資源簡介

2024年高考生物壓軸題訓練： 生物技術與工程
命題預測 生物技術是高考中的重要板塊，包括基因工程、細胞工程以及發酵工程、PCR技術應用廣泛，可用于新冠病毒的核酸檢測等基本內容，是近幾年高考試題的命題熱點，在考試中經常會與細胞代謝、基因等進行綜合考查，難度從簡單到困難都有所涉及，需要考生在復習中認真對待。 預計2024年命題會繼續在上述幾個方面進行。通過近幾年的高考題研究發現，生物高考越來越重視在現實情景中考查考生運用知識解決實際問題的能力。從這個角度看，生物技術和工程問題一直是考查的重點內容。這是因為，現代生物學的實際問題，不論是科學研究還是生產實踐，都要通過生物技術和生物工程解決。而生物技術和生物工程又是建立在生命科學原理的基礎上的。這樣就形成了生物科學一生物技術和工程一科學研究和生產實踐一條主線。生物技術和工程起到連接科學原理和實際問題的橋梁的作用。明白了這一部分的地位，考生的備考策略就要從生物科學原理出發，理解生物技術與工程，再利用這些技術解決實際問題。
高頻考法 （1）微生物的選擇培養、鑒定和計數 （2）植物細胞工程和動物細胞工程的比較 （3）限制酶的選取與基因表達載體的構建 （4）分析基因編輯方案，學會科學探究、發現并解決問題
（密押典例+思維建模，學會壓軸題）
密押典例 01 微生物的選擇培養、鑒定和計數
(2022·廣東高考)研究深海獨特的生態環境對于開發海洋資源具有重要意義。近期在“科學號”考察船對中國南?？瓶贾校袊茖W家采集了某海域1 146米深海冷泉附近沉積物樣品，分離、鑒定得到新的微生物菌株并進一步研究了其生物學特性。
回答下列問題：
(1)研究者先制備富集培養基，然后采用________________法滅菌，冷卻后再接入沉積物樣品，28 ℃厭氧培養一段時間后，獲得了含擬桿菌的混合培養物，為了獲得純種培養物，除了稀釋涂布平板法，還可采用____________________法。據圖分析，擬桿菌新菌株在以__________________為碳源時生長狀況最好。
(2)研究發現，將采集的樣品置于各種培養基中培養，仍有很多微生物不能被分離篩選出來，推測其原因可能是____________________________________________________________
__________________________________________________________________。(答一點即可)
(3)藻類細胞解體后的難降解多糖物質，通常會聚集形成碎屑沉降到深海底部。從生態系統組成成分的角度考慮，擬桿菌對深海生態系統碳循環的作用可能是________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)深海冷泉環境特殊，推測此環境下生存的擬桿菌所分泌的各種多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能還有____________________________________________________。
【答案】　(1)高壓蒸汽滅菌　平板劃線　纖維素　(2)某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物質才能生存(或某些微生物只有在深海冷泉的特定環境中才能存活)　(3)擬桿菌作為分解者，將沉降到深海底部的難降解多糖物質分解為無機物，歸還到無機環境中，有利于碳循環的順利進行　(4)耐低溫
【解析】　(1)富集培養基通常采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌?？梢圆捎孟♂屚坎计桨宸ɑ蚱桨鍎澗€法對微生物進行分離純化。分析題圖可知，在以纖維素為碳源的培養基中細胞數最多，故擬桿菌新菌株在以纖維素為碳源時生長狀況最好。(2)深海冷泉中某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物質才能生存，故將采集的樣品置于各種培養基中培養，仍有很多微生物不能被分離篩選出來。(3)擬桿菌為異養生物，其作為深海生態系統中的分解者，能將沉降到深海底部的難降解多糖物質分解為無機物，歸還到無機環境中，有利于碳循環的順利進行。(4)深海冷泉溫度較低，故生活在其中的擬桿菌所分泌的各種多糖降解酶應具有耐低溫的特性，這樣才能高效降解多糖，以滿足擬桿菌正常的生命活動。
思維建模　
解題關鍵—破譯新情境
情境信息 化新為熟
題圖 擬桿菌新菌株在以不同物質為碳 擬桿菌可降解難降解的多糖物質：纖維素、木
信息 源時的細胞數：纖維素>木聚糖>果膠>甘露聚糖>淀粉 聚糖、果膠等；擬桿菌新菌株在以纖維素為碳源時生長狀況最好
題肢信息 設問(1)：為了獲得純種培養物 純種培養需利用選擇培養基篩選，接種方法有稀釋涂布平板法和平板劃線法
設問(2)：將采集的樣品置于各種培養基中培養，仍有很多微生物不能被分離篩選出來 深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物質才能生存(或需要在深海冷泉的特定環境中才能存活)
設問(3)：從生態系統組成成分的角度考慮 擬桿菌為異養生物，可作為該生態系統的分解者
設問(4)：深海冷泉環境特殊 深海冷泉附近溫度較低，此環境下生存的擬桿菌所分泌的各種酶，都應具有耐低溫的特性
密押典例 02 植物細胞工程和動物細胞工程的比較
(2023·山東高考)利用植物細胞培養技術在離體條件下對單個細胞或細胞團進行培養使其增殖，[信息①]可獲得植物細胞的某些次生代謝物。[信息②]下列說法正確的是(　 )
A．利用該技術可獲得某些無法通過化學合成途徑得到的產物
B．植物細胞體積小，故不能通過該技術進行其產物的工廠化生產
C．次生代謝物是植物所必需的，但含量少，應選擇產量高的細胞進行培養
D．該技術主要利用促進細胞生長的培養條件提高單個細胞中次生代謝物的含量
【答案】　A
【解析】　有些產物不能或難以通過化學合成途徑得到，但可利用植物細胞培養技術得到，A正確；利用植物細胞培養技術在離體條件下對單個細胞或細胞團進行培養使其增殖，可獲得植物細胞的某些次生代謝物，故可通過該技術進行植物細胞產物的工廠化生產，B錯誤；一般認為次生代謝物不是植物基本的生命活動所必需的，其含量少，可以通過增加細胞的數量來增加次生代謝物的產量，C錯誤；該技術主要利用促進細胞分裂的培養條件，提高多個細胞中次生代謝物的總含量，而不能提高單個細胞中次生代謝物的含量，D錯誤。
思維建模　
解題關鍵—準確理解概念
信息 概念遷移
信息① 結合植物細胞培養的概念，該技術獲得細胞代謝產物可利用發酵工程等手段實現工廠化生產，且復雜的細胞代謝產物化學途徑可能無法合成；該技術也是通過細胞大量增殖獲取產物，而不是利用單個細胞的產量增加
信息② 聯系次生代謝物的概念，明確其不是植物生長所必需的
密押典例 03 植物細胞工程和動物細胞工程的比較
(2023·天津高考，有改動)根據不同動物的培育圖示分析，下列敘述正確的是(　 )
A．子代動物遺傳性狀和受體動物完全一致
B．過程1需要MⅡ期去核卵母細胞
C．過程2可以大幅改良動物性狀
D．過程2為過程3提供了量產方式，過程3為過程1、2提供了改良性狀的方式
【答案】　D
【解析】　子代動物的遺傳性狀與供體基本一致，但與受體動物無關，A錯誤。核移植過程中需要處于MⅡ期的去核卵母細胞，而過程1是培育試管動物，需要培育到適宜時期(桑葚胚或囊胚等時期)進行胚胎移植，B錯誤。過程2得到的是克隆動物，是無性生殖的一種，不能大幅改良動物性狀，C錯誤。過程2克隆技術可得到大量同種個體，為過程3提供了量產方式；過程3是轉基因技術，轉基因可導入外源優良基因，為過程1、2提供了改良性狀的方式，D正確。
思維建模　
解題關鍵—科學思維
密押典例 04 限制酶的選取與基因表達載體的構建
(2022·山東高考)某種類型的白血病由蛋白P引發，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通
過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機理，需構建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P；FLAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質結合，但不影響P或P△的功能。
(1)為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是__________________________________。為使PCR產物能被限制酶切割，需在引物上添加相應的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR擴增得到的P基因經酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導入細胞后，融合基因轉錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因對應的氨基酸序列與P不同。據圖甲分析，出現該問題的原因是_________________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________。可在修改擴增P基因時使用帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是_____________________________________。
(3)融合蛋白表達成功后，將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照圖乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經含FLAG抗體的介質，分離出與介質結合的物質并用UBC抗體檢測，檢測結果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③組結果的差異推測，藥物A的作用是_______________________________________________________________
__________________________________________________________________________；由②④組或③⑤組的差異推測，P△中缺失的特定序列的作用是______________________________________
____________________________________________________________________________________。
(4)根據以上結果推測，藥物A治療該病的機理是_______________________________________
___________________________________________________________________________________。
【答案】　(1)能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對、短單鏈核酸　5′端　(2)P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRⅠ識別序列的最后兩個堿基編碼同一個氨基酸，導致mRNA的密碼子被錯位讀取　在引物中的EcoRⅠ識別序列3′端添加一個堿基　(3)增強FLAG-P與UBC的結合　參與P與UBC的結合　(4)藥物
A通過增強P與UBC結合促進P降解
【解析】　(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，因此設計擴增P基因的引物需要滿足的條件是能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對，并且是短單鏈核酸。DNA聚合酶延伸時，是將脫氧核苷酸添加到引物的3′端，為了不破壞目的基因，該限制酶識別序列應添加在引物的5′端。(2)融合基因轉錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因對應的氨基酸序列與P不同，說明P基因翻譯時出錯。由圖甲可以看出，P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRⅠ識別序列的最后兩個堿基編碼同一個氨基酸，導致mRNA的密碼子被錯位讀取。解決該問題的修改方案是在引物中的EcoRⅠ識別序列3′端添加一個堿基，使EcoRⅠ識別序列不影響P基因的正常翻譯。(3)①組僅添加UBC；②組添加UBC和FLAG-P；③組添加UBC、FLAG-P和藥物A；④組添加UBC和FLAG-P△；⑤組添加UBC、FLAG-P△和藥物A。按題中所述處理后，①組沒出現雜交帶，②③組出現雜交帶，且③組雜交帶更加明顯，說明藥物A的作用是增強FLAG-P與UBC的結合。②④組或③⑤組的差異在于②③組含有FLAG-P，出現雜交帶，④⑤組含有FLAG-P△，沒出現雜交帶，據此推測P△中缺失的特定序列的作用是參與P與UBC的結合。(4)根據(3)的分析推測，藥物A通過增強P與UBC結合促進P降解，達到治療該病的目的。
思維建?！?br/>解題關鍵—破譯新情境
情境信息 化新為熟
題干信息 某種類型的白血病由蛋白P引發，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用
FLAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質結合 融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△可與FLAG抗體特異性結合，被篩選或識別出來
題肢信息 設問(1)：為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因 引物是一小段能與DNA模板鏈互補的短單鏈核酸；DNA延伸方向是模板鏈的3′端→5′端
圖甲：DNA編碼鏈為轉錄時所用模板鏈的互補鏈 DNA編碼鏈中核苷酸序列與該基因轉錄的mRNA序列一致(RNA中U取代DNA中的T)
設問(3)：各組樣品混勻后分別流經含FLAG抗體的介質，分離出與介質結合的物質并用 UBC抗體檢測 只有同時含有FLAG-P和UBC的復合物才能與 FLAG 抗體和 UBC 抗體特異性結合，即檢測結果中有顯示
密押典例 05 分析基因編輯方案，學會科學探究、發現并解決問題
(2023·天津高考，有改動)基因工程：制備新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉發酵，則應導入多步分解淀粉所需的多種酶，[信息①]推測這些酶生效的場所應該是________(填“細胞內”或“細胞外”)。
(2)同源切割是一種代替限制酶、DNA連接酶將目的基因導入基因表達載體的方法。當目的基因兩側的小段序列與基因表達載體上某序列相同時，就可以發生同源切割，將目的基因直接插入。[信息②]研究人員運用同源切割的方式，在目的基因兩端加上一組同源序列A、B，已知酵母菌體內DNA有許多A－B序列位點可以同源切割插入。構建完成的目的基因結構如圖，則應選擇圖中的引物________對目的基因進行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因(UGA)常用作標記基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸轉化為對酵母菌有毒的物質。[信息③]
Ⅰ.導入目的基因的酵母菌應在____________的培養基上篩選培養。由于需要導入多種酶基因，需要多次篩選，因此在導入一種目的基因后，要切除UGA基因，再重新導入。研究人員在UGA基因序列兩端加上酵母菌DNA中不存在的同源C、C′序列，以便對UGA基因進行切除。C、C′的序列方向將影響切割時同源序列的配對方式，進而決定DNA片段在切割后是否可以順利重連，如圖，則應選擇方式________進行連接。
Ⅱ.切去UGA基因的酵母菌應在________的培養基上篩選培養。
(4)綜上，目的基因、標記基因和同源序列在導入酵母菌的基因表達載體上的排列方式應該如圖________。
【答案】　(1)細胞外　(2)P1和P6　(3)Ⅰ.缺乏尿嘧啶　2　Ⅱ.含有5-氟乳清酸　(4)3
【解析】　(1)由于酵母菌不能吸收淀粉，所以導入分解淀粉的酶發揮作用的場所在細胞外。(2)根據題干信息可知，當目的基因兩側的小段序列與基因表達載體上某序列相同時，就可以發生同源切割，將目的基因直接插入，要保證目的基因兩側的小段序列與基因表達載體上某序列相同(都含有同源序列A、B)，需要選擇P1和P6這對引物進行PCR。(3)Ⅰ.選擇了尿嘧啶合成基因(UGA)作標記基因，則應該將酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培養基上培養，如果導入成功，則形成菌落；如果沒有導入，則缺乏尿嘧啶，不能生存；方式一，C和C′方向相反，如果切割，則末端在一條鏈上，不能連接，所以選擇方式二，連接方向相同，切割后形成末端，便于連接。Ⅱ.由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸轉化為對酵母菌有毒的物質，所以應該在含有5-氟乳清酸的培養基上篩選切去UGA基因的酵母菌，如果切割成功，則不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，則會產生有毒物質，不能形成菌落。(4)根據前面分析，C和C′的中間插入UGA，A和B之間插入的目的基因，所以圖3正確。
思維建?！?br/>解題關鍵—破譯新情境
一、單選題
1．在某地的農業生產中，研究人員發現了一種廣泛使用的除草劑在土壤中不易被降解，且長期使用會導致土壤被污染。為修復被該除草劑污染的土壤，可按下圖程序選育能降解該除草劑的細菌（已知該除草劑是一種含氮有機物，在水中溶解度低，含一定量該除草劑的培養基不透明）。下列相關敘述正確的是（ ）
A．只有長期使用該除草劑的土壤中才含有能降解該除草劑的細菌
B．篩選能降解該除草劑的細菌的培養基中該除草劑是唯一的氮源
C．圖中操作Ⅰ的接種方法為平板劃線法，該方法可用于細菌計數
D．經過一段時間的培養，培養皿中應該只存在有透明圈的菌落
【答案】B
【分析】微生物常用的接種方法：稀釋涂布平板法和平板劃線法。
【詳解】A、土壤中才含有能降解該除草劑的細菌，是基因突變的結果，不是長期使用除草劑的結果，A錯誤；
B、篩選能降解該除草劑的細菌的培養基中該除草劑是唯一的氮源，B正確；
C、平板劃線法不能用于細菌計數，稀釋涂布平板法可以，C錯誤；
D、經過一段時間的培養，培養皿中也會存在無透明圈的菌落，D錯誤。
故選B。
2．科學家用紫外線照射板藍根原生質體，使其部分染色體丟失，將處理后的板藍根原生質體與油菜原生質體融合，培育出了只含一條板藍根染色體和油菜全部染色體的非對稱雜種植株，該過程運用了非對稱細胞融合技術。下列說法正確的是（ ）
A．非對稱細胞融合技術提高了植物細胞的全能性，屬于細胞工程
B．非對稱細胞融合技術降低了不同物種間基因表達的干擾程度
C．原生質體由細胞膜、液泡膜及兩者之間的細胞質組成
D．融合原生質體需放在無菌水中培養，以防雜菌污染
【答案】B
【分析】非對稱細胞融合技術常指利用某種外界因素（如射線）輻照某一細胞原生質體，選擇性地破壞其細胞核，使其染色體片段化并喪失再生能力，再進行與另一原生質體融合，紫外線作用于根細胞原生質體，使染色體片段化，發生了染色體變異，說明非對稱細胞融合技術的原理之一是染色體變異（染色體數目變
異和染色體結構變異）。
【詳解】A、非對稱融合過程中部分染色體丟失（斷裂），所以會降低植物細胞的全能性，A錯誤；
B、非對稱融合過程中部分染色體丟失，從而降低了不同物種間基因表達的干擾程度，B正確；
C、原生質體是用纖維素酶和果膠酶去除細胞壁后的植物細胞，而由細胞膜、液泡膜及兩者之間的細胞質組成的結構稱為原生質層，C錯誤；
D、原生質體放在無菌水中會吸水漲破，應放到等滲的溶液中，保持原生質體的完整性，D錯誤。
故選B。
3．人絨毛膜促性腺激素（HCG）是女性懷孕后胎盤滋養層細胞分泌的一種糖蛋白，制備抗HCG單克隆抗體可用于早孕的診斷。下圖是抗HCG單克隆抗體制備流程示意圖，相關敘述正確的是（　?。?br/>A．過程①常用聚乙二醇誘導細胞融合，利用了細胞膜的選擇透過性
B．過程②篩選得到的雜交瘤細胞可直接用于生產單克隆抗體
C．過程③采用抗原-抗體雜交反應進行特定雜交瘤細胞的篩選
D．需要給小鼠注射免疫抑制劑，抑制B細胞和骨髓瘤細胞之間的免疫排斥
【答案】C
【分析】分析題圖：給小鼠注射HCG，從小鼠的脾臟中獲取B淋巴細胞；
①過程將該B淋巴細胞與小鼠的骨髓瘤細胞融合；
②過程為雜交瘤細胞的篩選與培養；
③過程為專一抗體檢驗并篩選出能產生抗HCG抗體的雜交瘤細胞；
④過程為體外培養。
【詳解】A、①過程為誘導動物細胞融合，常用的誘導因素有滅活的病毒、聚乙二醇、電激等，利用了細胞膜的流動性，A錯誤；
B、②過程為用特定的選擇性培養基篩選雜交瘤細胞，在篩選出的雜交瘤細胞中，有的能產生抗HCG抗體，有的不能產生抗HCG抗體，B錯誤；
C、③過程是對篩選出的雜交瘤細胞進行克隆化培養和抗體檢測，進而篩選出能產生抗HCG抗體的雜交瘤細胞，此過程利用的原理是抗原和抗體的特異性結合，C正確；
D、由于B細胞和核骨髓瘤細胞均來自于同一只小鼠。因此不需要給小鼠注射免疫抑制劑，D錯誤。
故選C。
4．多溴聯苯醚（分子式C12H5Br4O，簡稱BDE-47）是一種電子垃圾分解后產生的環境污染物，進入人體會對神經系統、生殖系統等產生毒害。為了提高好氧細菌的降解效率，將GB-2細菌內獲取的BDE-47降解基因導入WT-G受體菌，構建成基因工程菌1、2、3，如圖是對三種菌相關基因的電泳結果。下列敘述錯誤的是（　?。?br/>A．由圖可知，工程菌2為降解BDE-47能力強的目的菌株
B．從GB-2細菌內獲取的BDE-47降解基因可通過PCR技術進行擴增
C．將含有BDE-47降解基因的重組質粒導入WT-G受體菌時，用Ca2+處理會增大導入率
D．若要增加篩選GB-2細菌的可能性，應從多溴聯苯醚污染區取樣并進行菌體培養
【答案】A
【分析】基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術擴增和人工合成。（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。（4）目的基因的檢測與鑒定。
【詳解】A、由圖可知，工程菌2含有降解基因，若要鑒定工程菌2的降解能力，需進行相關的降解能力的實驗，A錯誤；
B、從GB-2細菌內獲取的BDE-47降解基因可通過PCR技術進行擴增，B正確；
C、Ca2+處理會使受體菌處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，因此會增大導入率，C正確；
D、污染區的土壤中降解BDE-47的菌體數量相對較多，從污染區取樣，再經過菌體培養增加目的菌的濃度，利于篩選得到GB-2細菌，D正確。
故選A。
5．利用基因工程技術培育出油脂高產的四尾柵藻，是獲取生物柴油的新途徑?？茖W家欲從紫蘇中提取DGAT1基因（催化油脂合成的關鍵酶基因），導入到四尾柵藻細胞，獲得轉基因油脂高產的四尾柵藻，質粒pCAMBIA與PCR擴增出的DGAT1酶切位點如圖所示。現有BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ三種限制酶，它們識別并切割的堿基序列分別為BamHI：5'—G↓GATCC—3'，BglⅡ：5'—A↓GATCT—3'，EcoR I：5'—G↓AATTC—3'。已知啟動子往往具有物種特異性，質粒pCAMBIA中EcoRI酶切位點與BamHⅠ酶切位點間的最短距離為600bp。用BglⅡ酶切割DGAT1，BamHⅠ酶切割質粒，下列敘述正確的是（ ）
A．過程②進行PCR時，需要在兩種引物的3'端添加限制酶Bgl Ⅱ的識別序列
B．在載體pCAMBIA 質粒中插入紫蘇DGAT1基因，其上游啟動子應選擇紫蘇的啟動子
C．重組質粒若只考慮兩兩連接，可得到4種大小不同的連接產物
D．用EcoR I酶對不同的重組質粒進行酶切鑒定，正確連接的重組質粒酶切產物長度為2400bp和800bp
【答案】D
【分析】基因工程技術的基本步驟：目的基因的獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、基因的檢測與鑒定。
【詳解】A、過程②是通過PCR技術實現的，由②的擴增產物兩端的酶切序列為BglⅡ可知，進行PCR時，需要在兩種引物的5'端添加限制酶BglⅡ的識別序列，A錯誤；
B、要達到讓紫蘇DGATI基因在四尾柵藻細胞中表達的目的，應該添加四尾柵藻的啟動子，B錯誤；
C、若只考慮DNA片段的兩兩連接，構建重組質粒時可得到3種大小不同的連接產物，即目的基因自連、質粒自連以及目的基因和質粒相互連接的用產物，C錯誤；
D、利用EcoRI限制酶切割重組質粒進行鑒定。已知質粒pCAMBLA中EcoRⅠ的酶切位點與BamHI的酶切位點間的最短距離為600bp，根據質粒pCAMBIA和DGATI基因的長度可知，若利用EcoRI限制酶切割重組質粒進行鑒定，正確連接的重組質粒酶切產物應為2400bp和800bp，A組重組質粒為所需質粒，D正確。
故選D。
二、非選擇題
6．家禽的谷物飼料中富含纖維素，但家禽消化道中缺少能降解纖維素的酶，降低了家禽對飼料的吸收與利用。乳酸桿菌是動物胃腸道中的優勢有益菌之一，枯草芽孢桿菌可產生降解纖維素的一種酶，這種酶由W基因編碼。研究人員將W基因轉入乳酸桿菌，規?；a后將其添加于飼料，以提高家禽的養殖效率。
(1)培養乳酸桿菌時培養基中除添加主要營養物質外還需要添加 以滿足其生長對特殊營養物質的需求。農牧業上常將以制糖工業的廢液為原料通過發酵獲得的 制成微生物飼料提高飼料的品質。
(2)枯草芽孢桿菌的W基因可編碼一種可高效降解纖維素的酶，已知圖中W基因轉錄方向是從左往右。為使乳酸桿菌產生該酶，以圖中質粒為載體，進行轉基因。
限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ MfeⅠ KpnⅠ HindⅢ
識別序列和切割位點（5′→3′） G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT
①限制酶主要是從 中分離純化出來的。應使用限制酶 切割圖中質粒，以獲得能正確表達W基因的重組質粒。
②W基因轉錄的模板鏈是 。利用PCR技術對W基因進行擴增時子鏈延伸的方向是 。
(3)在僅添加氨芐青霉素的培養基上篩選出的細胞不一定是目的細胞，請說明理由： 。為確定導入重組質粒的乳酸桿菌是否具有分解纖維素的能力，研究人員將導入了重組質粒的乳酸桿菌接種在 固體鑒別培養基上，若出現 現象，則證明導入成功。
【答案】(1) 維生素 單細胞蛋白
(2) 原核生物 MfeI、Hind Ⅲ 乙鏈 5'→3'
(3) 導入不含目的基因的質粒的細胞也能在含有氨芐青霉素的培養基上存活 剛果紅 以菌落為中心的透明圈
【分析】基因工程的步驟：目的基因的篩選與獲取、構建基因表達載體、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。 基因表達載體的結構：啟動子：是RNA聚合酶識別和結合的位點，用于驅動RNA轉錄；終止子：使轉錄停止的“信號燈”；標記基因：便于重組DNA分子的篩選；目的基因；復制原點。
【詳解】（1）培養乳酸桿菌時培養基中除添加主要營養物質外還需要添加維生素以滿足其生長對特殊營養物質的需求。農牧業上常將以制糖工業的廢液為原料通過發酵獲得的單細胞蛋白制成微生物飼料提高飼料的品質。
（2）限制酶主要是從原核生物中分離純化出來的。選擇限制酶時應當注意：a.不能破壞目的基因；b.目的基因首尾都要有切點；c.質粒要確保至少含有一個完整的標記基因；d.質粒上的切點要位于啟動子之后、終止子之前；e.目的基因和質粒切割后形成的黏性末端還要能互補配對；經綜合分析，MfeⅠ與EcoRⅠ切割后產生的黏性末端相同，但MfeⅠ會破壞目的基因，所以質粒使用限制酶MfeⅠ、Hind Ⅲ切割，含W基因的DNA片段使用限制酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ切割（能切下目的基因）。若用KpnⅠ、HindⅢ切割目的基因和質粒會使W基因反向連接，W基因轉錄方向是從左往右。
已知圖中W基因轉錄方向是從左往右，W基因轉錄的模板鏈是乙鏈。利用PCR技術對W基因進行擴增時子鏈延伸的方向是5'→3'
（3）若導入不含目的基因的質粒的細胞也能在含有氨芐青霉素的培養基上存活，所以在僅添加氨芐青霉素的培養基上篩選出的細胞不一定是目的細胞。鑒定纖維素的固體培養基還要含有纖維素、凝固劑瓊脂和水。剛果紅使纖維素培養基成紅色，若纖維素被分解，則會出現透明圈，由于導入了重組質粒的乳酸桿菌具有分解纖維素的能力，因此導入了重組質粒的乳酸桿菌在此培養基上應出現以菌落為中心的透明圈。
7．中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）是可以無限增殖的細胞?？蒲腥藛T利用CHO細胞系生產乙肝疫苗的過程是：①將得到的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因與信號肽基因連接形成融合基因，信號肽可以引導HBsAg進入內質網內進行合成和加工，進而以分泌蛋白的形式分泌到胞外，融合基因的結構如圖1所示；②將融合基因插入圖2所示的質粒，將重組質粒與帶有小鼠二氫葉酸還原酶（dhfr）基因的質粒共轉染缺乏二氫葉酸還原酶的CHO細胞；③從CHO細胞系的培養液中分離提取HBsAg，用以生產乙肝疫苗。圖1中的F1~F4分別為擴增信號肽基因和HBsAg基因時所需的引物。請回答下列問題：

(1)需要通過 技術擴增融合基因，該技術的原理是 。
(2)為了將信號肽基因和HBsAg基因連接在一起，在分別擴增兩種基因時，應在引物F2和引物F3的5′端引入 。通過PCR檢測融合基因是否形成，可選用圖1中引物 對連接產物進行擴增。
(3)為了將融合基因正確地插入圖2所示的質粒，應選擇限制酶 切割質粒。與單獨將HBsAg基因轉入CHO細胞相比，導入融合基因的好處是 。
(4)缺乏dhfr的CHO細胞在培養基上不能正常生長，因此在篩選表達HBsAg的細胞株時，dhfr基因起 的作用。
(5)在生物反應器中大規模連續培養目標細胞株時，通過 的措施，為培養的細胞株營造無毒的環境。同時要通入 和5%CO2的混合氣體，其中CO2的主要作用是 。
【答案】(1) PCR DNA半保留復制
(2) 一段互補序列 F1和F4
(3) MunⅠ和SalⅠ 信號肽可以引導HBsAg以分泌蛋白的形式分泌到細胞外，便于從CHO細胞培養液中提取HBsAg
(4)標記基因（或篩選）
(5) 定期更換培養液 95%空氣 維持培養液的PH
【分析】PCR技術全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA的核酸合成技術。原理：DNA半保留復制。前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對引物。條件：模板DNA、四種脫
氧核苷酸、引物、耐高溫的DNA聚合酶。過程：變性：DNA解旋，高溫條件下氫鍵解開；復性：引物結合到互補鏈DNA上；延伸：在耐高溫的DNA聚合酶催化作用下合成子鏈。
【詳解】（1）擴增目的基因可采用PCR技術，該技術原理是DNA半保留復制。
（2）①為了將信號肽基因和HBsAg基因連接在一起，在分別擴增兩種基因時，應在引物F2和引物F3的5′端引入一段互補序列，第一次擴增后，可得到帶有互補序列的子鏈，在進行第二次擴增時，互補序列可與另一個基因上的互補序列配對結合，形成新的雜交基因，再進行擴增即可獲得連接在一起的融合基因；
②據圖1可知，形成融合基因后可選用引物F1和F4對融合基因進行PCR擴增。
（3）①據圖2可知，限制酶XhoⅠ會破環終止子，限制酶NheⅠ會將質粒上的終止子切掉，因此應選擇限制酶MunⅠ和SalⅠ切割質粒；
②根據題干信息可知，信號肽可以引導HBsAg進入內質網內進行合成和加工，進而以分泌蛋白的形式分泌到胞外，因此與單獨將HBsAg基因轉入CHO細胞相比，融合基因信號肽基因表達信號肽可以引導HBsAg以分泌蛋白的形式分泌到細胞外，便于從CHO細胞培養液中提取HBsAg。
（4）根據題干信息可知，融合基因需要插入帶有dhfr基因的質粒共轉染缺乏二氫葉酸還原酶的CHO細胞，只有帶有重組質粒的CHO細胞可以在培養基上生長，因此在篩選表達HBsAg的細胞株時dhfr基因起標記基因的作用，便于快速篩選獲得轉基因成功的CHO細胞。
（5）①在生物反應器中大規模連續培養目標細胞株時，為了防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害，需要通過定期更換培養液的方法，為培養的細胞株營造無毒的環境；
②③在生物反應器中要通入95%空氣和5%CO2的混合氣體，其中CO2的主要作用是維持培養液的PH。
8．三白草和魚腥草是同科不同屬的兩種藥用植物，二者因療效相近且具有疊加效應常被用作“藥對”?？蒲腥藛T將復方的配伍（兩種或兩種以上藥物配合使用）用到個體生長或生產過程，并實現有效成分的工廠化生產的具體操作如圖1，進一步研究不同的原生質體密度對三白草和魚腥草原生質體融合率的影響，結果如圖2。

(1)圖1中①過程通過酶解法去除 獲取原生質體，并向三白草和魚腥草細胞酶解液中分別加入紅、綠熒光色素（帶熒光色素的原生質體仍能融合和再生）。過程②利用化學誘導劑 誘導融合，隨后在熒光顯微鏡下選擇帶 的雜種原生質體。
(2)由圖2可知，促進三白草和魚腥草原生質體融合的最適密度為 個/mL。
(3)通常情況下，能增加免疫器官的重量表明該物質具有一定的增強免疫力的作用。為判斷融合體對動物免疫力的影響，科研人員取同種小鼠30只，雌雄各半，隨機均分為三組，實驗處理如下表。
組別 A組 B組 C組（空白對照組）
實驗處理 三白草和魚腥草雜種愈傷組織的蒸餾水提取物 三白草和魚腥草直接混合后的蒸餾水提取物
每天一次等量灌胃，連續一周，檢測各組小鼠的胸腺重量
①表格中C組的實驗處理為 。
②若實驗結果為 ，則支持利用原生質體融合技術將復方的配伍提前并實現有效成分的工廠化生產。
【答案】(1) 細胞壁 聚乙二醇（PEG） 雙色
(2)1×106
(3) 加入等量的蒸餾水 A、B兩組小鼠的胸腺重量相同且都大于C組
【分析】分析圖可知，圖1表示三白草和魚腥草體細胞雜交過程，其中①為去除細胞壁，②為原生質體融合，③為脫分化形成愈傷組織，④為提取代謝產物。圖2柱形圖中，隨著原生質體密度增大，雙核異核融合體比例先升高后降低，其中在1×106個·mL-1時， 比例最高，據此答題即可。
【詳解】（1）據圖示可知，過程①通過酶解法去除細胞壁獲取原生質體。誘導植物細胞融合的方法有利用化學誘導劑PEG（（聚乙二醇））誘導融合，所以過程②利用化學誘導劑PEG誘導融合。由于三百草細胞酶解液中加入了紅熒光色素，魚腥草細胞酶解液中加入了綠熒光色素，所以雜種原生質體應該帶紅、綠雙色熒光色素。
（2）由圖2柱形圖可知，在密度為1×106個·mL-1時， 雙核異核融合體比例最高，說明促進三白草和魚腥草原生質體融合的最適密度為1×106個·mL-1。
（3）①C組為對照組，根據對A、B兩組的處理，C組應用等量的蒸餾水。
②C組為對照組，若實驗結果為A、B兩組的胸腺重量相同且都大于C組，則支持利用原生質體融合技術將復方的配伍提前并實現有效成分的工廠化生產。
9．研究表明羊乳中的β-乳球蛋白（BLG）是人體主要過敏源，圖1為研究人員利用基因編輯技術敲除山羊中BLG基因，同時導入人乳鐵蛋白（hLF）基因并獲得轉基因山羊的操作過程。圖1中sgBLG/Cas9復合物中，sgBLG為能準確識別圖1中母羊甲DNA特定序列的RNA，并引導Cas9蛋白對DNA進行切割。
回答下列問題
(1)上述操作過程中的目的基因是 。Cas9蛋白類似于基因工程中常用到的 酶。
(2)圖中③應用到的技術為 。
(3)為獲取更多母羊丙的卵母細胞，需對丙注射 ，并對獲取的細胞進行培養至 期后去核，去核的目的是 。早期胚胎移植之前，需對母羊丁進行 處理。
(4)研究人員利用人乳鐵蛋白基因的mRNA進行逆轉錄得到了cDNA，已知mRNA的序列為5’-UUACUUCCUG…（中間序列）…CAAGUUUCAU-3’。在目的基因兩端加上相應的限制酶識別序列后利用PCR技術擴增，目的基因和圖2中的質粒連接構建表達載體。請分別寫出PCR擴增時所需兩種DNA引物按5’到3'方向的前12個堿基序列 。
(5)篩選后得到的早期胚胎細胞中不能檢測到該藥用蛋白， （填“能”或“不能”）作為目的基因是否成功導入并表達的依據，理由是 。
【答案】(1) 人乳鐵蛋白（hLF）基因 限制（性內切核酸）
(2)顯微操作去核
(3) 促性腺激素 MⅡ（或MⅡ中/減數分裂Ⅱ中期/減數第二次分裂中期） 確保重構胚的核（遺傳物質）來自供體細胞 同期發情
(4)5'-GAATTCTTACTT-3' 5'-CTGCAGATGAAA-3'
(5) 不能 人乳鐵蛋白（目的）基因只能在轉基因動物的乳腺細胞內表達
【分析】基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術擴增和人工合成。（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。
【詳解】（1）依據題意：利用基因編輯技術敲除山羊中BLG基因同時導入人乳鐵蛋白（hLF）基因并獲得轉基因山羊，可知目的基因是人乳鐵蛋白基因。題干中“引導Cas9蛋白對DNA進行切割”，說明Cas9蛋白可以切割DNA分子，所以與限制性內切核酸酶（限制酶）作用類似。
（2）圖中③對母羊的卵母細胞進行去核操作，應用到的技術為顯微操作去核。
（3）通過超數排卵處理，可以獲得較多的卵母細胞，該過程需對丙注射促性腺激素，并對獲取的細胞進行培養至減數第二次分裂中期后去核，去核的目的是確保重構胚的核（遺傳物質）來自供體細胞。圖中母羊丁是受體，早期胚胎移植之前，需對母羊丁進行同期發情處理，使其生理狀態與供體母羊丙相同。
（4）題干信息可知，mRNA的序列為5’-UUACUUCCUG…（中間序列）…CAAGUUUCAU-3’，通過逆轉錄得到的cDNA雙鏈（目的基因），其模板鏈序列為3’-AATGAAGGAC…（中間序列）…GTTCAAAGTA-5’，對應的編碼鏈序列為5’-TTACTTCCTG…（中間序列）…CAAGTTTCAT-3’；設計引物進行PCR擴增，引物需要從5’到3’，且已知雙鏈cDNA的兩端序列，設計的引物從cDNA的兩端向中間方向擴增，則引物1序列為5’-TTACTTCCTG-3’，引物2序列為5’-ATGAAACTTG-3’；根據圖2載體中乳腺蛋白基因的啟動子和終止子的位置及限制酶識別序列位點可知，cDNA（目的基因）需要插入EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ所在的位置，由于EcoR Ⅰ位于乳腺蛋白基因的啟動子一側，又依據cDNA的模板鏈序列，可知擴增的目的基因引物1所在的一端應該靠近乳腺蛋白基因的啟動子，引物2所在的一端應該靠近終止子；cDNA（目的基因）沒有EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ的識別序列，故設計引物時需要在引物的5’端添加相應的識別序列，根據上述分析，引物1 5’端增添EcoR Ⅰ識別序列，而引物2 5’端增添Pst Ⅰ識別序列，即引物1 添加限制酶后序列為5'-GAATTCTTACTT-3'（下圖左側的引物），引物2 限制酶后序列為5'-CTGCAGATGAAA-3'（下圖右側的引物）。
如圖所示：
（5）由于人乳鐵蛋白（目的）基因只能在轉基因動物的乳腺細胞內表達，篩選后得到的早期胚胎細胞中不能檢測到該藥用蛋白，不能作為目的基因是否成功導入并表達的依據。
10．Ⅰ、同源重組技術結合tetr-sacB雙重選擇系統可對基因進行敲除與回補，研究基因的功能。下圖是科研人員利用該方法對大腸桿菌LacZ基因進行敲除與回補的相關過程，其中tetr是四環素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表達產物能將無色化合物X-gal水解成藍色化合物。請回答下列問題：
限制酶 EcoRⅠ BamHⅠ HindⅢ XmaⅠ
識破序列和切割位點 5'G↓AATTC3' 5'G↓GATCC3' 5'A↓AGCTT3' 5'C↓CCGGG3'
Ⅱ、咪唑喹啉衍生物（BEZ）和長春花堿（VLB）用于治療卵巢癌、肝癌等癌癥，為研究二者對腎癌的治療效果，研究人員進行了系列實驗。
(1)過程①PCR中影響退火溫度的因素有引物的長度、 ，若溫度過低會導致 。
(2)過程⑤中，設計兩種引物時需在引物5'端分別添加上 基因兩端的同源序列。
(3)過程⑦中，在含有 的培養基中出現了白色菌落，即為篩選出的敲除LacZ基因菌株。過程⑧通過同源重組技術結合tetr-sacB雙重選擇系統可對LacZ基因進行回補，篩選LacZ基因回補菌株時應在培養基中添加 。
(4)探究BEZ和VLB單獨及聯合使用對腎癌細胞凋亡的影響，結果如圖1所示。該實驗的自變量是 ，實驗結果表明 對癌細胞凋亡無明顯影響。
(5)Caspase—3是細胞內促凋亡蛋白，Mcl—1是Caspase—3基因表達的調控因子。為研究BEZ和VLB治療腎癌的機制，研究人員對各組細胞進行實驗處理24小時后，檢測Mcl—1的mRNA和蛋白質含量，結果如圖2.選用GAPDH作為內參的原因是 。
(6)綜合圖1、圖2結果，在下列箭頭上標明“+”或“-”（分別表示“促進”和“抑制”），圖示藥物發揮作用的機理 、 。
【答案】(1) G、C含量 非特異性擴增片段增多
(2)LacZ
(3) 四環素和X-gal 蔗糖和X-gal
(4) BEZ的濃度、VLB的濃度及不同濃度的組合 單獨使用BEZ和VLB
(5)GAPDH基因在各組細胞中表達量基本相同，排除實驗操作和檢測方法的干擾
(6) （—） （—）
【分析】基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成；
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等；
（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法；
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。
【詳解】（1）影響退火溫度的因素有引物的長度、G、C含。若溫度過低會導致引物與模板非特異性配對增多，導致非特異性擴增片段增多。
（2）過程⑤中，設計兩種引物時需在引物5＇端分別添加上LacZ基因兩端的同源序列，利用同源重組技術將LacZ基因與載體相連。
（3）由于LacZ基因表達產物能將無色化合物X-gal水解成藍色化合物，若培養基中出現白色菌落，則說明成功導入重組質粒，LacZ基因成功敲除，由于重組質粒上有四環素標記基因，故含有四環素和X-gal的培養基中出現白色菌落。過程⑧通過同源重組技術結合tetr-sacB雙重選擇系統可對LacZ基因進行回補，由于sacB基因是蔗糖致死基因，則添加蔗糖起到選擇作用，LacZ基因表達產物能將無色化合物X-gal水解成藍色化合物，則添加X-gal起到篩選作用，所以在培養基中添加蔗糖和X-gal可篩選LacZ基因回補菌株。
（4）由圖可知，該實驗的自變量是BEZ的濃度、VLB的濃度及不同濃度的組合，單獨使用BEZ和VLB是細胞的凋亡數與對照組相比幾乎無差別，故單獨使用BEZ和VLB對癌細胞凋亡無明顯影響。
（5）根據對圖2的分析可知，圖2中左圖中GAPDH內參的是mRNA，右圖中GAPDH內參的是蛋白質，由于GAPDH基因在各組細胞中表達量基本相同，選用GAPDH作為內參的原因是排除實驗操作和檢測方法的干擾。
（6）綜合圖1、圖2結果可知，BEZ和VLB共同使用抑制了Mcl-1蛋白質的合成，Mcl-1蛋白質含量的減少對Caspase-3基因表達的抑制作用減弱，從而Caspase-3基因表達增強，Caspase-3蛋白的含量增加，在Caspase-3蛋白的作用下促進細胞凋亡，從而達到減小腫瘤的體積的作用，故：2024年高考生物壓軸題訓練： 生物技術與工程
命題預測 生物技術是高考中的重要板塊，包括基因工程、細胞工程以及發酵工程、PCR技術應用廣泛，可用于新冠病毒的核酸檢測等基本內容，是近幾年高考試題的命題熱點，在考試中經常會與細胞代謝、基因等進行綜合考查，難度從簡單到困難都有所涉及，需要考生在復習中認真對待。 預計2024年命題會繼續在上述幾個方面進行。通過近幾年的高考題研究發現，生物高考越來越重視在現實情景中考查考生運用知識解決實際問題的能力。從這個角度看，生物技術和工程問題一直是考查的重點內容。這是因為，現代生物學的實際問題，不論是科學研究還是生產實踐，都要通過生物技術和生物工程解決。而生物技術和生物工程又是建立在生命科學原理的基礎上的。這樣就形成了生物科學一生物技術和工程一科學研究和生產實踐一條主線。生物技術和工程起到連接科學原理和實際問題的橋梁的作用。明白了這一部分的地位，考生的備考策略就要從生物科學原理出發，理解生物技術與工程，再利用這些技術解決實際問題。
高頻考法 （1）微生物的選擇培養、鑒定和計數 （2）植物細胞工程和動物細胞工程的比較 （3）限制酶的選取與基因表達載體的構建 （4）分析基因編輯方案，學會科學探究、發現并解決問題
（密押典例+思維建模，學會壓軸題）
密押典例 01 微生物的選擇培養、鑒定和計數
(2022·廣東高考)研究深海獨特的生態環境對于開發海洋資源具有重要意義。近期在“科學號”考察船對中國南海科考中，中國科學家采集了某海域1 146米深海冷泉附近沉積物樣品，分離、鑒定得到新的微生物菌株并進一步研究了其生物學特性。
回答下列問題：
(1)研究者先制備富集培養基，然后采用________________法滅菌，冷卻后再接入沉積物樣品，28 ℃厭氧培養一段時間后，獲得了含擬桿菌的混合培養物，為了獲得純種培養物，除了稀釋涂布平板法，還可采用____________________法。據圖分析，擬桿菌新菌株在以__________________為碳源時生長狀況最好。
(2)研究發現，將采集的樣品置于各種培養基中培養，仍有很多微生物不能被分離篩選出來，推測其原因可能是____________________________________________________________
__________________________________________________________________。(答一點即可)
(3)藻類細胞解體后的難降解多糖物質，通常會聚集形成碎屑沉降到深海底部。從生態系統組成成分的角度考慮，擬桿菌對深海生態系統碳循環的作用可能是________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)深海冷泉環境特殊，推測此環境下生存的擬桿菌所分泌的各種多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能還有____________________________________________________。
【答案】　(1)高壓蒸汽滅菌　平板劃線　纖維素　(2)某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物質才能生存(或某些微生物只有在深海冷泉的特定環境中才能存活)　(3)擬桿菌作為分解者，將沉降到深海底部的難降解多糖物質分解為無機物，歸還到無機環境中，有利于碳循環的順利進行　(4)耐低溫
【解析】　(1)富集培養基通常采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌?？梢圆捎孟♂屚坎计桨宸ɑ蚱桨鍎澗€法對微生物進行分離純化。分析題圖可知，在以纖維素為碳源的培養基中細胞數最多，故擬桿菌新菌株在以纖維素為碳源時生長狀況最好。(2)深海冷泉中某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物質才能生存，故將采集的樣品置于各種培養基中培養，仍有很多微生物不能被分離篩選出來。(3)擬桿菌為異養生物，其作為深海生態系統中的分解者，能將沉降到深海底部的難降解多糖物質分解為無機物，歸還到無機環境中，有利于碳循環的順利進行。(4)深海冷泉溫度較低，故生活在其中的擬桿菌所分泌的各種多糖降解酶應具有耐低溫的特性，這樣才能高效降解多糖，以滿足擬桿菌正常的生命活動。
思維建模　
解題關鍵—破譯新情境
情境信息 化新為熟
題圖 擬桿菌新菌株在以不同物質為碳 擬桿菌可降解難降解的多糖物質：纖維素、木
信息 源時的細胞數：纖維素>木聚糖>果膠>甘露聚糖>淀粉 聚糖、果膠等；擬桿菌新菌株在以纖維素為碳源時生長狀況最好
題肢信息 設問(1)：為了獲得純種培養物 純種培養需利用選擇培養基篩選，接種方法有稀釋涂布平板法和平板劃線法
設問(2)：將采集的樣品置于各種培養基中培養，仍有很多微生物不能被分離篩選出來 深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物質才能生存(或需要在深海冷泉的特定環境中才能存活)
設問(3)：從生態系統組成成分的角度考慮 擬桿菌為異養生物，可作為該生態系統的分解者
設問(4)：深海冷泉環境特殊 深海冷泉附近溫度較低，此環境下生存的擬桿菌所分泌的各種酶，都應具有耐低溫的特性
密押典例 02 植物細胞工程和動物細胞工程的比較
(2023·山東高考)利用植物細胞培養技術在離體條件下對單個細胞或細胞團進行培養使其增殖，[信息①]可獲得植物細胞的某些次生代謝物。[信息②]下列說法正確的是(　 )
A．利用該技術可獲得某些無法通過化學合成途徑得到的產物
B．植物細胞體積小，故不能通過該技術進行其產物的工廠化生產
C．次生代謝物是植物所必需的，但含量少，應選擇產量高的細胞進行培養
D．該技術主要利用促進細胞生長的培養條件提高單個細胞中次生代謝物的含量
【答案】　A
【解析】　有些產物不能或難以通過化學合成途徑得到，但可利用植物細胞培養技術得到，A正確；利用植物細胞培養技術在離體條件下對單個細胞或細胞團進行培養使其增殖，可獲得植物細胞的某些次生代謝物，故可通過該技術進行植物細胞產物的工廠化生產，B錯誤；一般認為次生代謝物不是植物基本的生命活動所必需的，其含量少，可以通過增加細胞的數量來增加次生代謝物的產量，C錯誤；該技術主要利用促進細胞分裂的培養條件，提高多個細胞中次生代謝物的總含量，而不能提高單個細胞中次生代謝物的含量，D錯誤。
思維建?！?br/>解題關鍵—準確理解概念
信息 概念遷移
信息① 結合植物細胞培養的概念，該技術獲得細胞代謝產物可利用發酵工程等手段實現工廠化生產，且復雜的細胞代謝產物化學途徑可能無法合成；該技術也是通過細胞大量增殖獲取產物，而不是利用單個細胞的產量增加
信息② 聯系次生代謝物的概念，明確其不是植物生長所必需的
密押典例 03 植物細胞工程和動物細胞工程的比較
(2023·天津高考，有改動)根據不同動物的培育圖示分析，下列敘述正確的是(　 )
A．子代動物遺傳性狀和受體動物完全一致
B．過程1需要MⅡ期去核卵母細胞
C．過程2可以大幅改良動物性狀
D．過程2為過程3提供了量產方式，過程3為過程1、2提供了改良性狀的方式
【答案】　D
【解析】　子代動物的遺傳性狀與供體基本一致，但與受體動物無關，A錯誤。核移植過程中需要處于MⅡ期的去核卵母細胞，而過程1是培育試管動物，需要培育到適宜時期(桑葚胚或囊胚等時期)進行胚胎移植，B錯誤。過程2得到的是克隆動物，是無性生殖的一種，不能大幅改良動物性狀，C錯誤。過程2克隆技術可得到大量同種個體，為過程3提供了量產方式；過程3是轉基因技術，轉基因可導入外源優良基因，為過程1、2提供了改良性狀的方式，D正確。
思維建?！?br/>解題關鍵—科學思維
密押典例 04 限制酶的選取與基因表達載體的構建
(2022·山東高考)某種類型的白血病由蛋白P引發，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通
過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機理，需構建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P；FLAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質結合，但不影響P或P△的功能。
(1)為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是__________________________________。為使PCR產物能被限制酶切割，需在引物上添加相應的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR擴增得到的P基因經酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導入細胞后，融合基因轉錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因對應的氨基酸序列與P不同。據圖甲分析，出現該問題的原因是_________________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________。可在修改擴增P基因時使用帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是_____________________________________。
(3)融合蛋白表達成功后，將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照圖乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經含FLAG抗體的介質，分離出與介質結合的物質并用UBC抗體檢測，檢測結果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③組結果的差異推測，藥物A的作用是_______________________________________________________________
__________________________________________________________________________；由②④組或③⑤組的差異推測，P△中缺失的特定序列的作用是______________________________________
____________________________________________________________________________________。
(4)根據以上結果推測，藥物A治療該病的機理是_______________________________________
___________________________________________________________________________________。
【答案】　(1)能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對、短單鏈核酸　5′端　(2)P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRⅠ識別序列的最后兩個堿基編碼同一個氨基酸，導致mRNA的密碼子被錯位讀取　在引物中的EcoRⅠ識別序列3′端添加一個堿基　(3)增強FLAG-P與UBC的結合　參與P與UBC的結合　(4)藥物
A通過增強P與UBC結合促進P降解
【解析】　(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，因此設計擴增P基因的引物需要滿足的條件是能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對，并且是短單鏈核酸。DNA聚合酶延伸時，是將脫氧核苷酸添加到引物的3′端，為了不破壞目的基因，該限制酶識別序列應添加在引物的5′端。(2)融合基因轉錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因對應的氨基酸序列與P不同，說明P基因翻譯時出錯。由圖甲可以看出，P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRⅠ識別序列的最后兩個堿基編碼同一個氨基酸，導致mRNA的密碼子被錯位讀取。解決該問題的修改方案是在引物中的EcoRⅠ識別序列3′端添加一個堿基，使EcoRⅠ識別序列不影響P基因的正常翻譯。(3)①組僅添加UBC；②組添加UBC和FLAG-P；③組添加UBC、FLAG-P和藥物A；④組添加UBC和FLAG-P△；⑤組添加UBC、FLAG-P△和藥物A。按題中所述處理后，①組沒出現雜交帶，②③組出現雜交帶，且③組雜交帶更加明顯，說明藥物A的作用是增強FLAG-P與UBC的結合。②④組或③⑤組的差異在于②③組含有FLAG-P，出現雜交帶，④⑤組含有FLAG-P△，沒出現雜交帶，據此推測P△中缺失的特定序列的作用是參與P與UBC的結合。(4)根據(3)的分析推測，藥物A通過增強P與UBC結合促進P降解，達到治療該病的目的。
思維建?！?br/>解題關鍵—破譯新情境
情境信息 化新為熟
題干信息 某種類型的白血病由蛋白P引發，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用
FLAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質結合 融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△可與FLAG抗體特異性結合，被篩選或識別出來
題肢信息 設問(1)：為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因 引物是一小段能與DNA模板鏈互補的短單鏈核酸；DNA延伸方向是模板鏈的3′端→5′端
圖甲：DNA編碼鏈為轉錄時所用模板鏈的互補鏈 DNA編碼鏈中核苷酸序列與該基因轉錄的mRNA序列一致(RNA中U取代DNA中的T)
設問(3)：各組樣品混勻后分別流經含FLAG抗體的介質，分離出與介質結合的物質并用 UBC抗體檢測 只有同時含有FLAG-P和UBC的復合物才能與 FLAG 抗體和 UBC 抗體特異性結合，即檢測結果中有顯示
密押典例 05 分析基因編輯方案，學會科學探究、發現并解決問題
(2023·天津高考，有改動)基因工程：制備新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉發酵，則應導入多步分解淀粉所需的多種酶，[信息①]推測這些酶生效的場所應該是________(填“細胞內”或“細胞外”)。
(2)同源切割是一種代替限制酶、DNA連接酶將目的基因導入基因表達載體的方法。當目的基因兩側的小段序列與基因表達載體上某序列相同時，就可以發生同源切割，將目的基因直接插入。[信息②]研究人員運用同源切割的方式，在目的基因兩端加上一組同源序列A、B，已知酵母菌體內DNA有許多A－B序列位點可以同源切割插入。構建完成的目的基因結構如圖，則應選擇圖中的引物________對目的基因進行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因(UGA)常用作標記基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸轉化為對酵母菌有毒的物質。[信息③]
Ⅰ.導入目的基因的酵母菌應在____________的培養基上篩選培養。由于需要導入多種酶基因，需要多次篩選，因此在導入一種目的基因后，要切除UGA基因，再重新導入。研究人員在UGA基因序列兩端加上酵母菌DNA中不存在的同源C、C′序列，以便對UGA基因進行切除。C、C′的序列方向將影響切割時同源序列的配對方式，進而決定DNA片段在切割后是否可以順利重連，如圖，則應選擇方式________進行連接。
Ⅱ.切去UGA基因的酵母菌應在________的培養基上篩選培養。
(4)綜上，目的基因、標記基因和同源序列在導入酵母菌的基因表達載體上的排列方式應該如圖________。
【答案】　(1)細胞外　(2)P1和P6　(3)Ⅰ.缺乏尿嘧啶　2?、?含有5-氟乳清酸　(4)3
【解析】　(1)由于酵母菌不能吸收淀粉，所以導入分解淀粉的酶發揮作用的場所在細胞外。(2)根據題干信息可知，當目的基因兩側的小段序列與基因表達載體上某序列相同時，就可以發生同源切割，將目的基因直接插入，要保證目的基因兩側的小段序列與基因表達載體上某序列相同(都含有同源序列A、B)，需要選擇P1和P6這對引物進行PCR。(3)Ⅰ.選擇了尿嘧啶合成基因(UGA)作標記基因，則應該將酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培養基上培養，如果導入成功，則形成菌落；如果沒有導入，則缺乏尿嘧啶，不能生存；方式一，C和C′方向相反，如果切割，則末端在一條鏈上，不能連接，所以選擇方式二，連接方向相同，切割后形成末端，便于連接。Ⅱ.由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸轉化為對酵母菌有毒的物質，所以應該在含有5-氟乳清酸的培養基上篩選切去UGA基因的酵母菌，如果切割成功，則不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，則會產生有毒物質，不能形成菌落。(4)根據前面分析，C和C′的中間插入UGA，A和B之間插入的目的基因，所以圖3正確。
思維建?！?br/>解題關鍵—破譯新情境
一、單選題
1．在某地的農業生產中，研究人員發現了一種廣泛使用的除草劑在土壤中不易被降解，且長期使用會導致土壤被污染。為修復被該除草劑污染的土壤，可按下圖程序選育能降解該除草劑的細菌（已知該除草劑是一種含氮有機物，在水中溶解度低，含一定量該除草劑的培養基不透明）。下列相關敘述正確的是（ ）
A．只有長期使用該除草劑的土壤中才含有能降解該除草劑的細菌
B．篩選能降解該除草劑的細菌的培養基中該除草劑是唯一的氮源
C．圖中操作Ⅰ的接種方法為平板劃線法，該方法可用于細菌計數
D．經過一段時間的培養，培養皿中應該只存在有透明圈的菌落
2．科學家用紫外線照射板藍根原生質體，使其部分染色體丟失，將處理后的板藍根原生質體與油菜原生質體融合，培育出了只含一條板藍根染色體和油菜全部染色體的非對稱雜種植株，該過程運用了非對稱細胞融合技術。下列說法正確的是（ ）
A．非對稱細胞融合技術提高了植物細胞的全能性，屬于細胞工程
B．非對稱細胞融合技術降低了不同物種間基因表達的干擾程度
C．原生質體由細胞膜、液泡膜及兩者之間的細胞質組成
D．融合原生質體需放在無菌水中培養，以防雜菌污染
3．人絨毛膜促性腺激素（HCG）是女性懷孕后胎盤滋養層細胞分泌的一種糖蛋白，制備抗HCG單克隆抗體可用于早孕的診斷。下圖是抗HCG單克隆抗體制備流程示意圖，相關敘述正確的是（　?。?br/>A．過程①常用聚乙二醇誘導細胞融合，利用了細胞膜的選擇透過性
B．過程②篩選得到的雜交瘤細胞可直接用于生產單克隆抗體
C．過程③采用抗原-抗體雜交反應進行特定雜交瘤細胞的篩選
D．需要給小鼠注射免疫抑制劑，抑制B細胞和骨髓瘤細胞之間的免疫排斥
4．多溴聯苯醚（分子式C12H5Br4O，簡稱BDE-47）是一種電子垃圾分解后產生的環境污染物，進入人體會對神經系統、生殖系統等產生毒害。為了提高好氧細菌的降解效率，將GB-2細菌內獲取的BDE-47降解基因導入WT-G受體菌，構建成基因工程菌1、2、3，如圖是對三種菌相關基因的電泳結果。下列敘述錯誤的是（　　）
A．由圖可知，工程菌2為降解BDE-47能力強的目的菌株
B．從GB-2細菌內獲取的BDE-47降解基因可通過PCR技術進行擴增
C．將含有BDE-47降解基因的重組質粒導入WT-G受體菌時，用Ca2+處理會增大導入率
D．若要增加篩選GB-2細菌的可能性，應從多溴聯苯醚污染區取樣并進行菌體培養
5．利用基因工程技術培育出油脂高產的四尾柵藻，是獲取生物柴油的新途徑?？茖W家欲從紫蘇中提取DGAT1基因（催化油脂合成的關鍵酶基因），導入到四尾柵藻細胞，獲得轉基因油脂高產的四尾柵藻，質粒pCAMBIA與PCR擴增出的DGAT1酶切位點如圖所示。現有BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ三種限制酶，它們識別并切割的堿基序列分別為BamHI：5'—G↓GATCC—3'，BglⅡ：5'—A↓GATCT—3'，EcoR I：5'—G↓AATTC—3'。已知啟動子往往具有物種特異性，質粒pCAMBIA中EcoRI酶切位點與BamHⅠ酶切位點間的最短距離為600bp。用BglⅡ酶切割DGAT1，BamHⅠ酶切割質粒，下列敘述正確的是（ ）
A．過程②進行PCR時，需要在兩種引物的3'端添加限制酶Bgl Ⅱ的識別序列
B．在載體pCAMBIA 質粒中插入紫蘇DGAT1基因，其上游啟動子應選擇紫蘇的啟動子
C．重組質粒若只考慮兩兩連接，可得到4種大小不同的連接產物
D．用EcoR I酶對不同的重組質粒進行酶切鑒定，正確連接的重組質粒酶切產物長度為2400bp和800bp
二、非選擇題
6．家禽的谷物飼料中富含纖維素，但家禽消化道中缺少能降解纖維素的酶，降低了家禽對飼料的吸收與利
用。乳酸桿菌是動物胃腸道中的優勢有益菌之一，枯草芽孢桿菌可產生降解纖維素的一種酶，這種酶由W基因編碼。研究人員將W基因轉入乳酸桿菌，規模化生產后將其添加于飼料，以提高家禽的養殖效率。
(1)培養乳酸桿菌時培養基中除添加主要營養物質外還需要添加 以滿足其生長對特殊營養物質的需求。農牧業上常將以制糖工業的廢液為原料通過發酵獲得的 制成微生物飼料提高飼料的品質。
(2)枯草芽孢桿菌的W基因可編碼一種可高效降解纖維素的酶，已知圖中W基因轉錄方向是從左往右。為使乳酸桿菌產生該酶，以圖中質粒為載體，進行轉基因。
限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ MfeⅠ KpnⅠ HindⅢ
識別序列和切割位點（5′→3′） G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT
①限制酶主要是從 中分離純化出來的。應使用限制酶 切割圖中質粒，以獲得能正確表達W基因的重組質粒。
②W基因轉錄的模板鏈是 。利用PCR技術對W基因進行擴增時子鏈延伸的方向是 。
(3)在僅添加氨芐青霉素的培養基上篩選出的細胞不一定是目的細胞，請說明理由： 。為確定導入重組質粒的乳酸桿菌是否具有分解纖維素的能力，研究人員將導入了重組質粒的乳酸桿菌接種在 固體鑒別培養基上，若出現 現象，則證明導入成功。
7．中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）是可以無限增殖的細胞?？蒲腥藛T利用CHO細胞系生產乙肝疫苗的過程是：①將得到的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因與信號肽基因連接形成融合基因，信號肽可以引導HBsAg進入內質網內進行合成和加工，進而以分泌蛋白的形式分泌到胞外，融合基因的結構如圖1所示；②將融合基因插入圖2所示的質粒，將重組質粒與帶有小鼠二氫葉酸還原酶（dhfr）基因的質粒共轉染缺乏二氫葉酸還原酶的CHO細胞；③從CHO細胞系的培養液中分離提取HBsAg，用以生產乙肝疫苗。圖1中的F1~F4分別為擴增信號肽基因和HBsAg基因時所需的引物。請回答下列問題：

(1)需要通過 技術擴增融合基因，該技術的原理是 。
(2)為了將信號肽基因和HBsAg基因連接在一起，在分別擴增兩種基因時，應在引物F2和引物F3的5′端引
入 。通過PCR檢測融合基因是否形成，可選用圖1中引物 對連接產物進行擴增。
(3)為了將融合基因正確地插入圖2所示的質粒，應選擇限制酶 切割質粒。與單獨將HBsAg基因轉入CHO細胞相比，導入融合基因的好處是 。
(4)缺乏dhfr的CHO細胞在培養基上不能正常生長，因此在篩選表達HBsAg的細胞株時，dhfr基因起 的作用。
(5)在生物反應器中大規模連續培養目標細胞株時，通過 的措施，為培養的細胞株營造無毒的環境。同時要通入 和5%CO2的混合氣體，其中CO2的主要作用是 。
8．三白草和魚腥草是同科不同屬的兩種藥用植物，二者因療效相近且具有疊加效應常被用作“藥對”。科研人員將復方的配伍（兩種或兩種以上藥物配合使用）用到個體生長或生產過程，并實現有效成分的工廠化生產的具體操作如圖1，進一步研究不同的原生質體密度對三白草和魚腥草原生質體融合率的影響，結果如圖2。

(1)圖1中①過程通過酶解法去除 獲取原生質體，并向三白草和魚腥草細胞酶解液中分別加入紅、綠熒光色素（帶熒光色素的原生質體仍能融合和再生）。過程②利用化學誘導劑 誘導融合，隨后在熒光顯微鏡下選擇帶 的雜種原生質體。
(2)由圖2可知，促進三白草和魚腥草原生質體融合的最適密度為 個/mL。
(3)通常情況下，能增加免疫器官的重量表明該物質具有一定的增強免疫力的作用。為判斷融合體對動物免疫力的影響，科研人員取同種小鼠30只，雌雄各半，隨機均分為三組，實驗處理如下表。
組別 A組 B組 C組（空白對照組）
實驗處理 三白草和魚腥草雜種愈傷組織的蒸餾水提取物 三白草和魚腥草直接混合后的蒸餾水提取物
每天一次等量灌胃，連續一周，檢測各組小鼠的胸腺重量
①表格中C組的實驗處理為 。
②若實驗結果為 ，則支持利用原生質體融合技術將復方的配伍提前并實現有效成分的工廠化生產。
9．研究表明羊乳中的β-乳球蛋白（BLG）是人體主要過敏源，圖1為研究人員利用基因編輯技術敲除山羊中BLG基因，同時導入人乳鐵蛋白（hLF）基因并獲得轉基因山羊的操作過程。圖1中sgBLG/Cas9復合物中，sgBLG為能準確識別圖1中母羊甲DNA特定序列的RNA，并引導Cas9蛋白對DNA進行切割。
回答下列問題
(1)上述操作過程中的目的基因是 。Cas9蛋白類似于基因工程中常用到的 酶。
(2)圖中③應用到的技術為 。
(3)為獲取更多母羊丙的卵母細胞，需對丙注射 ，并對獲取的細胞進行培養至 期后去核，去核的目的是 。早期胚胎移植之前，需對母羊丁進行 處理。
(4)研究人員利用人乳鐵蛋白基因的mRNA進行逆轉錄得到了cDNA，已知mRNA的序列為5’-UUACUUCCUG…（中間序列）…CAAGUUUCAU-3’。在目的基因兩端加上相應的限制酶識別序列后利用PCR技術擴增，目的基因和圖2中的質粒連接構建表達載體。請分別寫出PCR擴增時所需兩種DNA引物按5’到3'方向的前12個堿基序列 。
(5)篩選后得到的早期胚胎細胞中不能檢測到該藥用蛋白， （填“能”或“不能”）作為目的基因是否成功導入并表達的依據，理由是 。
10．Ⅰ、同源重組技術結合tetr-sacB雙重選擇系統可對基因進行敲除與回補，研究基因的功能。下圖是科研人員利用該方法對大腸桿菌LacZ基因進行敲除與回補的相關過程，其中tetr是四環素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表達產物能將無色化合物X-gal水解成藍色化合物。請回答下列問題：
限制酶 EcoRⅠ BamHⅠ HindⅢ XmaⅠ
識破序列和切割位點 5'G↓AATTC3' 5'G↓GATCC3' 5'A↓AGCTT3' 5'C↓CCGGG3'
Ⅱ、咪唑喹啉衍生物（BEZ）和長春花堿（VLB）用于治療卵巢癌、肝癌等癌癥，為研究二者對腎癌的治療效果，研究人員進行了系列實驗。
(1)過程①PCR中影響退火溫度的因素有引物的長度、 ，若溫度過低會導致 。
(2)過程⑤中，設計兩種引物時需在引物5'端分別添加上 基因兩端的同源序列。
(3)過程⑦中，在含有 的培養基中出現了白色菌落，即為篩選出的敲除LacZ基因菌株。過程⑧通過同源重組技術結合tetr-sacB雙重選擇系統可對LacZ基因進行回補，篩選LacZ基因回補菌株時應在培養基中添加 。
(4)探究BEZ和VLB單獨及聯合使用對腎癌細胞凋亡的影響，結果如圖1所示。該實驗的自變量是 ，
實驗結果表明 對癌細胞凋亡無明顯影響。
(5)Caspase—3是細胞內促凋亡蛋白，Mcl—1是Caspase—3基因表達的調控因子。為研究BEZ和VLB治療腎癌的機制，研究人員對各組細胞進行實驗處理24小時后，檢測Mcl—1的mRNA和蛋白質含量，結果如圖2.選用GAPDH作為內參的原因是 。
(6)綜合圖1、圖2結果，在下列箭頭上標明“+”或“-”（分別表示“促進”和“抑制”），圖示藥物發揮作用的機理 、 。

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