資源簡介

第2節　基因工程的基本操作程序
【學習目標】
1.結合實例,采用文字和圖示方式說明基因工程的基本操作程序。(科學思維)
2.運用結構與功能觀等觀念理解PCR技術的過程、原理、條件等。(生命觀念)
3.利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定,或運用軟件進行虛擬PCR實驗。(科學探究)
【自主預習】
一、目的基因的篩選與獲取
1.目的基因:用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因,主要是指　編碼蛋白質　的基因。
2.篩選合適的目的基因:較為有效的方法是從相關的已知　結構和功能清晰　的基因中進行篩選。
3.利用PCR獲取和擴增目的基因
(1)PCR原理:　DNA半保留復制　原理。
(2)PCR的基本條件
a.場所:在　緩沖液　中進行,其中一般要添加Mg2+。
b.模板:DNA雙鏈。
c.原料:4種　脫氧核苷酸　。
d.酶:　耐高溫的DNA聚合酶　。
e.引物:使DNA聚合酶能夠從引物的　3'端　開始連接脫氧核苷酸。
(3)擴增過程
(4)結果:每一次循環后,目的基因的量可以增加一倍,即呈　指數　形式擴增(約為2n,n為擴增循環的次數)。
(5)鑒定:常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產物。
二、基因表達載體的構建
1.構建目的:使目的基因在受體細胞中穩定存在,并且可以遺傳給下一代,同時使目的基因能夠　表達和發揮作用　。
2.組成:除目的基因、標記基因外,它還必須有　啟動子　、終止子等。
3.構建過程:用同種限制酶或　能產生相同末端　的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和載體,再利用　DNA連接酶　將目的基因片段拼接到載體的切口處,形成一個重組DNA分子。
三、將目的基因導入受體細胞
1. 轉化的概念:指目的基因進入受體細胞內,并且在受體細胞內　維持穩定和表達　的過程。
2.填表
生物類型 導入方法 受體細胞 注意事項
植物 我國獨創的　花粉管通道法　;農桿菌轉化法 受精卵或體細胞 農桿菌轉化法一般適用于　雙子葉植物　和　裸子植物
動物 顯微注射法 受精卵 —
微生物 Ca2+　處理法 原核細胞 常用　大腸桿菌
(1)農桿菌的特點:在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物;含有Ti質粒,當它侵染植物細胞后,能將Ti質粒上的　T-DNA　(可轉移的DNA)轉移到被侵染的細胞,并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。
(2)農桿菌轉化法的原理:將　目的基因　插入Ti質粒的T-DNA中,通過農桿菌的轉化作用,就可以使目的基因進入植物細胞。
四、目的基因的檢測與鑒定
1.個體水平檢測
(1)檢測內容:是否有抗性以及抗性的程度;基因工程產品與天然產品的功能活性是否相同。
(2)檢測方法:轉基因生物的抗性接種實驗,比較基因工程產品與天然產品的功能活性。
(3)結果顯示:是否賦予了預期抗性或蛋白質活性。
2.分子水平檢測
檢測內容 檢測方法
目的基因是否插到受體細胞的DNA上 通過PCR等技術檢測(DNA和DNA之間)
目的基因是否轉錄出mRNA 通過PCR等技術檢測(DNA和mRNA之間)
目的基因是否翻譯成蛋白質 抗原—抗體雜交(蛋白質和蛋白質之間)
五、DNA片段的擴增及電泳鑒定
1.實驗基礎
(1)PCR原理:　DNA的熱變性　。
(2)電泳:DNA分子具有可解離的基團,這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下,這些帶電分子會向著與它所帶電荷　相反　的電極移動,這個過程就是電泳。
(3)在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。
2.PCR實驗操作步驟
3.DNA的電泳鑒定:凝膠中的DNA分子通過染色,可以在波長為　300 nm　的紫外燈下被檢測出來。
【合作探究】
任務1　探討獲取目的基因的方法
活動1　探討PCR的原理和過程
根據PCR技術的過程,思考回答下列問題:
1.什么是引物 DNA復制時為什么需要引物
提示　引物是指一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。在DNA擴增時,DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,只能從引物的3'端延伸DNA鏈,因此PCR過程中應加入兩種引物。
2.PCR擴增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列嗎
提示　不需要,只要知道目的基因兩端的部分核苷酸序列,以便根據這部分序列合成兩種引物。
3.PCR過程中需要解旋酶嗎 所需要的DNA聚合酶應具有什么特點
提示　PCR過程中,DNA雙鏈解開是在高溫下完成的,不需要解旋酶;由于PCR過程溫度較高,因此需要耐高溫的DNA聚合酶。
4.PCR過程中若模板DNA分子中G—C堿基對含量較多,則變性時間會怎樣
提示　若模板DNA分子中G—C堿基對含量較多,則DNA分子中的氫鍵較多,破裂氫鍵需要能量增多,變性時間會延長。
5.在利用PCR獲取和擴增目的基因時,從第幾輪循環才會產生完整的目的基因
提示　第3輪。
6.PCR反應的特點是DNA呈指數形式擴增。PCR的產物一般是通過什么方法來測定的
提示　瓊脂糖凝膠電泳。
認知生成
生物體內DNA復制與PCR反應的比較
比較項目 體內DNA復制 PCR反應
解旋 在解旋酶作用下,細胞提供能量,部分DNA雙鏈解開 90 ℃以上解旋,DNA雙鏈全部解開,不需要解旋酶
酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶 耐高溫的DNA聚合酶
引物 一小段RNA 可以是RNA或單鏈DNA分子片段
合成子鏈 在引物基礎上,一條鏈連續合成;另一條鏈不連續合成,再由DNA連接酶連接 分別從兩條鏈的引物的3'端開始延伸,都是連續合成的
過程 邊解旋,邊復制 變性→復性→延伸
循環次數 受生物體自身控制 一般30次
產物 完整DNA 兩個引物之間的DNA片段
相同點 都需要DNA模板、4種脫氧核苷酸、引物;都是半保留復制,嚴格遵循堿基互補配對原則
例1　基因工程中,獲取目的基因的方法有很多種,可以直接利用PCR選擇性地擴增目的基因。下列關于目的基因的擴增及電泳鑒定的敘述,正確的是(　　)。
A.變性:利用高溫破壞氫鍵,將目的基因的兩條鏈解開
B.復性:降低溫度,使目的基因的DNA恢復雙螺旋結構
C.延伸:在DNA聚合酶的作用下,將4種核苷酸加到引物的5'端
D.鑒定:DNA呈指數擴增,PCR產物不經染色可用紫外光檢測
【答案】　A
【解析】　變性:利用高溫破壞氫鍵,將目的基因的兩條鏈解開,為復制提供模板,A正確。復性:降低溫度,使目的基因的DNA模板鏈與引物結合,為后續子鏈延伸做準備,B錯誤。延伸:在DNA聚合酶的作用下,將4種脫氧核苷酸加到引物的3'端,完成子鏈的延伸過程,C錯誤。鑒定:DNA呈指數擴增,PCR產物經染色可在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來,D錯誤。
對點練1　(2022·南陽期中)有關PCR,下列敘述不正確的是(　　)。
A.是聚合酶鏈式反應,是以DNA聚合酶在體外擴增DNA片段的技術
B.在用PCR擴增DNA時,DNA的復制過程與細胞內DNA的復制類似
C.PCR反應只需在一定的緩沖溶液中提供DNA模板以及四種脫氧核苷酸
D.PCR一般經歷三十多次循環,每次循環分為變性、復性、延伸
【答案】　C
【解析】　聚合酶鏈式反應是用DNA聚合酶在體外擴增DNA片段的技術,A正確;在用PCR擴增DNA時,DNA的復制過程與細胞內DNA的復制類似,B正確;PCR反應需在一定的緩沖溶液中進行,需提供DNA模板、一對引物、四種脫氧核苷酸及耐高溫的DNA聚合酶等,C不正確;PCR一般經歷三十多次循環,每次循環均分為變性、復性和延伸三個階段,D正確。
素能提升　引物的設計(科學思維能力)
1.PCR過程中的引物的化學本質是什么
提示　引物是一小段能與DNA模板鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸,可以是DNA,也可以是RNA,用于PCR的引物長度通常為20~30個核苷酸。
2.設計引物的依據是什么
提示　通常是目的基因兩端的核苷酸序列。
3.引物與模板鏈之間怎么結合 子鏈如何延伸
提示　引物的5'端與模板的3'端結合。子鏈從引物的5'端向3'端延伸。
4.PCR操作過程中的兩種引物應該符合哪些要求
提示　①每種引物內部不能發生局部堿基互補配對,否則會導致自身折疊;②兩種引物之間不能在局部發生堿基互補配對,否則會導致引物自連。
5.為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接,需在引物的5'端加上限制酶的酶切位點,兩種引物上加入的酶切位點能否相同 為什么
提示　兩種引物上應加入不同的酶切位點,以保證目的基因與載體的正向連接。
6.復性時的溫度與引物密切相關,溫度不宜過高也不宜過低,為什么
提示　若復性溫度過高,引物可能無法與模板鏈結合,在允許范圍內選擇較高的復性溫度可減少引物和模板間的非特異性結合,增加獲得目標擴增產物的概率。
7.若一個DNA分子在PCR過程中經過n輪循環,理論上需要消耗多少個引物 第n輪循環需要消耗多少個引物
提示　經過n輪循環,需要消耗的引物數為2n+1-2個,第n輪循環需要消耗的引物數為2n個。
例2　(2022·天津月考)利用PCR擴增目的基因的過程中,子鏈延伸需要引物。有關引物設計的說法錯誤的是(　　)。
A.兩種引物之間不能有互補性
B.每種引物自身不應存在互補性
C.設計引物時需要知道目的基因的全部堿基序列
D.引物的長度關系到PCR的特異性
【答案】　C
【解析】　兩種引物之間不能有互補性,否則引物之間會配對形成雙鏈DNA,降低引物與DNA模板的結合率,A正確;每種引物自身不應存在互補性,防止引物自身折疊形成雙鏈DNA,B正確;用PCR擴增目的基因時不必知道基因的全部堿基序列,只需要知道一段已知目的基因兩端的部分核苷酸序列,從而根據這段序列合成引物即可,C錯誤;引物的長度關系到PCR的特異性,引物中堿基越少,PCR的特異性越差,D正確。
對點練2　(2023·福州期末)RT-PCR是將RNA逆轉錄(RT)與cDNA的PCR相結合的技術,可利用此技術獲取目的基因,具體過程如圖所示。以下說法錯誤的是(　　)。
A.設計擴增目的基因的引物時需已知一段目的基因序列
B.G—C含量高的引物在與模板鏈結合時,需要更高的溫度
C.過程Ⅰ需要加入緩沖液、原料、耐高溫的DNA聚合酶和引物A等
D.過程Ⅱ對單鏈cDNA進行n次循環的擴增,理論上需要2n-1個引物B
【答案】　C
【解析】　引物是一小段能與目的基因互補配對的短單鏈核酸,設計擴增目的基因的引物時需已知一段目的基因序列,A正確。若復性溫度過高,則會破壞引物與模板之間的堿基配對;若復性溫度過低,引物與模板之間的非特異性堿基配對增加,由于G—C之間有三個氫鍵,A—T之間有兩個氫鍵,所以G—C含量越高的引物,需要的復性溫度越高,B正確。過程Ⅰ是逆轉錄過程,所以需要加入緩沖液、原料、逆轉錄酶和引物A等,C錯誤。過程Ⅱ對單鏈cDNA進行n次循環的擴增,根據DNA的半保留復制可知,理論上需要2n-1個引物B,D正確。
任務2　探討將目的基因導入受體細胞的方法
活動2　探討將目的基因導入受體細胞的方法
欲按照人們的意愿通過基因工程獲得需要的新的生物類型和生物產品,必須使目的基因進入受體細胞并在受體細胞內維持穩定和表達。植物的受精卵或體細胞、動物的受精卵、大腸桿菌或酵母菌都是基因工程中常用的受體細胞。受體細胞不同,采用的導入方法也不同。常見的方法有花粉管通道法、農桿菌轉化法、顯微注射法以及Ca2+處理法等。請思考回答下列問題:
1.為了獲得轉基因生物,在將目的基因導入受體細胞的程序中,動物一般不用體細胞作為受體細胞,而是用受精卵作為受體細胞,植物的體細胞和受精卵都可作為受體細胞,為什么
提示　與細胞的全能性有關,動物的體細胞較難表現出全能性,動植物的受精卵以及植物的體細胞表現出全能性相對容易些。
2.目的基因為什么不能直接導入受體細胞而是需要使用載體
提示　游離的DNA分子進入細胞內,一般會直接被分解,即使可以進行轉錄、翻譯,游離的DNA也無法隨著細胞分裂進行復制,導致子代細胞不再含有目的基因。
3.農桿菌侵染植物細胞后,能轉移到被侵染的細胞并整合到該細胞的染色體DNA上的物質是什么
提示　Ti質粒上的T-DNA(可轉移的DNA)。
4.請用文字和箭頭的形式表示農桿菌轉化法的一般步驟。
提示　目的基因插入Ti質粒的T-DNA中→轉入農桿菌→導入植物細胞→目的基因插入植物細胞中的染色體DNA上→目的基因表達。
5.農桿菌轉化法中有幾次拼接和導入過程
提示　農桿菌轉化法中有兩次拼接和兩次導入。第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是將插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上;第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌,第二次導入(非人工操作)是將含目的基因的T-DNA導入受體細胞。
6.花粉管通道法與農桿菌轉化法相比有什么優點
提示　①操作簡便;②直接將目的基因導入受精卵,無須經過組織培養即可獲得植株。
7.將目的基因導入動物細胞的受體細胞,除了受精卵外,還可以選擇什么細胞
提示　還可以選擇將目的基因導入胚胎干細胞,因為胚胎干細胞也能發育成動物個體。
8.以大腸桿菌作為受體細胞時,一般先用Ca2+處理大腸桿菌細胞,為什么
提示　Ca2+處理可使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態,然后再將重組的基因表達載體導入大腸桿菌細胞中。
例3　農桿菌轉化法是將目的基因導入植物細胞采用最多的方法。下圖為農桿菌轉化法示意圖,請據圖回答問題:
(1)Ti質粒多存在于細菌中,它是能自我復制的　　　　　　　　　　。
(2)獲取外源基因(目的基因)需要限制酶的參與,而目的基因在重組過程中需要　　　　酶的參與,并依據堿基　　　　原則進行重組。
(3)Ti質粒原存在于　　　　中,其上的T-DNA具有可轉移到受體細胞并整合到受體細胞的　　　　　　上的特點,因此攜帶外源基因的DNA片段必須插入　　　　　　部位。
(4)農桿菌轉化法適于將目的基因導入　　　　　　　　和祼子植物,而不易于感染大多數　　　　。
(5)若將相關的目的基因導入動物細胞或微生物細胞,則常采用　　　　　　　和　　　　　　　。
【答案】　(1)小型環狀DNA分子　(2)DNA連接　互補配對　(3)農桿菌細胞質　染色體DNA　T-DNA片段(內部)　(4)雙子葉植物　單子葉植物　(5)顯微注射技術　Ca2+處理法
【解析】　將目的基因導入受體細胞的方法多種多樣,應根據受體細胞的類型和目的基因的特點分別采用相應的方法。農桿菌轉化法適于將目的基因導入植物細胞,而顯微注射技術和Ca2+處理法分別適于將目的基因導入動物細胞和微生物細胞。
知識拓展
1.在自然條件下,農桿菌主要侵染的是雙子葉植物和裸子植物,而對大多數單子葉植物沒有侵染能力。
2.由導入目的基因的受體細胞培育出完整的植株要用到植物組織培養技術。
3.目的基因在受體細胞中的位置不同會引起遺傳上的差別,如下圖所示。
(1)圖中a細胞減數分裂時,細胞質是不均分的,子細胞不一定含有目的基因。
(2)圖中b會使目的基因的遺傳特性得以穩定維持和表達,原因是在進行細胞減數分裂時,細胞核上的DNA經復制后平均分配到兩個子細胞中,保證了親子代遺傳性狀的穩定性。
對點練3　(2023·開封期中)構建好的基因表達載體需要通過一定的方式才能進入受體細胞。下列受體細胞與常用導入方法對應錯誤的是(　　)。
選項 受體細胞 常用的導入方法
A 棉花細胞 花粉管通道法
B 小鼠細胞 顯微注射法
C 南瓜細胞 農桿菌轉化法
D 枯草芽孢桿菌 顯微注射法
　　【答案】　D
【解析】　將目的基因導入棉花細胞的方法是花粉管通道法,是我國科學家獨創的方法,A正確;將目的基因導入動物細胞的方法是顯微注射法,且通常選擇動物的受精卵細胞,B正確;將目的基因導入南瓜細胞(植物細胞)的方法是農桿菌轉化法,這是導入植物細胞最常用的方法,C正確;枯草芽孢桿菌屬于微生物細胞,將目的基因導入微生物細胞的方法是Ca2+處理法(感受態細胞法),D錯誤。
【隨堂檢測】
課堂小結 課堂小測
1.用PCR方法擴增目的基因時需要設計兩種引物。(√) 2.用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列。 (√) 3.基因工程操作的核心步驟是目的基因的獲取。 (×) 提示　基因工程操作的核心步驟是基因表達載體的構建。 4.基因表達載體中啟動子是DNA聚合酶識別和結合的部位。 (×) 提示　啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位。 5.為培育抗除草劑的作物新品種,導入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體細胞。 (×) 6.可通過PCR等技術檢測棉花的染色體上是否插入了Bt基因。 (√)
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