部分，即M1、M2中的一種引物與N1、N2中的一種引物必須具有互補(bǔ)配對(duì)的片段。
類型四　利用PCR技術(shù)擴(kuò)增未知基因序列
基本模型
利用PCR技術(shù)進(jìn)行基因擴(kuò)增時(shí)，為了便于設(shè)計(jì)引物，要求目的基因兩側(cè)的序列是已知的。當(dāng)DNA的某些序列已知，而需要擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列時(shí)，可采用反向PCR技術(shù)。
典例突破
4．(2020·江蘇，33節(jié)選)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoR Ⅰ酶切為例)：
請(qǐng)據(jù)圖回答問(wèn)題：
(1)步驟Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一種________________酶，它通過(guò)識(shí)別特定的________________切割特定位點(diǎn)。
(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成________________；PCR循環(huán)中，升溫到95 ℃是為了獲得____________；Taq DNA聚合酶的作用是催化
________________________________________________________________________。
(3)若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號(hào))。
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
答案　(1)限制性內(nèi)切核酸(或限制)　核苷酸序列
(2)磷酸二酯鍵　DNA單鏈　以DNA為模板的DNA鏈的延伸　(3)②④
解析　(3)PCR過(guò)程中，根據(jù)已知的DNA序列合成兩個(gè)引物，要注意模板鏈和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能夠和相應(yīng)模板的核苷酸序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，環(huán)狀DNA圖中顯示PCR過(guò)程是從已知DNA序列的兩端分別向相反方向形成子鏈，一個(gè)引物是與已知DNA序列的第一條鏈的左端互補(bǔ)結(jié)合，向右側(cè)方向延伸形成子鏈，該引物是④，另一個(gè)引物是與已知DNA序列的第二條鏈的右端互補(bǔ)結(jié)合，向左側(cè)方向延伸形成子鏈，該引物是②。
類型五　利用PCR技術(shù)快速檢測(cè)病原體
基本模型
病原體檢測(cè)是診斷和控制傳染病的重要手段，為迅速而準(zhǔn)確地確定病原體的存在和種類，發(fā)展了許多快速檢測(cè)方法。PCR技術(shù)是一種基于DNA擴(kuò)增原理的快速病原體檢測(cè)方法，它能夠在幾小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增和檢測(cè)極小量的病原體DNA，并且具備高度的特異性和敏感性。
典例突破
5．(2024·煙臺(tái)高三一模)人類猴痘由Yaba猴病毒(雙鏈DNA病毒)引起，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)可用于Yaba 猴病毒的快速檢測(cè)。進(jìn)行qPCR 時(shí)，在反應(yīng)體系加入 Taq man探針，Taq man探針兩端連有熒光基團(tuán)(R)和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團(tuán)(Q)，完整的Taq man探針不發(fā)出熒光，當(dāng)探針被水解后R基團(tuán)會(huì)發(fā)出熒光(如圖所示)，隨循環(huán)次數(shù)的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度增加。
(1)采用 qPCR 檢測(cè)Yaba 猴病毒需在一定的__________溶液中才能進(jìn)行，反應(yīng)體系中還需提供DNA模板、原料、__________、Taq man探針、Taq DNA聚合酶、Mg2＋等。qPCR過(guò)程中，Taq DNA 聚合酶的兩個(gè)作用是____________________________________________________。
(2)qPCR檢測(cè)病毒的核酸一般具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，這與反應(yīng)體系中加入的__________和__________有關(guān)。但有時(shí)也可能會(huì)出現(xiàn)“假陰性”的結(jié)果。可能的原因有______________________________________________________________________________
____________________________________________________________________(答出兩點(diǎn))。
(3)在PCR反應(yīng)體系中一般都要加入Mg2＋，原因是____________________________。為了探究Mg2＋對(duì)PCR擴(kuò)增效果的影響，科研人員在PCR反應(yīng)體系中加入不同濃度的Mg2＋進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖所示，據(jù)此可得出的結(jié)論有_______________________________________
______________________________________________________________________________。
答案　(1)緩沖　引物　催化合成DNA子鏈；催化探針?biāo)狻?2)引物　探針　取樣不規(guī)范；取樣所獲樣本量不足；病毒發(fā)生了基因突變　(3)TaqDNA聚合酶需要Mg2＋激活　在不含 Mg2＋的緩沖液中靶基因幾乎無(wú)法擴(kuò)增；在不同濃度的Mg2＋緩沖液中靶基因的擴(kuò)增效果不同；在實(shí)驗(yàn)濃度下，4 mM 為最佳濃度
解析　(3)真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶(TaqDNA 聚合酶)都需要Mg2＋激活；分析題圖可知，⑥為陰性對(duì)照組，其熒光強(qiáng)度非常弱，意味著不加 Mg2＋的緩沖液中靶基因幾乎無(wú)法擴(kuò)增；而加了不同濃度的Mg2＋的緩沖液對(duì)應(yīng)的曲線①②③④⑤熒光強(qiáng)度均高于⑥，且③曲線(Mg2＋濃度為4 mM)的峰值對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度最高，說(shuō)明在不同濃度的Mg2＋緩沖液中靶基因的擴(kuò)增效果不同；在實(shí)驗(yàn)濃度下，4 mM為最佳濃度。
課時(shí)精練
一、選擇題
1．(2024·廈門高三質(zhì)檢)如圖表示 PCR 過(guò)程中某個(gè)階段反應(yīng)體系的情況，①②③④表示相關(guān)物質(zhì)，L、R 表示方向。下列敘述正確的是(　　)
A．②鏈從L到R的方向?yàn)?′→5′，①②鏈均可作為子鏈合成的模板
B．PCR 過(guò)程需要通過(guò)解旋酶斷開(kāi)氫鍵，且為邊解旋邊復(fù)制
C．以1個(gè)DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個(gè)引物③
D．物質(zhì)③的5′端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得該序列的雙鏈產(chǎn)物
答案　D
解析　根據(jù)DNA分子中兩條鏈的反向平行關(guān)系可判斷，②鏈從L到R的方向?yàn)?′→3′，A錯(cuò)誤；PCR過(guò)程是通過(guò)高溫將雙鏈DNA之間的氫鍵斷開(kāi)，并且是全部解旋之后才進(jìn)行復(fù)制，B錯(cuò)誤；以1個(gè)DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為23＝8，需消耗7個(gè)引物③，C錯(cuò)誤。
2．(2024·重慶高三質(zhì)檢)不對(duì)稱PCR是利用不等量的一對(duì)引物來(lái)產(chǎn)生大量單鏈DNA(ssDNA)的方法，如圖所示。不對(duì)稱PCR中加入的一對(duì)引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較多的被稱為非限制性引物，兩者的比例通常為1∶100，PCR反應(yīng)最初的若干次循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA(dsDNA)，但當(dāng)限制性引物消耗完后，就會(huì)產(chǎn)生大量的ssDNA。下列相關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是(　　)
A．用不對(duì)稱PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)，不需要知道基因的全部序列
B．進(jìn)行最初若干次循環(huán)的目的是增加模板DNA的量
C．最后大量獲得的ssDNA與圖中乙鏈的堿基序列一致
D．因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過(guò)電泳方法將其分離
答案　C
解析　不對(duì)稱PCR中加入的一對(duì)引物中含量較多的被稱為非限制性引物，非限制性引物是與乙鏈結(jié)合，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，C錯(cuò)誤。
3．(2024·無(wú)錫高三模擬)重疊延伸PCR可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因誘變，其操作過(guò)程如圖所示(凸起處代表突變位點(diǎn))。下列說(shuō)法正確的是(　　)
A．過(guò)程①需要把兩對(duì)引物同時(shí)加入一個(gè)擴(kuò)增體系以提高擴(kuò)增效率
B．過(guò)程①需要2輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物
C．過(guò)程②的產(chǎn)物都可以完成延伸過(guò)程
D．若過(guò)程④得到16個(gè)突變基因則需要消耗15個(gè)通用引物RP2
答案　D
解析　兩種突變引物能互補(bǔ)配對(duì)，因此過(guò)程①必須分兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行，A錯(cuò)誤；過(guò)程①至少需要3輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物，B錯(cuò)誤；過(guò)程②獲得的產(chǎn)物不都可以完成延伸過(guò)程，因?yàn)樽渔溨荒軓囊锏?′端開(kāi)始延伸，C錯(cuò)誤；若過(guò)程④得到16個(gè)突變基因，由于模板中不含有通用引物，則產(chǎn)生16個(gè)突變基因共需要消耗16×2－2＝30(個(gè))通用引物，而需要通用引物RP2的數(shù)量為30÷2＝15(個(gè))，D正確。
4．反向PCR是一種通過(guò)已知序列設(shè)計(jì)引物對(duì)未知序列(圖中L、R)進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，其過(guò)程如圖所示。下列相關(guān)敘述不正確的是(　　)
A．過(guò)程①用同一種限制酶對(duì)未知序列兩端進(jìn)行切割
B．過(guò)程②需要使用DNA連接酶，形成磷酸二酯鍵
C．過(guò)程③PCR體系需要添加耐高溫的DNA聚合酶和解旋酶
D．該技術(shù)可檢測(cè)T－DNA整合到植物染色體DNA的位置
答案　C
解析　過(guò)程③即PCR擴(kuò)增，PCR技術(shù)中DNA解旋是在高溫下實(shí)現(xiàn)的，不需要加入解旋酶，C錯(cuò)誤。
5．IKK激酶參與動(dòng)物體內(nèi)免疫細(xì)胞的分化。臨床上發(fā)現(xiàn)某重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)患兒的IKKβ基因編碼區(qū)第1 183位堿基T突變?yōu)镃。為研究該患兒發(fā)病機(jī)制，研究人員應(yīng)用大引物PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)獲得突變基因，如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是(　　)
A．PCR1中使用的引物有引物A、引物C
B．PCR2中使用的引物有引物B、大引物b鏈
C．PCR1過(guò)程需要擴(kuò)增3輪才能獲得目標(biāo)產(chǎn)物
D．PCR2過(guò)程中，為減少錯(cuò)誤DNA片段的產(chǎn)生可適當(dāng)升高復(fù)性溫度
答案　C
解析　在PCR1中，需要兩種引物，將來(lái)在切取IKKβ基因時(shí)，在基因的左側(cè)需要用限制酶Hind Ⅲ來(lái)切割，在基因的右側(cè)用限制酶Sac Ⅰ切割，因此在PCR1中結(jié)合到基因右端的引物選擇引物C，從題圖中看，另一個(gè)引物應(yīng)含有突變堿基C，所以選擇引物A，A正確；在PCR2中，有一個(gè)引物結(jié)合到了基因的左端，應(yīng)含有限制酶Hind Ⅲ識(shí)別的序列，所以要用到引物B，而另外的一個(gè)引物就是大引物中的一條鏈，它應(yīng)該結(jié)合到基因的右端，且從5′端到3′端的序列中開(kāi)始部位應(yīng)含有Sac Ⅰ識(shí)別的序列，從圖中看，它是大引物的b鏈，B正確；PCR1過(guò)程主要是為了獲得大引物，則擴(kuò)增2輪即可獲得目標(biāo)產(chǎn)物，C錯(cuò)誤；由于大引物較長(zhǎng)，含C與G的堿基較多，為減少非目的基因的獲得，在PCR2復(fù)性過(guò)程中應(yīng)適當(dāng)提高溫度，便于引物與模板鏈的結(jié)合，D正確。
6.(2024·安順高三調(diào)研)熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測(cè)樣本中DNA含量，用于病毒檢測(cè)。其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時(shí)，加入與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針。當(dāng)耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會(huì)水解探針，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成(如圖)。通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，可得Ct值(熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù))。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．PCR每個(gè)循環(huán)包括變性、復(fù)性(引物和模板結(jié)合)、延伸3個(gè)階段
B．耐高溫的DNA聚合酶在該反應(yīng)中的作用是形成磷酸二酯鍵
C．最終監(jiān)測(cè)的熒光強(qiáng)度與起始時(shí)反應(yīng)管內(nèi)樣本DNA的含量呈正相關(guān)
D．Ct值越大表示被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越多，患者危險(xiǎn)性更高
答案　D
解析　Ct值越小，說(shuō)明所需循環(huán)的次數(shù)越少，被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越多，D錯(cuò)誤。
7．(2024·襄陽(yáng)高三模擬)通過(guò)設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)誘變。如圖為基因工程中獲取突變基因的過(guò)程，其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段配對(duì)，但不影響引物與模板鏈的整體配對(duì)，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5′端分別設(shè)計(jì)增加限制酶a和限制酶b的識(shí)別位點(diǎn)。下列有關(guān)敘述不正確的是(　　)
A．引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)有利于目的基因定向插入
B．復(fù)性溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致引物不能與模板牢固結(jié)合，PCR擴(kuò)增效率下降
C．第3輪PCR，引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因
D．第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA占1/2
答案　D
解析　引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)，可以配合載體的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，幫助目的基因定向插入載體，避免發(fā)生自身連接，A正確；PCR技術(shù)中，復(fù)性溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致引物不能與互補(bǔ)DNA鏈(模板)牢固結(jié)合，PCR擴(kuò)增效率下降，B正確；第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA有1個(gè)，而子代DNA有23＝8(個(gè))，故含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA占1/8，D錯(cuò)誤。
8．(2024·南通高三調(diào)研)如圖是被農(nóng)桿菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者將其連接成環(huán)，并以此環(huán)為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出T－DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，據(jù)此來(lái)確定T－DNA插入的具體位置。下列有關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是(　　)
A．農(nóng)桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，T－DNA存在于其Ti質(zhì)粒上
B．利用圖中的引物②③組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列
C．若擴(kuò)增循環(huán)n次，需要2n＋1－2個(gè)引物
D．將擴(kuò)增出的未知序列與水稻基因組序列比對(duì)可確定T－DNA的插入位置
答案　B
解析　農(nóng)桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力，A正確；耐高溫的DNA聚合酶可在引物的3′端延伸子鏈，因此利用圖中的引物①④組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列，B錯(cuò)誤；擴(kuò)增循環(huán)n次，得到2n個(gè)DNA分子，總單鏈數(shù)為2×2n即2n＋1條，只有最初的2條母鏈不需要引物，因此共需要2n＋1－2個(gè)引物，C正確；不同的DNA分子或DNA區(qū)段具有特異性，將擴(kuò)增出的未知序列與水稻基因組序列比對(duì)可確定T－DNA的插入位置，D正確。
9．實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR技術(shù)需要在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加熒光染料或熒光探針，熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈中，從而發(fā)出熒光信號(hào)。在流感流行季節(jié)，對(duì)懷疑流感病毒感染的患者，可以通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR技術(shù)進(jìn)行核酸檢測(cè)。下列相關(guān)敘述不正確的是(　　)
A．圖中的探針可能是利用熒光分子標(biāo)記的流感病毒獨(dú)特的基因序列
B．核酸檢測(cè)是通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)確定樣本中是否有病毒核酸的
C．PCR技術(shù)利用了DNA雙鏈復(fù)制的原理，需要解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶的催化
D．用熒光RT－PCR技術(shù)測(cè)定病毒的核酸具有特異性
答案　C
解析　PCR技術(shù)利用了DNA雙鏈復(fù)制的原理，不需要解旋酶，可通過(guò)高溫使DNA雙鏈解開(kāi)，但需要耐高溫的DNA聚合酶的催化，C錯(cuò)誤。
二、非選擇題
10．(2023·江蘇，22節(jié)選)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)，運(yùn)用重組酶技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
(1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)，配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有______________，擴(kuò)增程序中最主要的不同是________________。
(2)將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。這一過(guò)程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程相比，無(wú)需使用的酶主要有__________________。
(3)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯(cuò)誤的有______________。
A．稀釋涂布平板需控制每個(gè)平板30～300個(gè)菌落
B．抗性平板上未長(zhǎng)出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高
C．抗性平板上常常會(huì)出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落
D．抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落無(wú)需進(jìn)一步劃線純化
(4)為了驗(yàn)證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設(shè)計(jì)，用不同菌落的質(zhì)粒為模板、用引物F1－F和F2－R進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，質(zhì)粒P1～P4的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2。根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有________。
(5)對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過(guò)基因測(cè)序確認(rèn)，原因是____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________。
答案　(1)模板、引物　引物的設(shè)計(jì)　(2)限制酶、(T4)DNA連接酶　(3)ABC　(4)P3、P4　(5)電泳只能檢測(cè)DNA分子的大小(長(zhǎng)度)，無(wú)法確定待檢測(cè)DNA分子的堿基序列
解析　(1)PCR反應(yīng)進(jìn)行的條件：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2＋)。分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)， 配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR過(guò)程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3′端通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。引物設(shè)計(jì)是決定PCR反應(yīng)成敗的最主要因素。(2)傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建需要使用限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)切割質(zhì)粒，使其具有與目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接成重組質(zhì)粒。將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在DNA連接酶的作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，不需要使用限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)。(3)用稀釋涂布平板法培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)，為了使結(jié)果更準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)為30～300的平板，A錯(cuò)誤；培養(yǎng)基冷卻后才接種，故抗性平板上未長(zhǎng)出菌落不是因?yàn)榕囵B(yǎng)基溫度太高，B錯(cuò)誤；轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，一般含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能發(fā)展為菌落，故不會(huì)出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落，C錯(cuò)誤；稀釋涂布平板法和平板劃線法均為分離純化細(xì)菌的方法，用稀釋涂布平板法接種后在抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落無(wú)需進(jìn)一步劃線純化，D正確。(4)EGFP為720 bp，AnB1為390 bp，二者的總大小為720＋390＝1 100(bp)，用引物F1－F和F2－R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其大小接近于P1、P2，根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有P3、P4。(5)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)僅能用于分析待檢測(cè)DNA分子的大小，無(wú)法確定待檢測(cè)DNA分子的堿基序列，因此對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過(guò)基因測(cè)序確認(rèn)。
11．基因工程在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用發(fā)展迅速，我國(guó)轉(zhuǎn)基因作物的種植面積在世界有較高排名。請(qǐng)回答下列相關(guān)問(wèn)題：
(1)目的基因的篩選與獲取是基因工程的第一步。為提高機(jī)會(huì)和可能，目的基因往往從相關(guān)的______________________的基因中進(jìn)行篩選。
(2)目的基因可以人工合成、從基因文庫(kù)中獲取，還可以利用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增。如圖1展示了PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增目的基因的原理，請(qǐng)分析回答下列問(wèn)題：
①PCR技術(shù)利用了DNA半保留復(fù)制原理和______________原理。PCR的一次循環(huán)包括變性、復(fù)性和延伸三個(gè)過(guò)程，復(fù)性的作用是____________________________。
②將一個(gè)DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，理論上目的基因最早在第______次循環(huán)后獲得；第5次循環(huán)后，可擴(kuò)增得到______個(gè)目的基因。
(3)反向PCR可用于擴(kuò)增未知序列，其原理如圖所示。圖中鏈狀DNA分子內(nèi)側(cè)是已知序列，外側(cè)為未知序列。請(qǐng)回答相關(guān)問(wèn)題：
①EcoR Ⅰ酶切后得到的—AATT稱為黏性末端，“黏性”的含義是____________，EcoR Ⅰ切割得到黏性末端的原因是_______________________________________________________
______________________________________________________________________________。
②不直接在圖2中DNA分子的兩端設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增，原因是_______________________。
③圖4中環(huán)狀DNA進(jìn)行PCR的過(guò)程中，沿引物A延伸子鏈的延伸方向是______(填“順時(shí)針”或“逆時(shí)針”)，PCR產(chǎn)物______(填“含有”或“不含”)EcoR Ⅰ的酶切位點(diǎn)。
答案　(1)已知結(jié)構(gòu)和功能清晰　(2)①堿基互補(bǔ)配對(duì)　使引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈結(jié)合　②3　22　(3)①兩個(gè)末端互補(bǔ)的堿基之間可以自發(fā)形成氫鍵　切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中心軸線兩側(cè)　②DNA兩端序列未知，無(wú)法設(shè)計(jì)引物　③逆時(shí)針　含有
12．(2024·湖北華中師大附中高三模擬)幽門螺桿菌是一種常見(jiàn)的人類致病菌，其骨架蛋白MreB通過(guò)影響脲酶活性而參與調(diào)控其致病性。為了更準(zhǔn)確地分離出MreB蛋白，用重疊延伸PCR技術(shù)(指在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的片段重疊拼接起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù))，將幽門螺桿菌MreB基因中編碼終止密碼子前的DNA序列與TAP標(biāo)簽(可以標(biāo)記幽門螺桿菌基因組中任何一個(gè)基因，且不會(huì)影響基因的表達(dá))進(jìn)行連接，構(gòu)建了融合表達(dá)蛋白MreB和TAP標(biāo)簽的質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)流程如圖所示。據(jù)圖回答下列問(wèn)題：
(1)重疊PCR獲得帶有標(biāo)簽的MreB基因
①獲得兩種具有重疊片段DNA的過(guò)程中，PCR1和PCR2必須在不同的反應(yīng)體系中，原因是____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________。
②PCR3反應(yīng)體系中所加入的引物是__________________。
(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
①為將帶有標(biāo)簽的MreB基因定向插入到pK18mobSacB質(zhì)粒中，需要在引物末端添加限制酶識(shí)別序列，據(jù)圖分析，在引物1添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是________________，在引物4添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是______________。經(jīng)過(guò)這兩種酶酶切的帶有標(biāo)簽的MreB基因和pK18mobSacB質(zhì)粒進(jìn)行連接時(shí)，可選用______________________(填“E.coli DNA連接酶”或“T4 DNA連接酶”)。
②重組質(zhì)粒中，KmR基因的作用是_______________________________________________
____________________________________________________________________________。
答案　(1)①引物2和引物3中存在互補(bǔ)配對(duì)的片段，置于同一反應(yīng)體系時(shí)，它們會(huì)發(fā)生結(jié)合而失去作用　②引物1、引物4　(2)①SmaⅠ　XhoⅠ　T4 DNA連接酶　②鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)
解析　(1)①重疊延伸PCR技術(shù)是指在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的片段重疊拼接起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，引物2和引物3中存在互補(bǔ)配對(duì)的片段，置于同一反應(yīng)體系時(shí)，它們會(huì)發(fā)生結(jié)合而失去作用。②分析題意可知，PCR3是為了獲得帶有標(biāo)簽的MreB基因，所以應(yīng)選擇引物1和引物4。(2)①要將帶有標(biāo)簽的MreB基因定向插入到pK18mobSacB質(zhì)粒中的啟動(dòng)子與終止子之間，EcoR Ⅰ在啟動(dòng)子兩側(cè)均有其切割位點(diǎn)，因此不能選擇EcoR Ⅰ，在引物1添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶只能是SmaⅠ，在引物4添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶只能是XhoⅠ；SmaⅠ切割后產(chǎn)生平末端，經(jīng)過(guò)這兩種酶酶切的帶有標(biāo)簽的MreB基因和pK18mobSacB質(zhì)粒進(jìn)行連接時(shí)應(yīng)選擇T4 DNA連接酶。②重組質(zhì)粒中，KmR基因是標(biāo)記基因，其作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。

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