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第61課時(shí)
基因工程的基本工具和基本操作程序
1.概述基因工程是在微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。
2.闡明重組DNA技術(shù)的三種基本工具。
3.闡明基因工程的基本操作程序。
課標(biāo)要求
考情分析
1.基因工程的基本工具 2023·新課標(biāo)·T6　2021·全國(guó)乙·T38　2021·湖北·T7
2.基因工程的基本操作程序 2023·全國(guó)乙·T38　2023·全國(guó)甲·T38　2023·湖北·T4　
2023·廣東·T20　2021·廣東·T22
內(nèi)容索引
考點(diǎn)一　　基因工程的基本工具
考點(diǎn)二　　基因工程的基本操作程序
課時(shí)精練
考點(diǎn)一
基因工程的基本工具
1.基因工程的概念
DNA分子
轉(zhuǎn)基因
遺傳特性
生物類型
基因重組
2.基因工程的誕生和發(fā)展
(1)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不僅證明了DNA是遺傳物質(zhì)，還證明了DNA可在同種生物不同個(gè)體之間 。
(2)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出和 的證明。
(3)中心法則的確立。
(4) 的破譯。
(5)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)。 的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。
轉(zhuǎn)移
半保留復(fù)制
遺傳密碼
限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶
(6) 體外重組的實(shí)現(xiàn)。
(7)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功。
(8)DNA測(cè)序和合成技術(shù)的發(fā)明。
(9) 技術(shù)的發(fā)明。
(10) 技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的定點(diǎn)插入、敲除或替換。
DNA
PCR
基因組編輯
3.重組DNA技術(shù)的基本工具
(1)限制性內(nèi)切核酸酶(簡(jiǎn)稱
“限制酶”)
原核生物
數(shù)千
特定核苷酸序列
磷酸二酯鍵
磷酸二酯鍵
提醒　①限制酶的識(shí)別序列一般由6個(gè)核苷酸組成，少數(shù)由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。
②限制酶作用的化學(xué)鍵只能是磷酸二酯鍵。
③在切割含目的基因的DNA分子時(shí)，需用限制酶切割兩次此DNA分子，產(chǎn)生4個(gè)末端。只有這樣才能使目的基因的兩端都有可連接的黏性末端或平末端。
(2)DNA連接酶
磷酸二酯鍵
大腸桿菌
黏性末端
黏性末端
(3)載體
環(huán)狀雙鏈DNA分子
噬菌體
有一個(gè)至多個(gè)
自我復(fù)制
受體DNA
標(biāo)記
(1)基因工程是人工操作導(dǎo)致的染色體變異，變異是不定向的(　　)
提示　基因工程是人工操作導(dǎo)致的基因重組，變異是定向的。
×
(2)DNA連接酶可以連接目的基因與載體的氫鍵，形成重組DNA(　　)
提示　DNA連接酶可以將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的磷酸二酯鍵。
×
(3)限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具酶
(　　)
提示　限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具，前兩者屬于工具酶，質(zhì)粒屬于載體。
×
(4)質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為標(biāo)記基因(　　)
提示　質(zhì)粒上的抗生素抗性基因常作為標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。
×
將從蘇云金桿菌中獲取的Bt基因轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞內(nèi)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的過(guò)程中，需借助多種分子工具且經(jīng)歷多個(gè)操作步驟。實(shí)驗(yàn)人員使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割質(zhì)粒。如圖表示常用的限制酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)以及質(zhì)粒上的限制酶切割位點(diǎn)。請(qǐng)思考以下問(wèn)題：
(1)請(qǐng)用圖示法寫(xiě)出限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割后形成黏性末端的過(guò)程。
提示　限制酶EcoRⅠ：
限制酶NheⅠ：
(2)切割圖示中的目的基因應(yīng)選用哪類限制酶？請(qǐng)說(shuō)明理由。
提示　用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的
基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形
成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ
切割后形成的黏性末端相同，實(shí)驗(yàn)人員使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割質(zhì)粒，應(yīng)選用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。
限制酶的選擇
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。
(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。若載體上有兩個(gè)及以上的標(biāo)記基因，則可合理對(duì)其
中一些標(biāo)記基因進(jìn)行酶切破壞，從而達(dá)到比一個(gè)標(biāo)記基因更高的篩選成功率，防止只有一個(gè)標(biāo)記基因時(shí)出現(xiàn)的“假陽(yáng)性”(即未成功導(dǎo)入目的基因的載體也能正常表達(dá)標(biāo)記基因，造成無(wú)效篩選)。
(3)善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點(diǎn)時(shí)，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點(diǎn)的
兩種不同的限制酶，對(duì)目的基因所在序列和載體進(jìn)行剪切，即“雙酶切法”。其優(yōu)點(diǎn)和作用是：①防止目的基因環(huán)化；②避免目的基因與載體反向連接，即用DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動(dòng)子的方向(或描述為“RNA聚合酶的移動(dòng)方向”)必須是相同的，否則目的基因?qū)牒鬅o(wú)法正常表達(dá)。如圖甲、乙也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。
(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指來(lái)源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶。當(dāng)不適合選擇某種限制酶時(shí)，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端。
考向一　辨析基因工程的基本工具
1.(2021·湖北，7)限制性內(nèi)切核酸酶EcoRⅠ識(shí)別并切割 雙
鏈DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到DNA片段的平均長(zhǎng)度(堿基對(duì))約為
A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
√
1
2
據(jù)圖可知，EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)有6個(gè)堿基對(duì)，由于
DNA分子的堿基組成為A、T、G、C，則某一位點(diǎn)
出現(xiàn)該序列的概率為1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4
＝1/4 096，即4 096個(gè)堿基對(duì)可能出現(xiàn)一個(gè)限制酶EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)，故理論上得到DNA片段的平均長(zhǎng)度(堿基對(duì))約為4 096，與4 000最接近，C符合題意。
1
2
2.(2024·連云港高三調(diào)研)質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，質(zhì)粒有標(biāo)記基因(如圖所示)，通過(guò)標(biāo)記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉(zhuǎn)移成功。質(zhì)粒上箭頭表示三種限制酶的酶切位點(diǎn)。外源基因插入的位置不同，細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況不同。如表是外源基因插入(插入點(diǎn)有a、b、c)后細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。下列有關(guān)敘述正確的是
1
2
項(xiàng)目 細(xì)菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況 細(xì)菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況
① 能生長(zhǎng) 不能生長(zhǎng)
② 能生長(zhǎng) 能生長(zhǎng)
③ 不能生長(zhǎng) 能生長(zhǎng)
A.質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)上有RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)
B.①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點(diǎn)①是a，②是c，③是b
C.質(zhì)粒被一種限制酶切開(kāi)時(shí)，被水解的磷酸二酯鍵有2個(gè)
D.將外源基因與質(zhì)粒連接時(shí)需用DNA聚合酶
1
2
項(xiàng)目 細(xì)菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況 細(xì)菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況
① 能生長(zhǎng) 不能生長(zhǎng)
② 能生長(zhǎng) 能生長(zhǎng)
③ 不能生長(zhǎng) 能生長(zhǎng)
√
質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)上有DNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，A錯(cuò)誤；
①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點(diǎn)①是b，②是c，③是a，B錯(cuò)誤；
將外源基因與質(zhì)粒連接時(shí)需用DNA連接酶，D錯(cuò)誤。
1
2
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與DNA有關(guān)的幾種酶的比較
考點(diǎn)二
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的篩選與獲取
(1)目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞 或獲得預(yù)期 等的基因。
(2)篩選合適的目的基因
①?gòu)南嚓P(guān)的已知 的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。
②利用 和序列比對(duì)工具進(jìn)行篩選。
性狀
表達(dá)產(chǎn)物
結(jié)構(gòu)和功能清晰
序列數(shù)據(jù)庫(kù)
(3)目的基因的獲取
①人工合成目的基因。
②PCR 和擴(kuò)增目的基因
a.PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))：是一項(xiàng)根據(jù) 的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種 與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行 的技術(shù)。
b.PCR反應(yīng)的條件：一定的 、DNA模板、2種 、4種____________、 DNA聚合酶，以及能自動(dòng)調(diào)控 的儀器。
獲取
DNA半保留復(fù)制
組分
大量復(fù)制
緩沖溶液
引物
脫氧核苷酸
耐高溫的
溫度
c.PCR擴(kuò)增的過(guò)程
90
單鏈
50
引物
72
耐高溫的DNA聚合酶
d.PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用 來(lái)鑒定。
瓊脂糖凝膠電泳
PCR技術(shù)和DNA
復(fù)制的比較
③通過(guò)構(gòu)建 來(lái)獲取目的基因。
2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因 ，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
基因文庫(kù)
在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代
(2)基因表達(dá)載體的組成及作用
啟動(dòng)子
標(biāo)記基因
(3)構(gòu)建過(guò)程
提醒　啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比
項(xiàng)目 啟動(dòng)子 終止子 起始密碼子 終止密碼子
本質(zhì) DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái) 翻譯的起始信號(hào)(編碼氨基酸) 翻譯的結(jié)束信號(hào)(正常情況下，不編碼氨基酸)
3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
生物種類 植物 動(dòng)物 微生物
常用方法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、________ ______ 顯微注射法 ______處理法
受體細(xì)胞 ________________ _________ 原核細(xì)胞
花粉管通
道法
Ca2＋
體細(xì)胞或受精卵
受精卵
生物種類 植物 動(dòng)物 微生物
轉(zhuǎn)化過(guò)程 將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達(dá) 將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物 Ca2＋處理細(xì)胞→細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達(dá)載體導(dǎo)入
辨析　(1)轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。
(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入
第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。
4.目的基因的檢測(cè)與鑒定
(1)目的基因一定是編碼蛋白質(zhì)的基因(　　)
提示　目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。
×
(2)真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋(　　)
√
(3)基因表達(dá)載體中的啟動(dòng)子和終止子決定著翻譯的開(kāi)始與結(jié)束(　　)
提示　啟動(dòng)子和終止子決定著轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始與結(jié)束。
×
(4)Ti質(zhì)粒上的T－DNA可與植物受體細(xì)胞的染色體DNA整合在一起(　　)
(5)為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體(　　)
提示　為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)能以受精卵為受體，也能以體細(xì)胞為受體。
√
×
(6)檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞可用抗原—抗體雜交技術(shù)(　　)
提示　檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法是PCR等技術(shù)。
×
1.Bt抗蟲(chóng)蛋白基因(簡(jiǎn)稱Bt基因)是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉較為合適的目的基因，篩選Bt基因后可以利用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行大量擴(kuò)增。回答下列問(wèn)題：
(1)什么是引物？DNA復(fù)制時(shí)為什么需要引物？
提示　引物是指一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。在DNA擴(kuò)增時(shí)，DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此復(fù)制DNA時(shí)應(yīng)加入兩種引物。
(2)PCR擴(kuò)增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列嗎？
提示　不需要，只要知道Bt基因兩端的部分核苷酸序列即可(以便根據(jù)這部分序列合成兩種引物)。
(3)為檢測(cè)Bt基因在轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)錄，科研人員提取棉花細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程獲得總cDNA，通過(guò)PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地?cái)U(kuò)增出Bt基因的cDNA，原因是什么？
提示　引物是依據(jù)Bt毒蛋白基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或引物能與Bt基因的cDNA特異性結(jié)合)。
(4)PCR擴(kuò)增過(guò)程中的循環(huán)圖示與規(guī)律如圖所示，若一個(gè)Bt毒蛋白基因在PCR中經(jīng)過(guò)n輪循環(huán)，理論上得到多少個(gè)DNA分子？含引物的DNA分子多少個(gè)？含其中一種引物的DNA分子多少個(gè)？同時(shí)含兩種引物的DNA分子多少個(gè)？共需要消耗多少個(gè)引物？含不等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個(gè)？含等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個(gè)？
提示　經(jīng)過(guò)n輪循環(huán)，得到2n個(gè)DNA分子，含引物的DNA分子2n個(gè)，含其中一種引物的DNA分子數(shù)(2n－1)個(gè)，同時(shí)含兩種引物的DNA分子(2n－2)個(gè)，共需要消耗(2n＋1－2)個(gè)引物。含不等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子2n個(gè)，含等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子 (2n－2n)個(gè)。
(5)PCR擴(kuò)增Bt基因的過(guò)程中需要解旋酶嗎？并說(shuō)明理由。所需要的DNA聚合酶應(yīng)具有什么特點(diǎn)？
提示　不需要解旋酶，因?yàn)镻CR過(guò)程中，DNA雙鏈在高溫下即可完成解旋。由于PCR過(guò)程溫度較高，故所需要的DNA聚合酶應(yīng)具有耐高溫的特點(diǎn)。
2.據(jù)圖分析抗蟲(chóng)棉的培育過(guò)程。
(1)該過(guò)程中的目的基因是________，載體是________。
(2)基因工程中，往往使用兩種限制酶切割目的基因，這樣做的原因是什么？
提示　為了避免目的基因和載體的自身環(huán)化和反向連接。
Bt基因
Ti質(zhì)粒
(3)為了保證目的基因在受體細(xì)胞中能正確表達(dá)，對(duì)目的基因在質(zhì)粒中的插入位點(diǎn)有什么要求？
提示　目的基因應(yīng)插入啟動(dòng)子與終止
子之間。
(4)該實(shí)例中，導(dǎo)入目的基因的方法是 。為什么目的基因可以整合到染色體的DNA上？
提示　由于Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞且能整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，而目的基因又插入T－DNA，所以目的基因可以整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上。
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
(5)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時(shí)，能否僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上？為什么？
提示　一般不能。如果僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上，由于細(xì)胞分裂可能導(dǎo)致目的基因丟失，無(wú)法穩(wěn)定遺傳。
(6)該實(shí)例中，檢測(cè)目的基因是否成功表達(dá)的常見(jiàn)方法有哪些？
提示　抗原—抗體雜交、用棉葉飼喂棉鈴蟲(chóng)。
考向二　辨析基因工程的基本操作程序
3.(2023·湖北，4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是
A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一
定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切，可通過(guò)DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒
構(gòu)建成功與否
D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落
3
4
√
若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；
若用PvuⅠ酶切，重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；
3
4
DNA凝膠電泳技術(shù)可以分離出不同大小的DNA片段，重組質(zhì)粒的大小與原質(zhì)粒不同，能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；
SphⅠ的酶切位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因中，
若用SphⅠ酶切，重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯(cuò)誤。
3
4
4.(2024·江蘇揚(yáng)州中學(xué)高三模擬)土壤農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，Ti質(zhì)粒上的T－DNA片段轉(zhuǎn)入植物的基因組。利用農(nóng)桿菌以Ti質(zhì)粒作為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，下列相關(guān)敘述正確的是
A.目的基因應(yīng)插入T－DNA片段外，以防止破壞T－DNA
B.用Ca2＋處理農(nóng)桿菌，以利于其侵染植物細(xì)胞
C.Ti質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子，沒(méi)有雙螺旋結(jié)構(gòu)
D.可以用PCR技術(shù)檢測(cè)外源DNA是否整合到植物的染色體DNA上
3
4
√
在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，需要將目的基因插入到T－DNA片段上，有利于介導(dǎo)外源DNA整合到植物的染色體DNA上，A錯(cuò)誤；
農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞不需要用Ca2＋處理，B錯(cuò)誤；
Ti質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子，是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的DNA，具有雙螺旋結(jié)構(gòu)，C錯(cuò)誤。
3
4
1. (選擇性必修3 P67)基因工程：按照人們的愿望，通過(guò) 等技術(shù)，賦予生物新的 ，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的______________
________。
2.(選擇性必修3 P71)限制酶能夠識(shí)別 ，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。
3.(選擇性必修3 P72)載體上有特殊的標(biāo)記基因，便于 。
轉(zhuǎn)基因
遺傳特性
物產(chǎn)品
生物類型和生
雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列
重組DNA分子的篩選
4.(選擇性必修3 P77)PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行，需提供
、 、4種 和耐高溫的 。
5.(選擇性必修3 P77)真核細(xì)胞和細(xì)菌的 都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段___________
_____________________________________，引物的作用是___________
______________________________________。
DNA模板
2種引物
脫氧核苷酸
DNA聚合酶
DNA聚合酶
能與DNA母
鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸
使DNA聚合
酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸
6.(選擇性必修3 P80)基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的：使目的基因__________
_____________________________，同時(shí)，使目的基因能夠____________
______。基因表達(dá)載體是載體的一種，除目的基因、___________外，還必須含有啟動(dòng)子、終止子等。啟動(dòng)子是______________識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因____________，最終表達(dá)出人類需要的_______。
7.(選擇性必修3 P81)轉(zhuǎn)化：________________________________________
________________________。
在受體細(xì)胞
中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代
表達(dá)和發(fā)揮
作用
標(biāo)記基因
RNA聚合酶
轉(zhuǎn)錄出mRNA
蛋白質(zhì)
目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程
8.(選擇性必修3 P81～82)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法是_____________、______________；導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法是____________；導(dǎo)入微生物細(xì)胞的方法是_______處理法。
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
花粉管通道法
顯微注射法
Ca2＋
9.(選擇性必修3 P82)目的基因的檢測(cè)與鑒定：首先是分子水平的檢測(cè)，包括通過(guò)_____等技術(shù)檢測(cè)棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測(cè)Bt基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA；從轉(zhuǎn)基因棉花中提取_______，用相應(yīng)的____進(jìn)行_______________，檢測(cè)Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲(chóng)蛋白等。其次，還需要進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。例如，通過(guò)__________________________來(lái)確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲(chóng)特性以及抗性的程度。
PCR
蛋白質(zhì)
抗體
抗原—抗體雜交
采摘抗蟲(chóng)棉的葉片飼喂棉鈴蟲(chóng)
10.如圖為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)為：Hind Ⅲ(A↓AGCTT)、Pvit Ⅱ(CAG↓CTG)、KpnⅠ(G↓GTACC)、EcoRⅠ(G↓AATTC)、
PstⅠ(CTGCA↓G)、BamHⅠ(G↓GATCC)。為使phb2基因(該基因序列不含圖中限制酶的識(shí)別序列)與載體正確連接，在擴(kuò)增的
phb2基因兩端分別引入 和 兩種
不同限制酶的識(shí)別序列。將經(jīng)過(guò)這兩種酶酶切
的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用_______
________(填“E.coli DNA連接酶”或“T4 DNA連接酶”)。
Pvit Ⅱ
EcoRⅠ
T4 DNA
連接酶
返回
課時(shí)精練
一、選擇題
1.(2024·泉州高三質(zhì)檢)像BclⅠ(－T↓GATCA－)、Bgl Ⅱ(－A↓GATCT－)、MboⅠ(－↓GATC－)這樣，識(shí)別序列不同，但能產(chǎn)生相同的黏性末端的一類限制酶被稱為同尾酶。如圖表示目的基因及質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)。選用不同的限制酶對(duì)質(zhì)粒和目的基因進(jìn)行切割，并用DNA連接酶進(jìn)行連接。下列分析錯(cuò)誤的是
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選項(xiàng) 切割質(zhì)粒 切割目的基因 結(jié)果分析
A BclⅠ和BglⅡ BclⅠ和BglⅡ 形成的重組質(zhì)粒的堿基排列順序不一定相同
B BclⅠ和BglⅡ MboⅠ 切割后的質(zhì)粒不可自我環(huán)化，切割后的目的基因可以自我環(huán)化
C MboⅠ BclⅠ和BglⅡ 形成的重組質(zhì)粒可被MboⅠ再次切開(kāi)，但可能無(wú)法被BclⅠ和BglⅡ再次切開(kāi)
D MboⅠ MboⅠ 切割后的質(zhì)粒可以自我環(huán)化，切割后的目的基因也可以自我環(huán)化
√
13
切割質(zhì)粒和切割目的基因均用BclⅠ和BglⅡ時(shí)，切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，形成重組質(zhì)粒時(shí)目的基因可能反向連接，形成的堿基排列順序不一定相同，A正確；
用BclⅠ和BglⅡ切割質(zhì)粒，切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，切割后的質(zhì)粒可能自我環(huán)化，B錯(cuò)誤；
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切割質(zhì)粒用MboⅠ，切割目的基因用BclⅠ和Bgl Ⅱ，產(chǎn)生相同的黏性末端，形成的重組質(zhì)粒中有MboⅠ的切割位點(diǎn)，但不一定有BclⅠ和Bgl Ⅱ的切割位點(diǎn)，因此形成的重組質(zhì)粒可被MboⅠ再次切開(kāi)，但可能無(wú)法被BclⅠ和Bgl Ⅱ再次切開(kāi)，C正確；
切割質(zhì)粒用MboⅠ，切割目的基因用MboⅠ，切割后的質(zhì)粒和目的基因均可以自我環(huán)化，D正確。
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2.(2023·新課標(biāo)，6)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。
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下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是
A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA連接酶連接
B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA連接酶連接
C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA連接酶連接
D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA連接酶連接
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√
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酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4 DNA連接酶連接，A不符合題意；
質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能連接，B不符合題意；
質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達(dá)載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C符合題意；
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若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達(dá)載體缺少標(biāo)記基因，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的篩選，D不符合題意。
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3.(2023·重慶，12)某小組通過(guò)PCR(假設(shè)引物長(zhǎng)度為8個(gè)堿基短于實(shí)際長(zhǎng)度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進(jìn)行酶切(下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達(dá)載體。下列敘述錯(cuò)誤的是
A.其中一個(gè)引物序列為
5′－TGCGCAGT－3′
B.步驟①所用的酶是SpeⅠ
和CfoⅠ
C.用步驟①的酶對(duì)載體進(jìn)
行酶切，至少獲得了2個(gè)片段
D.酶切片段和載體連接時(shí)，可使用E.coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶
√
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根據(jù)三種酶的酶切位點(diǎn)，左側(cè)的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右邊的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B錯(cuò)誤；
用步驟①的限制酶NheⅠ和限制酶CfoⅠ對(duì)載體(環(huán)狀DNA)進(jìn)行酶切，切割之后至少獲得了2個(gè)片段，C正確；
由于引物只能引導(dǎo)子鏈從5′端到3′端延伸，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，其中一個(gè)引物序列為5′－TGCGCAGT－3′，A正確；
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可使用E.coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶，D正確。
E.coli DNA連接酶只能連接黏性末端，T4 DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端，圖中酶切后形成的是黏性末端，酶切片段和載體連接時(shí)，
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4.(2024·鎮(zhèn)江高三二模)轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分離剔除法和重組剔除法。分離剔除法是在轉(zhuǎn)基因時(shí)將目的基因和標(biāo)記基因分別構(gòu)建在兩個(gè)Ti質(zhì)粒上，通過(guò)共轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因植物后讓其自交得到不含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因個(gè)體；重組剔除法利用Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)，Cre酶能有效剔除重組載體中含有標(biāo)記基因的序列，只留下一個(gè)LoxP位點(diǎn)，具體原理如圖。下列說(shuō)法不正確的是
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A.利用分離剔除法時(shí)，目的基
因和標(biāo)記基因都應(yīng)插到Ti質(zhì)
粒的T－DNA序列內(nèi)部
B.分離剔除時(shí)目的基因和標(biāo)記
基因插到植物細(xì)胞的同源染色體或非同源染色體上均可成功
C.上述重組載體中啟動(dòng)子1在農(nóng)桿菌中可發(fā)揮作用，而在植物細(xì)胞中不能
發(fā)揮作用
D.經(jīng)重組剔除后的標(biāo)記基因，因沒(méi)有啟動(dòng)子而無(wú)法啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄
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√
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序列內(nèi)部，進(jìn)而成功整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，A正確；
分離剔除時(shí)目的基因和標(biāo)記基因插到植物細(xì)胞的同源染色體或非同源染色體上最終均可獲得不含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因個(gè)體，即均可成功，B正確；
Ti質(zhì)粒的T－DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，所以利用分離剔除法時(shí)，目的基因和標(biāo)記基因都應(yīng)插到Ti質(zhì)粒的T－DNA
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重組剔除時(shí)，Cre酶基因應(yīng)該在植物細(xì)胞中表達(dá)，故上述重組載體中啟動(dòng)子1在農(nóng)桿菌中不能發(fā)揮作用，而在植物細(xì)胞中能發(fā)揮作用，C錯(cuò)誤；
由圖可知，經(jīng)重組剔除后的標(biāo)記基因沒(méi)有啟動(dòng)子，無(wú)法啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，D正確。
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5.如圖是培育抗除草劑玉米的技術(shù)路線圖，含有內(nèi)含子的報(bào)告基因只能在真核生物中正確表達(dá)，其產(chǎn)物能催化無(wú)色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色。轉(zhuǎn)化過(guò)程中愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，會(huì)導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。下列相關(guān)敘述正確的是
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A.過(guò)程①中除草劑抗性基因插
入T－DNA中，導(dǎo)致T－DNA
片段失活
B.過(guò)程①用兩種限制酶就可防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化
C.過(guò)程②用Ca2＋處理，使農(nóng)桿菌細(xì)胞壁通透性改變，使其處于能吸收周圍環(huán)
境中DNA分子的生理狀態(tài)
D.過(guò)程③應(yīng)在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)K
√
13
過(guò)程①中除草劑抗性基因插入T－DNA中，不會(huì)導(dǎo)致T－DNA片段失活，A錯(cuò)誤；
過(guò)程①使用兩種限制酶，且這兩種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同，才可以防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，B錯(cuò)誤；
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過(guò)程③應(yīng)在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)K，除草劑是用來(lái)檢測(cè)目的基因是否正確表達(dá)，物質(zhì)K是用來(lái)檢測(cè)目的基因有沒(méi)有導(dǎo)入植物細(xì)胞中，加入除草劑可保留轉(zhuǎn)化的愈傷組織和附著農(nóng)桿菌但未轉(zhuǎn)化的愈傷組織，其中變藍(lán)的為轉(zhuǎn)化的愈傷組織，D正確。
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6.(2024·西安高三一模)我國(guó)科學(xué)家利用XbaⅠ和SacⅠ兩種限制酶，并運(yùn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將富含賴氨酸的蛋白質(zhì)編碼基因(含678 bp)導(dǎo)入某植物細(xì)胞，再經(jīng)植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株，使賴氨酸的含量比對(duì)照組明顯提高，如圖表示相關(guān)培育過(guò)程(質(zhì)粒的其他部位和目的基因內(nèi)部均無(wú)XbaⅠ、SacⅠ、Hind Ⅲ的識(shí)別位點(diǎn))，下列說(shuō)法不正確的是
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A.一個(gè)內(nèi)含目的基因的模板DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增4次，共產(chǎn)生8個(gè)等長(zhǎng)DNA分子
B.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的常用方法
C.植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基需添加卡那霉素以便篩選轉(zhuǎn)基因植株
D.使用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重組質(zhì)粒后能得到1 500 bp左右的片段
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√
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一個(gè)內(nèi)含目的基因的模板DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增4次共產(chǎn)生等長(zhǎng)的DNA分子數(shù)24－2×4＝8(個(gè))，A正確；
因?yàn)椴迦胫参锛?xì)胞染色體上的是質(zhì)粒的T－DNA，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，導(dǎo)入成功的植物細(xì)胞對(duì)卡那霉素?zé)o抗性，C錯(cuò)誤；
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根據(jù)切割目的基因的限制酶在質(zhì)粒上的切割位點(diǎn)，可知由于重組質(zhì)粒上移除1 900 bp而補(bǔ)充了含678 bp的目的基因，加上未移除的822 bp，所以用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重組質(zhì)粒后，可得到822＋678＝1 500(bp)左右的新片段，D正確。
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7.自然界中很少出現(xiàn)藍(lán)色的花，天然藍(lán)色花產(chǎn)生的主要原因是花瓣細(xì)胞液泡中花青素在堿性條件下顯藍(lán)色。我國(guó)科學(xué)家利用鏈霉菌的靛藍(lán)合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構(gòu)建基因表達(dá)載體(如圖)，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入白玫瑰中，在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍(lán)。
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下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是
A.上述獲得藍(lán)色玫瑰的方案中不需
要轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因
B.將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)使用的限
制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C.同時(shí)使用SpeⅠ和SacⅠ能提高idgS基因和Ti質(zhì)粒的重組效率
D.sfp和idgS基因具有各自的啟動(dòng)子，表達(dá)是相互獨(dú)立進(jìn)行的
√
13
靛藍(lán)能夠穩(wěn)定顯色，不受pH的影響，故本題方案中不需要轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因，A正確；
將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，則會(huì)將終止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B錯(cuò)誤。
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8.(2024·莆田高三質(zhì)檢)如圖表示利用基因工程生產(chǎn)黃金大米時(shí)所構(gòu)建的基因表達(dá)載體，其中基因Ⅰ和基因Ⅱ是β－胡蘿卜素合成所必需的基因，基因Ⅲ表達(dá)的蛋白質(zhì)可使細(xì)菌在特殊培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。下列分析錯(cuò)誤的是
A.A序列是該基因表達(dá)載體的復(fù)
制原點(diǎn)
B.基因Ⅲ的作用是便于篩選該重
組質(zhì)粒
C.β－胡蘿卜素是檢測(cè)基因Ⅰ、基因Ⅱ表達(dá)的關(guān)鍵指標(biāo)之一
D.圖中基因插入質(zhì)粒時(shí)需要限制酶和DNA連接酶
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√
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由題圖可知，每個(gè)基因前都存在A序列，可推測(cè)該序列應(yīng)為啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別與結(jié)合的位點(diǎn)，一個(gè)質(zhì)粒一般只有一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，A錯(cuò)誤。
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9.(2024·南京高三聯(lián)考)某課題組為得到青蒿素產(chǎn)量高的新品系，使青蒿素合成過(guò)程中的某一關(guān)鍵酶基因fps在野生青蒿中過(guò)量表達(dá)，其過(guò)程如圖所示。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是
A.也可用PCR技術(shù)直接擴(kuò)增RNA來(lái)獲取目的基因
B.酶1、酶2和酶3作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵
C.本過(guò)程中，可以采用一種、兩種甚至四種酶2
D.通過(guò)抗原—抗體雜交技術(shù)可檢測(cè)fps基因是否表達(dá)出蛋白質(zhì)
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PCR技術(shù)不能直接擴(kuò)增RNA來(lái)獲取目的基因，A錯(cuò)誤；
據(jù)圖可知，酶1表示逆轉(zhuǎn)錄酶，酶2表示限制酶，酶3表示DNA連接酶，酶1、酶2和酶3作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵，B正確；
不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端，因此為了成功構(gòu)建表達(dá)載體，可以采用一種、兩種甚至四種酶2切割含fps基因的DNA片段和質(zhì)粒a，C正確。
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10.(2024·徐州高三質(zhì)檢)圖甲為培育轉(zhuǎn)基因生物時(shí)選用的載體，圖乙是含有目的基因的一段DNA序列，圖中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。下列敘述錯(cuò)誤的是
A.若通過(guò)PCR技術(shù)提取該目
的基因，應(yīng)該選用引物a
和引物c
B.構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)可選用
BclⅠ和Hind Ⅲ這兩種限制酶
C.若將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，需用Ca2＋處理大腸桿菌
D.只利用含四環(huán)素的培養(yǎng)基就可以直接篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的受體細(xì)胞
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√
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由于選擇BclⅠ和Hind Ⅲ這兩種限制酶，破壞了氨芐青霉素抗性基因，但沒(méi)有破壞四環(huán)素抗性基因，因此應(yīng)該先用含四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出含有基因表達(dá)載體和普通質(zhì)粒的大腸桿菌，再用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，D錯(cuò)誤。
根據(jù)圖甲可知，BamHⅠ會(huì)導(dǎo)致兩種抗性基因都被破壞，所以不宜選用BamHⅠ，為防止目的基因自身環(huán)化，可選用BclⅠ和Hind Ⅲ兩種限制酶切割，B正確；
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二、非選擇題
11.(2021·全國(guó)乙，38)用重組DNA技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過(guò)程中要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)如圖所示。
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回答下列問(wèn)題：
(1)常用的DNA連接酶有E.coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶，上圖中_________
_______酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA連接酶連接，上圖中_________
________________________切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。
EcoRⅠ、
PstⅠ
EcoRⅠ、
PstⅠ、SmaⅠ和EcoR Ⅴ
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限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoR Ⅴ切割形成的是平末端，E.coli DNA連接酶來(lái)源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來(lái)，而T4 DNA連接酶來(lái)源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA連接酶連接，除了這兩種限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoR Ⅴ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA連接酶連接。
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(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是 。
磷酸二酯鍵
DNA連接酶將兩個(gè)DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。
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(3)重組DNA技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中 ；質(zhì)粒DNA分子上有 ______________________ ，便于外源DNA的插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是________________________________________________
___________________________。
自我復(fù)制
一至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)
用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即
為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞
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質(zhì)粒是小型環(huán)狀的DNA分子，常作為基因表達(dá)的載體，首先質(zhì)粒上含有復(fù)制原點(diǎn)，能保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中自我復(fù)制。質(zhì)粒DNA分子上有一個(gè)至多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，便于目的基因的導(dǎo)入。質(zhì)粒上的標(biāo)記基因便于重組DNA分子的篩選，具體做法是用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞。
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(4)表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指______________________________
____________________________________________________________。
位于基因上游的一段有特殊序列結(jié)
構(gòu)的DNA片段，是RNA聚合酶識(shí)別及結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程
啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類需要的蛋白質(zhì)。
13
12.(2021·福建，21)微生物吸附是重金屬?gòu)U水的處理方法之一。金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在于動(dòng)植物中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的作用。科研人員將棗樹(shù)的MT基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建工程菌。回答下列問(wèn)題：
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(1)根據(jù)棗樹(shù)的MT cDNA的核苷酸序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物(圖1甲)，通過(guò)PCR擴(kuò)增MT基因。已知A位點(diǎn)和B位點(diǎn)分別是起始密碼子和終止密碼子對(duì)應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為 。
引物1和引物4
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密碼子位于mRNA上，是決定氨基酸的三個(gè)相鄰堿基，起始密碼子和終止密碼子分別控制翻譯的開(kāi)始和結(jié)束，故為保證基因的正常表達(dá)，一對(duì)引物應(yīng)分別位于位點(diǎn)A和位點(diǎn)B的兩側(cè)，故選擇引物1和引物4。
13
①選用 酶將載體P切開(kāi)，再用 __ (填“T4 DNA”或“E.coli81 DNA”)連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。
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(2)本實(shí)驗(yàn)中，PCR所用的DNA聚合酶擴(kuò)增出的MT基因的末端為平末端。由于載體E只有能產(chǎn)生黏性末端的酶切位點(diǎn)，需借助中間載體P將MT基因接入載體E。載體P和載體E的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切序列如圖1乙所示。
EcoR Ⅴ
T4 DNA
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MT基因的末端為平末端，故需要用EcoR Ⅴ或SmaⅠ切割載體P，但后續(xù)需進(jìn)一步將重組載體P′和載體E連接，故需將MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，故選EcoR Ⅴ將載體P切開(kāi)；由于E.coli81 DNA連接酶只能連接黏性
末端，而T4 DNA連接酶可以連接平末端，MT基因的末端為平末端，故需要用T4 DNA連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。
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②載體P′不具有表達(dá)MT基因的______
和 。選用 ______ 酶組合對(duì)載體P′和載體E進(jìn)行酶切，將切下的MT基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連接，將得到的混合物導(dǎo)入到用______離子處理的大腸桿菌，篩出MT工程菌。
啟動(dòng)子
終止子
XhoⅠ和PstⅠ
鈣
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由圖可知，載體P′不含有表達(dá)MT基因的啟動(dòng)子和終止子；為避免自身環(huán)化和反向連接，可選用兩種酶切割兩種載體，據(jù)圖可知，載體P′和載體E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶的識(shí)別序列，故可選用限制酶XhoⅠ和PstⅠ進(jìn)行酶切；將目的基因?qū)氪竽c桿菌的方法是鈣離子處理法。
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(3)MT基因在工程菌的表達(dá)量如圖2所示。結(jié)果仍無(wú)法說(shuō)明已經(jīng)成功構(gòu)建能較強(qiáng)吸附廢水中重金屬的MT工程菌，理由是_________________
________________________________________。
平上對(duì)MT工程菌吸附重金屬的能力進(jìn)行鑒定
尚未在個(gè)體生物學(xué)水
由于尚未在個(gè)體生物學(xué)水平上對(duì)MT工程菌吸附重金屬的能力進(jìn)行鑒定，故即使MT工程菌的MT蛋白相對(duì)含量較高，也不能說(shuō)明已經(jīng)成功構(gòu)建能較強(qiáng)吸附廢水中重金屬的MT工程菌。
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13.科研人員通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出超量表達(dá)P蛋白的轉(zhuǎn)基因甜玉米。在超量表達(dá)P基因載體的構(gòu)建中，含P基因的DNA片段以及Ti質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)如圖所示，其中強(qiáng)啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
限制酶 識(shí)別序列
ClaⅠ 5′AT↓CGAT3′
BamHⅠ 5′G↓GATCC3′
Hind Ⅲ 5′A↓AGCTT3′
EcoRⅠ 5′G↓AATTC3′
KpnⅠ 5′GGTAC↓C3′
SacⅠ 5′GAGCT↓C3′
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(1)以RNA為模板，通過(guò)RT—PCR技術(shù)可獲取P基因。進(jìn)行RT—PCR時(shí)，一般要加入4種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而不是脫氧核苷酸，其原因是______________________________
_____________________________________________，同時(shí)需加入的酶有_____________
__________________。為了特異性擴(kuò)增P基因序列，需根據(jù) ________ 設(shè)計(jì)特異性引物。
dNTP 能為子鏈延伸過(guò)程提供能量和原料(或脫氧核苷酸只能作為原料而不能提供能量)
逆轉(zhuǎn)錄酶和耐
高溫的DNA聚合酶
P基因兩端的堿基序列
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(2)在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選用的限制酶是 和 ，這樣操作不僅使P基因在玉米植株中超量表達(dá)，還可利用T－DNA的 _____ 特性，最終使P基因_______
__________ 。
BamHⅠ
SacⅠ
可轉(zhuǎn)移
玉米細(xì)胞染色體DNA上
整合到
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在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，要想使P基因在玉米植株中超量表達(dá)，切割目的基因時(shí)需要把強(qiáng)啟動(dòng)子和P基因連在一起切割下來(lái)，因此需要用到BamHⅠ切割，另一種酶可以用KpnⅠ或者SacⅠ，在質(zhì)粒中，KpnⅠ識(shí)別序列在BamHⅠ識(shí)別序列的左側(cè)，終止子在右側(cè)，如果用KpnⅠ切割，目的基
因和質(zhì)粒連接后，目的基因不在啟動(dòng)子和終止子之間，將來(lái)無(wú)法轉(zhuǎn)錄，因此在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選用的限制酶是BamHⅠ和SacⅠ。
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(3)將農(nóng)桿菌液浸泡過(guò)的玉米愈傷組織進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中需加入 ，篩選出的愈傷組織經(jīng)再分化過(guò)程形成叢芽，最終獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株。
潮霉素
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據(jù)圖可知，利用Ti質(zhì)粒的T－DNA可將目的基因(P基因)轉(zhuǎn)移到玉米細(xì)胞的染色體DNA上，T－DNA中含有標(biāo)記基因潮霉素抗性基因，因此培養(yǎng)基中需加入潮霉素以便篩選轉(zhuǎn)基因愈傷組織。
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(4)對(duì)轉(zhuǎn)基因再生玉米植株進(jìn)行鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，有些植株雖有P基因，但幾乎沒(méi)有P蛋白，造成該現(xiàn)象的原因可能有__________________
__________________________________________________________________________________________。
基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中強(qiáng)啟動(dòng)子可能丟失或斷裂，未能真正轉(zhuǎn)化成功；雖然轉(zhuǎn)化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表達(dá)
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基因能控制蛋白質(zhì)的合成，該過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。有些植株雖有P基因，但幾乎沒(méi)有P蛋白，造成該現(xiàn)象的原因可能有：基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中強(qiáng)啟動(dòng)子可能丟失或斷裂，未能真正轉(zhuǎn)化成功；雖然轉(zhuǎn)化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表達(dá)等。
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13第61課時(shí)　基因工程的基本工具和基本操作程序
課標(biāo)要求 1.概述基因工程是在微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。2.闡明重組DNA技術(shù)的三種基本工具。3.闡明基因工程的基本操作程序。
考情分析 1.基因工程的基本工具 2023·新課標(biāo)·T6　2021·全國(guó)乙·T38　2021·湖北·T7
2.基因工程的基本操作程序 2023·全國(guó)乙·T38　2023·全國(guó)甲·T38　2023·湖北·T4　2023·廣東·T20 2021·廣東·T22
考點(diǎn)一　基因工程的基本工具
1．基因工程的概念
2．基因工程的誕生和發(fā)展
(1)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不僅證明了DNA是遺傳物質(zhì)，還證明了DNA可在同種生物不同個(gè)體之間轉(zhuǎn)移。
(2)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出和半保留復(fù)制的證明。
(3)中心法則的確立。
(4)遺傳密碼的破譯。
(5)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)。限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。
(6)DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)。
(7)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功。
(8)DNA測(cè)序和合成技術(shù)的發(fā)明。
(9)PCR技術(shù)的發(fā)明。
(10)基因組編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的定點(diǎn)插入、敲除或替換。
3．重組DNA技術(shù)的基本工具
(1)限制性內(nèi)切核酸酶(簡(jiǎn)稱“限制酶”)
提醒　①限制酶的識(shí)別序列一般由6個(gè)核苷酸組成，少數(shù)由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。
②限制酶作用的化學(xué)鍵只能是磷酸二酯鍵。
③在切割含目的基因的DNA分子時(shí)，需用限制酶切割兩次此DNA分子，產(chǎn)生4個(gè)末端。只有這樣才能使目的基因的兩端都有可連接的黏性末端或平末端。
(2)DNA連接酶
(3)載體
判斷正誤
(1)基因工程是人工操作導(dǎo)致的染色體變異，變異是不定向的(　×　)
提示　基因工程是人工操作導(dǎo)致的基因重組，變異是定向的。
(2)DNA連接酶可以連接目的基因與載體的氫鍵，形成重組DNA(　×　)
提示　DNA連接酶可以將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的磷酸二酯鍵。
(3)限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具酶(　×　)
提示　限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具，前兩者屬于工具酶，質(zhì)粒屬于載體。
(4)質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為標(biāo)記基因(　×　)
提示　質(zhì)粒上的抗生素抗性基因常作為標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。
將從蘇云金桿菌中獲取的Bt基因轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞內(nèi)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的過(guò)程中，需借助多種分子工具且經(jīng)歷多個(gè)操作步驟。實(shí)驗(yàn)人員使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割質(zhì)粒。如圖表示常用的限制酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)以及質(zhì)粒上的限制酶切割位點(diǎn)。請(qǐng)思考以下問(wèn)題：
(1)請(qǐng)用圖示法寫(xiě)出限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割后形成黏性末端的過(guò)程。
提示　限制酶EcoRⅠ：
限制酶NheⅠ：
(2)切割圖示中的目的基因應(yīng)選用哪類限制酶？請(qǐng)說(shuō)明理由。
提示　用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，實(shí)驗(yàn)人員使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割質(zhì)粒，應(yīng)選用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。
歸納總結(jié)　限制酶的選擇
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。
(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。若載體上有兩個(gè)及以上的標(biāo)記基因，則可合理對(duì)其中一些標(biāo)記基因進(jìn)行酶切破壞，從而達(dá)到比一個(gè)標(biāo)記基因更高的篩選成功率，防止只有一個(gè)標(biāo)記基因時(shí)出現(xiàn)的“假陽(yáng)性”(即未成功導(dǎo)入目的基因的載體也能正常表達(dá)標(biāo)記基因，造成無(wú)效篩選)。
(3)善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點(diǎn)時(shí)，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點(diǎn)的兩種不同的限制酶，對(duì)目的基因所在序列和載體進(jìn)行剪切，即“雙酶切法”。其優(yōu)點(diǎn)和作用是：①防止目的基因環(huán)化；②避免目的基因與載體反向連接，即用DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動(dòng)子的方向(或描述為“RNA聚合酶的移動(dòng)方向”)必須是相同的，否則目的基因?qū)牒鬅o(wú)法正常表達(dá)。如圖甲、乙也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。
(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指來(lái)源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶。當(dāng)不適合選擇某種限制酶時(shí)，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端。
考向一　辨析基因工程的基本工具
1．(2021·湖北，7)限制性內(nèi)切核酸酶EcoRⅠ識(shí)別并切割雙鏈DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到DNA片段的平均長(zhǎng)度(堿基對(duì))約為(　　)
A．6 B．250 C．4 000 D．24 000
答案　C
解析　據(jù)圖可知，EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)有6個(gè)堿基對(duì)，由于DNA分子的堿基組成為A、T、G、C，則某一位點(diǎn)出現(xiàn)該序列的概率為1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4＝1/4 096，即4 096個(gè)堿基對(duì)可能出現(xiàn)一個(gè)限制酶EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)，故理論上得到DNA片段的平均長(zhǎng)度(堿基對(duì))約為4 096，與4 000最接近，C符合題意。
2．(2024·連云港高三調(diào)研)質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，質(zhì)粒有標(biāo)記基因(如圖所示)，通過(guò)標(biāo)記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉(zhuǎn)移成功。質(zhì)粒上箭頭表示三種限制酶的酶切位點(diǎn)。外源基因插入的位置不同，細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況不同。如表是外源基因插入(插入點(diǎn)有a、b、c)后細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。下列有關(guān)敘述正確的是(　　)
項(xiàng)目 細(xì)菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況 細(xì)菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況
① 能生長(zhǎng) 不能生長(zhǎng)
② 能生長(zhǎng) 能生長(zhǎng)
③ 不能生長(zhǎng) 能生長(zhǎng)
A.質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)上有RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)
B．①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點(diǎn)①是a，②是c，③是b
C．質(zhì)粒被一種限制酶切開(kāi)時(shí)，被水解的磷酸二酯鍵有2個(gè)
D．將外源基因與質(zhì)粒連接時(shí)需用DNA聚合酶
答案　C
解析　質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)上有DNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，A錯(cuò)誤；①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點(diǎn)①是b，②是c，③是a，B錯(cuò)誤；將外源基因與質(zhì)粒連接時(shí)需用DNA連接酶，D錯(cuò)誤。
歸納提升　與DNA有關(guān)的幾種酶的比較
考點(diǎn)二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的篩選與獲取
(1)目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。
(2)篩選合適的目的基因
①?gòu)南嚓P(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。
②利用序列數(shù)據(jù)庫(kù)和序列比對(duì)工具進(jìn)行篩選。
(3)目的基因的獲取
①人工合成目的基因。
②PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
a．PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))：是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。
b．PCR反應(yīng)的條件：一定的緩沖溶液、DNA模板、2種引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶，以及能自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。
c．PCR擴(kuò)增的過(guò)程
d．PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。
歸納提升　PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較
③通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因。
2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
(2)基因表達(dá)載體的組成及作用
(3)構(gòu)建過(guò)程
提醒　啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比
項(xiàng)目 啟動(dòng)子 終止子 起始密碼子 終止密碼子
本質(zhì) DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái) 翻譯的起始信號(hào)(編碼氨基酸) 翻譯的結(jié)束信號(hào)(正常情況下，不編碼氨基酸)
3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
生物種類 植物 動(dòng)物 微生物
常用方法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法 顯微注射法 Ca2＋處理法
受體細(xì)胞 體細(xì)胞或受精卵 受精卵 原核細(xì)胞
轉(zhuǎn)化過(guò)程 將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達(dá) 將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物 Ca2＋處理細(xì)胞→細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達(dá)載體導(dǎo)入
辨析　(1)轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。
(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入
第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。
4．目的基因的檢測(cè)與鑒定
判斷正誤
(1)目的基因一定是編碼蛋白質(zhì)的基因(　×　)
提示　目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。
(2)真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋(　√　)
(3)基因表達(dá)載體中的啟動(dòng)子和終止子決定著翻譯的開(kāi)始與結(jié)束(　×　)
提示　啟動(dòng)子和終止子決定著轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始與結(jié)束。
(4)Ti質(zhì)粒上的T－DNA可與植物受體細(xì)胞的染色體DNA整合在一起(　√　)
(5)為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體(　×　)
提示　為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)能以受精卵為受體，也能以體細(xì)胞為受體。
(6)檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞可用抗原—抗體雜交技術(shù)(　×　)
提示　檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法是PCR等技術(shù)。
1．Bt抗蟲(chóng)蛋白基因(簡(jiǎn)稱Bt基因)是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉較為合適的目的基因，篩選Bt基因后可以利用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行大量擴(kuò)增。回答下列問(wèn)題：
(1)什么是引物？DNA復(fù)制時(shí)為什么需要引物？
提示　引物是指一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。在DNA擴(kuò)增時(shí)，DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此復(fù)制DNA時(shí)應(yīng)加入兩種引物。
(2)PCR擴(kuò)增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列嗎？
提示　不需要，只要知道Bt基因兩端的部分核苷酸序列即可(以便根據(jù)這部分序列合成兩種引物)。
(3)為檢測(cè)Bt基因在轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)錄，科研人員提取棉花細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程獲得總cDNA，通過(guò)PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地?cái)U(kuò)增出Bt基因的cDNA，原因是什么？
提示　引物是依據(jù)Bt毒蛋白基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或引物能與Bt基因的cDNA特異性結(jié)合)。
(4)PCR擴(kuò)增過(guò)程中的循環(huán)圖示與規(guī)律如圖所示，若一個(gè)Bt毒蛋白基因在PCR中經(jīng)過(guò)n輪循環(huán)，理論上得到多少個(gè)DNA分子？含引物的DNA分子多少個(gè)？含其中一種引物的DNA分子多少個(gè)？同時(shí)含兩種引物的DNA分子多少個(gè)？共需要消耗多少個(gè)引物？含不等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個(gè)？含等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個(gè)？
提示　經(jīng)過(guò)n輪循環(huán)，得到2n個(gè)DNA分子，含引物的DNA分子2n個(gè)，含其中一種引物的DNA分子數(shù)(2n－1)個(gè)，同時(shí)含兩種引物的DNA分子(2n－2)個(gè)，共需要消耗(2n＋1－2)個(gè)引物。含不等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子2n個(gè)，含等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子 (2n－2n)個(gè)。
(5)PCR擴(kuò)增Bt基因的過(guò)程中需要解旋酶嗎？并說(shuō)明理由。所需要的DNA聚合酶應(yīng)具有什么特點(diǎn)？
提示　不需要解旋酶，因?yàn)镻CR過(guò)程中，DNA雙鏈在高溫下即可完成解旋。由于PCR過(guò)程溫度較高，故所需要的DNA聚合酶應(yīng)具有耐高溫的特點(diǎn)。
2．據(jù)圖分析抗蟲(chóng)棉的培育過(guò)程。
(1)該過(guò)程中的目的基因是Bt基因，載體是Ti質(zhì)粒。
(2)基因工程中，往往使用兩種限制酶切割目的基因，這樣做的原因是什么？
提示　為了避免目的基因和載體的自身環(huán)化和反向連接。
(3)為了保證目的基因在受體細(xì)胞中能正確表達(dá)，對(duì)目的基因在質(zhì)粒中的插入位點(diǎn)有什么要求？
提示　目的基因應(yīng)插入啟動(dòng)子與終止子之間。
(4)該實(shí)例中，導(dǎo)入目的基因的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。為什么目的基因可以整合到染色體的DNA上？
提示　由于Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞且能整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，而目的基因又插入T－DNA，所以目的基因可以整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上。
(5)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時(shí)，能否僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上？為什么？
提示　一般不能。如果僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上，由于細(xì)胞分裂可能導(dǎo)致目的基因丟失，無(wú)法穩(wěn)定遺傳。
(6)該實(shí)例中，檢測(cè)目的基因是否成功表達(dá)的常見(jiàn)方法有哪些？
提示　抗原—抗體雜交、用棉葉飼喂棉鈴蟲(chóng)。
考向二　辨析基因工程的基本操作程序
3．(2023·湖北，4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通過(guò)DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否
D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落
答案　D
解析　若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；若用PvuⅠ酶切，重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；DNA凝膠電泳技術(shù)可以分離出不同大小的DNA片段，重組質(zhì)粒的大小與原質(zhì)粒不同，能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；SphⅠ的酶切位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯(cuò)誤。
4．(2024·江蘇揚(yáng)州中學(xué)高三模擬)土壤農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，Ti質(zhì)粒上的T－DNA片段轉(zhuǎn)入植物的基因組。利用農(nóng)桿菌以Ti質(zhì)粒作為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，下列相關(guān)敘述正確的是(　　)
A．目的基因應(yīng)插入T－DNA片段外，以防止破壞T－DNA
B．用Ca2＋處理農(nóng)桿菌，以利于其侵染植物細(xì)胞
C．Ti質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子，沒(méi)有雙螺旋結(jié)構(gòu)
D．可以用PCR技術(shù)檢測(cè)外源DNA是否整合到植物的染色體DNA上
答案　D
解析　在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，需要將目的基因插入到T－DNA片段上，有利于介導(dǎo)外源DNA整合到植物的染色體DNA上，A錯(cuò)誤；農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞不需要用Ca2＋處理，B錯(cuò)誤；Ti質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子，是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的DNA，具有雙螺旋結(jié)構(gòu)，C錯(cuò)誤。
1. (選擇性必修3 P67)基因工程：按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。
2．(選擇性必修3 P71)限制酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。
3．(選擇性必修3 P72)載體上有特殊的標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。
4．(選擇性必修3 P77)PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行，需提供DNA模板、2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。
5．(選擇性必修3 P77)真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸，引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸。
6．(選擇性必修3 P80)基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。基因表達(dá)載體是載體的一種，除目的基因、標(biāo)記基因外，還必須含有啟動(dòng)子、終止子等。啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類需要的蛋白質(zhì)。
7．(選擇性必修3 P81)轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。
8．(選擇性必修3 P81～82)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法；導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法是顯微注射法；導(dǎo)入微生物細(xì)胞的方法是Ca2＋處理法。
9．(選擇性必修3 P82)目的基因的檢測(cè)與鑒定：首先是分子水平的檢測(cè)，包括通過(guò)PCR等技術(shù)檢測(cè)棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測(cè)Bt基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA；從轉(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交，檢測(cè)Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲(chóng)蛋白等。其次，還需要進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。例如，通過(guò)采摘抗蟲(chóng)棉的葉片飼喂棉鈴蟲(chóng)來(lái)確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲(chóng)特性以及抗性的程度。
10．如圖為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)為：Hind Ⅲ(A↓AGCTT)、Pvit Ⅱ(CAG↓CTG)、KpnⅠ(G↓GTACC)、EcoRⅠ(G↓AATTC)、PstⅠ(CTGCA↓G)、BamHⅠ(G↓GATCC)。為使phb2基因(該基因序列不含圖中限制酶的識(shí)別序列)與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入Pvit Ⅱ和EcoRⅠ兩種不同限制酶的識(shí)別序列。將經(jīng)過(guò)這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用T4 DNA連接酶(填“E.coli DNA連接酶”或“T4 DNA連接酶”)。
課時(shí)精練
一、選擇題
1．(2024·泉州高三質(zhì)檢)像BclⅠ(－T↓GATCA－)、Bgl Ⅱ(－A↓GATCT－)、MboⅠ(－↓GATC－)這樣，識(shí)別序列不同，但能產(chǎn)生相同的黏性末端的一類限制酶被稱為同尾酶。如圖表示目的基因及質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)。選用不同的限制酶對(duì)質(zhì)粒和目的基因進(jìn)行切割，并用DNA連接酶進(jìn)行連接。下列分析錯(cuò)誤的是(　　)
選項(xiàng) 切割質(zhì)粒 切割目的基因 結(jié)果分析
A BclⅠ和BglⅡ BclⅠ和BglⅡ 形成的重組質(zhì)粒的堿基排列順序不一定相同
B BclⅠ和BglⅡ MboⅠ 切割后的質(zhì)粒不可自我環(huán)化，切割后的目的基因可以自我環(huán)化
C MboⅠ BclⅠ和BglⅡ 形成的重組質(zhì)粒可被MboⅠ再次切開(kāi)，但可能無(wú)法被BclⅠ和BglⅡ再次切開(kāi)
D MboⅠ MboⅠ 切割后的質(zhì)粒可以自我環(huán)化，切割后的目的基因也可以自我環(huán)化
答案　B
解析　切割質(zhì)粒和切割目的基因均用BclⅠ和BglⅡ時(shí)，切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，形成重組質(zhì)粒時(shí)目的基因可能反向連接，形成的堿基排列順序不一定相同，A正確；用BclⅠ和BglⅡ切割質(zhì)粒，切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，切割后的質(zhì)粒可能自我環(huán)化，B錯(cuò)誤；切割質(zhì)粒用MboⅠ，切割目的基因用BclⅠ和Bgl Ⅱ，產(chǎn)生相同的黏性末端，形成的重組質(zhì)粒中有MboⅠ的切割位點(diǎn)，但不一定有BclⅠ和Bgl Ⅱ的切割位點(diǎn)，因此形成的重組質(zhì)粒可被MboⅠ再次切開(kāi)，但可能無(wú)法被BclⅠ和Bgl Ⅱ再次切開(kāi)，C正確；切割質(zhì)粒用MboⅠ，切割目的基因用MboⅠ，切割后的質(zhì)粒和目的基因均可以自我環(huán)化，D正確。
2．(2023·新課標(biāo)，6)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。
下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是(　　)
A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA連接酶連接
B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA連接酶連接
C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA連接酶連接
D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA連接酶連接
答案　C
解析　酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4 DNA連接酶連接，A不符合題意；質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能連接，B不符合題意；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達(dá)載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C符合題意；若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達(dá)載體缺少標(biāo)記基因，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的篩選，D不符合題意。
3．(2023·重慶，12)某小組通過(guò)PCR(假設(shè)引物長(zhǎng)度為8個(gè)堿基短于實(shí)際長(zhǎng)度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進(jìn)行酶切(下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達(dá)載體。下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．其中一個(gè)引物序列為5′－TGCGCAGT－3′
B．步驟①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C．用步驟①的酶對(duì)載體進(jìn)行酶切，至少獲得了2個(gè)片段
D．酶切片段和載體連接時(shí)，可使用E.coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶
答案　B
解析　由于引物只能引導(dǎo)子鏈從5′端到3′端延伸，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，其中一個(gè)引物序列為5′－TGCGCAGT－3′，A正確；根據(jù)三種酶的酶切位點(diǎn)，左側(cè)的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右邊的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B錯(cuò)誤；用步驟①的限制酶NheⅠ和限制酶CfoⅠ對(duì)載體(環(huán)狀DNA)進(jìn)行酶切，切割之后至少獲得了2個(gè)片段，C正確；E.coli DNA連接酶只能連接黏性末端，T4 DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端，圖中酶切后形成的是黏性末端，酶切片段和載體連接時(shí)，可使用E.coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶，D正確。
4．(2024·鎮(zhèn)江高三二模)轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分離剔除法和重組剔除法。分離剔除法是在轉(zhuǎn)基因時(shí)將目的基因和標(biāo)記基因分別構(gòu)建在兩個(gè)Ti質(zhì)粒上，通過(guò)共轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因植物后讓其自交得到不含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因個(gè)體；重組剔除法利用Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)，Cre酶能有效剔除重組載體中含有標(biāo)記基因的序列，只留下一個(gè)LoxP位點(diǎn)，具體原理如圖。下列說(shuō)法不正確的是(　　)
A．利用分離剔除法時(shí)，目的基因和標(biāo)記基因都應(yīng)插到Ti質(zhì)粒的T－DNA序列內(nèi)部
B．分離剔除時(shí)目的基因和標(biāo)記基因插到植物細(xì)胞的同源染色體或非同源染色體上均可成功
C．上述重組載體中啟動(dòng)子1在農(nóng)桿菌中可發(fā)揮作用，而在植物細(xì)胞中不能發(fā)揮作用
D．經(jīng)重組剔除后的標(biāo)記基因，因沒(méi)有啟動(dòng)子而無(wú)法啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄
答案　C
解析　Ti質(zhì)粒的T－DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，所以利用分離剔除法時(shí)，目的基因和標(biāo)記基因都應(yīng)插到Ti質(zhì)粒的T－DNA序列內(nèi)部，進(jìn)而成功整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，A正確；分離剔除時(shí)目的基因和標(biāo)記基因插到植物細(xì)胞的同源染色體或非同源染色體上最終均可獲得不含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因個(gè)體，即均可成功，B正確；重組剔除時(shí)，Cre酶基因應(yīng)該在植物細(xì)胞中表達(dá)，故上述重組載體中啟動(dòng)子1在農(nóng)桿菌中不能發(fā)揮作用，而在植物細(xì)胞中能發(fā)揮作用，C錯(cuò)誤；由圖可知，經(jīng)重組剔除后的標(biāo)記基因沒(méi)有啟動(dòng)子，無(wú)法啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，D正確。
5．如圖是培育抗除草劑玉米的技術(shù)路線圖，含有內(nèi)含子的報(bào)告基因只能在真核生物中正確表達(dá)，其產(chǎn)物能催化無(wú)色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色。轉(zhuǎn)化過(guò)程中愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，會(huì)導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。下列相關(guān)敘述正確的是(　　)
A．過(guò)程①中除草劑抗性基因插入T－DNA中，導(dǎo)致T－DNA片段失活
B．過(guò)程①用兩種限制酶就可防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化
C．過(guò)程②用Ca2＋處理，使農(nóng)桿菌細(xì)胞壁通透性改變，使其處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)
D．過(guò)程③應(yīng)在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)K
答案　D
解析　過(guò)程①中除草劑抗性基因插入T－DNA中，不會(huì)導(dǎo)致T－DNA片段失活，A錯(cuò)誤；過(guò)程①使用兩種限制酶，且這兩種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同，才可以防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，B錯(cuò)誤；過(guò)程③應(yīng)在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)K，除草劑是用來(lái)檢測(cè)目的基因是否正確表達(dá)，物質(zhì)K是用來(lái)檢測(cè)目的基因有沒(méi)有導(dǎo)入植物細(xì)胞中，加入除草劑可保留轉(zhuǎn)化的愈傷組織和附著農(nóng)桿菌但未轉(zhuǎn)化的愈傷組織，其中變藍(lán)的為轉(zhuǎn)化的愈傷組織，D正確。
6．(2024·西安高三一模)我國(guó)科學(xué)家利用XbaⅠ和SacⅠ兩種限制酶，并運(yùn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將富含賴氨酸的蛋白質(zhì)編碼基因(含678 bp)導(dǎo)入某植物細(xì)胞，再經(jīng)植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株，使賴氨酸的含量比對(duì)照組明顯提高，如圖表示相關(guān)培育過(guò)程(質(zhì)粒的其他部位和目的基因內(nèi)部均無(wú)XbaⅠ、SacⅠ、Hind Ⅲ的識(shí)別位點(diǎn))，下列說(shuō)法不正確的是(　　)
A．一個(gè)內(nèi)含目的基因的模板DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增4次，共產(chǎn)生8個(gè)等長(zhǎng)DNA分子
B．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的常用方法
C．植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基需添加卡那霉素以便篩選轉(zhuǎn)基因植株
D．使用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重組質(zhì)粒后能得到1 500 bp左右的片段
答案　C
解析　一個(gè)內(nèi)含目的基因的模板DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增4次共產(chǎn)生等長(zhǎng)的DNA分子數(shù)24－2×4＝8(個(gè))，A正確；因?yàn)椴迦胫参锛?xì)胞染色體上的是質(zhì)粒的T－DNA，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，導(dǎo)入成功的植物細(xì)胞對(duì)卡那霉素?zé)o抗性，C錯(cuò)誤；根據(jù)切割目的基因的限制酶在質(zhì)粒上的切割位點(diǎn)，可知由于重組質(zhì)粒上移除1 900 bp而補(bǔ)充了含678 bp的目的基因，加上未移除的822 bp，所以用SacⅠ和Hind Ⅲ切割重組質(zhì)粒后，可得到822＋678＝1 500(bp)左右的新片段，D正確。
7．自然界中很少出現(xiàn)藍(lán)色的花，天然藍(lán)色花產(chǎn)生的主要原因是花瓣細(xì)胞液泡中花青素在堿性條件下顯藍(lán)色。我國(guó)科學(xué)家利用鏈霉菌的靛藍(lán)合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構(gòu)建基因表達(dá)載體(如圖)，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入白玫瑰中，在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍(lán)。
下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．上述獲得藍(lán)色玫瑰的方案中不需要轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因
B．將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C．同時(shí)使用SpeⅠ和SacⅠ能提高idgS基因和Ti質(zhì)粒的重組效率
D．sfp和idgS基因具有各自的啟動(dòng)子，表達(dá)是相互獨(dú)立進(jìn)行的
答案　B
解析　靛藍(lán)能夠穩(wěn)定顯色，不受pH的影響，故本題方案中不需要轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因，A正確；將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，則會(huì)將終止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B錯(cuò)誤。
8．(2024·莆田高三質(zhì)檢)如圖表示利用基因工程生產(chǎn)黃金大米時(shí)所構(gòu)建的基因表達(dá)載體，其中基因Ⅰ和基因Ⅱ是β－胡蘿卜素合成所必需的基因，基因Ⅲ表達(dá)的蛋白質(zhì)可使細(xì)菌在特殊培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。下列分析錯(cuò)誤的是(　　)
A．A序列是該基因表達(dá)載體的復(fù)制原點(diǎn)
B．基因Ⅲ的作用是便于篩選該重組質(zhì)粒
C．β－胡蘿卜素是檢測(cè)基因Ⅰ、基因Ⅱ表達(dá)的關(guān)鍵指標(biāo)之一
D．圖中基因插入質(zhì)粒時(shí)需要限制酶和DNA連接酶
答案　A
解析　由題圖可知，每個(gè)基因前都存在A序列，可推測(cè)該序列應(yīng)為啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別與結(jié)合的位點(diǎn)，一個(gè)質(zhì)粒一般只有一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，A錯(cuò)誤。
9．(2024·南京高三聯(lián)考)某課題組為得到青蒿素產(chǎn)量高的新品系，使青蒿素合成過(guò)程中的某一關(guān)鍵酶基因fps在野生青蒿中過(guò)量表達(dá)，其過(guò)程如圖所示。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．也可用PCR技術(shù)直接擴(kuò)增RNA來(lái)獲取目的基因
B．酶1、酶2和酶3作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵
C．本過(guò)程中，可以采用一種、兩種甚至四種酶2
D．通過(guò)抗原—抗體雜交技術(shù)可檢測(cè)fps基因是否表達(dá)出蛋白質(zhì)
答案　A
解析　PCR技術(shù)不能直接擴(kuò)增RNA來(lái)獲取目的基因，A錯(cuò)誤；據(jù)圖可知，酶1表示逆轉(zhuǎn)錄酶，酶2表示限制酶，酶3表示DNA連接酶，酶1、酶2和酶3作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵，B正確；不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端，因此為了成功構(gòu)建表達(dá)載體，可以采用一種、兩種甚至四種酶2切割含fps基因的DNA片段和質(zhì)粒a，C正確。
10．(2024·徐州高三質(zhì)檢)圖甲為培育轉(zhuǎn)基因生物時(shí)選用的載體，圖乙是含有目的基因的一段DNA序列，圖中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．若通過(guò)PCR技術(shù)提取該目的基因，應(yīng)該選用引物a和引物c
B．構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)可選用BclⅠ和Hind Ⅲ這兩種限制酶
C．若將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，需用Ca2＋處理大腸桿菌
D．只利用含四環(huán)素的培養(yǎng)基就可以直接篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的受體細(xì)胞
答案　D
解析　根據(jù)圖甲可知，BamHⅠ會(huì)導(dǎo)致兩種抗性基因都被破壞，所以不宜選用BamHⅠ，為防止目的基因自身環(huán)化，可選用BclⅠ和Hind Ⅲ兩種限制酶切割，B正確；由于選擇BclⅠ和Hind Ⅲ這兩種限制酶，破壞了氨芐青霉素抗性基因，但沒(méi)有破壞四環(huán)素抗性基因，因此應(yīng)該先用含四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出含有基因表達(dá)載體和普通質(zhì)粒的大腸桿菌，再用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，D錯(cuò)誤。
二、非選擇題
11．(2021·全國(guó)乙，38)用重組DNA技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過(guò)程中要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)如圖所示。
回答下列問(wèn)題：
(1)常用的DNA連接酶有E.coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶，上圖中 酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA連接酶連接，上圖中 切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。
(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是 。
(3)重組DNA技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中 ；質(zhì)粒DNA分子上有 ，便于外源DNA的插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是
。
(4)表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指 。
答案　(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoR Ⅴ　(2)磷酸二酯鍵　(3)自我復(fù)制　一至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)　用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞　(4)位于基因上游的一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，是RNA聚合酶識(shí)別及結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程
解析　(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoR Ⅴ切割形成的是平末端，E.coli DNA連接酶來(lái)源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來(lái)，而T4 DNA連接酶來(lái)源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA連接酶連接，除了這兩種限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoR Ⅴ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶將兩個(gè)DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。(3)質(zhì)粒是小型環(huán)狀的DNA分子，常作為基因表達(dá)的載體，首先質(zhì)粒上含有復(fù)制原點(diǎn)，能保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中自我復(fù)制。質(zhì)粒DNA分子上有一個(gè)至多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，便于目的基因的導(dǎo)入。質(zhì)粒上的標(biāo)記基因便于重組DNA分子的篩選，具體做法是用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞。(4)啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類需要的蛋白質(zhì)。
12．(2021·福建，21)微生物吸附是重金屬?gòu)U水的處理方法之一。金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在于動(dòng)植物中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的作用。科研人員將棗樹(shù)的MT基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建工程菌。回答下列問(wèn)題：
(1)根據(jù)棗樹(shù)的MT cDNA的核苷酸序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物(圖1甲)，通過(guò)PCR擴(kuò)增MT基因。已知A位點(diǎn)和B位點(diǎn)分別是起始密碼子和終止密碼子對(duì)應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為 。
(2)本實(shí)驗(yàn)中，PCR所用的DNA聚合酶擴(kuò)增出的MT基因的末端為平末端。由于載體E只有能產(chǎn)生黏性末端的酶切位點(diǎn)，需借助中間載體P將MT基因接入載體E。載體P和載體E的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切序列如圖1乙所示。
①選用 酶將載體P切開(kāi)，再用 (填“T4 DNA”或“E.coli81 DNA”)連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。
②載體P′不具有表達(dá)MT基因的 和 。選用 酶組合對(duì)載體P′和載體E進(jìn)行酶切，將切下的MT基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連接，將得到的混合物導(dǎo)入到用 離子處理的大腸桿菌，篩出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表達(dá)量如圖2所示。結(jié)果仍無(wú)法說(shuō)明已經(jīng)成功構(gòu)建能較強(qiáng)吸附廢水中重金屬的MT工程菌，理由是
。
答案　(1)引物1和引物4　(2)①EcoR Ⅴ　T4 DNA　②啟動(dòng)子　終止子　XhoⅠ和PstⅠ　鈣　(3)尚未在個(gè)體生物學(xué)水平上對(duì)MT工程菌吸附重金屬的能力進(jìn)行鑒定
解析　(1)密碼子位于mRNA上，是決定氨基酸的三個(gè)相鄰堿基，起始密碼子和終止密碼子分別控制翻譯的開(kāi)始和結(jié)束，故為保證基因的正常表達(dá)，一對(duì)引物應(yīng)分別位于位點(diǎn)A和位點(diǎn)B的兩側(cè)，故選擇引物1和引物4。(2)①M(fèi)T基因的末端為平末端，故需要用EcoR Ⅴ或SmaⅠ切割載體P，但后續(xù)需進(jìn)一步將重組載體P′和載體E連接，故需將MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，故選EcoR Ⅴ將載體P切開(kāi)；由于E.coli81 DNA連接酶只能連接黏性末端，而T4 DNA連接酶可以連接平末端，MT基因的末端為平末端，故需要用T4 DNA連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。②由圖可知，載體P′不含有表達(dá)MT基因的啟動(dòng)子和終止子；為避免自身環(huán)化和反向連接，可選用兩種酶切割兩種載體，據(jù)圖可知，載體P′和載體E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶的識(shí)別序列，故可選用限制酶XhoⅠ和PstⅠ進(jìn)行酶切；將目的基因?qū)氪竽c桿菌的方法是鈣離子處理法。(3)由于尚未在個(gè)體生物學(xué)水平上對(duì)MT工程菌吸附重金屬的能力進(jìn)行鑒定，故即使MT工程菌的MT蛋白相對(duì)含量較高，也不能說(shuō)明已經(jīng)成功構(gòu)建能較強(qiáng)吸附廢水中重金屬的MT工程菌。
13．科研人員通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出超量表達(dá)P蛋白的轉(zhuǎn)基因甜玉米。在超量表達(dá)P基因載體的構(gòu)建中，含P基因的DNA片段以及Ti質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)如圖所示，其中強(qiáng)啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
限制酶 識(shí)別序列
ClaⅠ 5′AT↓CGAT3′
BamHⅠ 5′G↓GATCC3′
Hind Ⅲ 5′A↓AGCTT3′
EcoRⅠ 5′G↓AATTC3′
KpnⅠ 5′GGTAC↓C3′
SacⅠ 5′GAGCT↓C3′
(1)以RNA為模板，通過(guò)RT—PCR技術(shù)可獲取P基因。進(jìn)行RT—PCR時(shí)，一般要加入4種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而不是脫氧核苷酸，其原因是
，
同時(shí)需加入的酶有 。為了特異性擴(kuò)增P基因序列，需根據(jù) 設(shè)計(jì)特異性引物。
(2)在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選用的限制酶是 和 ，這樣操作不僅使P基因在玉米植株中超量表達(dá)，還可利用T－DNA的 特性，最終使P基因 。
(3)將農(nóng)桿菌液浸泡過(guò)的玉米愈傷組織進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中需加入 ，篩選出的愈傷組織經(jīng)再分化過(guò)程形成叢芽，最終獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株。
(4)對(duì)轉(zhuǎn)基因再生玉米植株進(jìn)行鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，有些植株雖有P基因，但幾乎沒(méi)有P蛋白，造成該現(xiàn)象的原因可能有
。
答案　(1)dNTP 能為子鏈延伸過(guò)程提供能量和原料(或脫氧核苷酸只能作為原料而不能提供能量)　逆轉(zhuǎn)錄酶和耐高溫的DNA聚合酶　P基因兩端的堿基序列　(2)BamHⅠ　SacⅠ　可轉(zhuǎn)移　整合到玉米細(xì)胞染色體DNA上　(3)潮霉素　(4)基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中強(qiáng)啟動(dòng)子可能丟失或斷裂，未能真正轉(zhuǎn)化成功；雖然轉(zhuǎn)化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表達(dá)
解析　(2)在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，要想使P基因在玉米植株中超量表達(dá)，切割目的基因時(shí)需要把強(qiáng)啟動(dòng)子和P基因連在一起切割下來(lái)，因此需要用到BamHⅠ切割，另一種酶可以用KpnⅠ或者SacⅠ，在質(zhì)粒中，KpnⅠ識(shí)別序列在BamHⅠ識(shí)別序列的左側(cè)，終止子在右側(cè)，如果用KpnⅠ切割，目的基因和質(zhì)粒連接后，目的基因不在啟動(dòng)子和終止子之間，將來(lái)無(wú)法轉(zhuǎn)錄，因此在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選用的限制酶是BamHⅠ和SacⅠ。(3)據(jù)圖可知，利用Ti質(zhì)粒的T－DNA可將目的基因(P基因)轉(zhuǎn)移到玉米細(xì)胞的染色體DNA上，T－DNA中含有標(biāo)記基因潮霉素抗性基因，因此培養(yǎng)基中需加入潮霉素以便篩選轉(zhuǎn)基因愈傷組織。(4)基因能控制蛋白質(zhì)的合成，該過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。有些植株雖有P基因，但幾乎沒(méi)有P蛋白，造成該現(xiàn)象的原因可能有：基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中強(qiáng)啟動(dòng)子可能丟失或斷裂，未能真正轉(zhuǎn)化成功；雖然轉(zhuǎn)化成功，但是P基因保持沉默，不能有效表達(dá)等。

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