資源簡介

第2節　微生物的培養技術及應用
第2課時　微生物的選擇培養和計數
【學習目標】
1. 通過實例,理解各類微生物都能適應其生活環境的原理。(生命觀念)
2.根據微生物的代謝類型,配制選擇培養基,總結分離微生物的過程和測定微生物數量的常用方法。(科學思維)
3.通過對土壤中分解尿素的細菌進行分離和計數,理解并掌握微生物計數的方法。(科學探究)
【自主預習】
一、選擇培養基
1.概念:在微生物學中,允許特定種類的微生物生長,同時　抑制或阻止　其他種類微生物生長的培養基。
2.實驗室中微生物的篩選原理:人為提供　有利于目的菌生長的條件　(包括營養、溫度和pH等),同時提供抑制或阻止其他微生物生長的條件。
二、微生物的選擇培養
1.方法:對土樣進行充分稀釋,然后用涂布器將　菌液　均勻地涂布到制備好的　選擇　培養基上,這樣就可以將聚集在一起的細菌分離開來。
2.稀釋涂布平板法的操作過程
(1)系列梯度稀釋操作:
(2)涂布平板操作:
①取菌液:取　0.1 mL　菌液,滴加到　培養基表面　。
②涂布器滅菌:取出浸在　酒精　中的涂布器,放在　火焰　上灼燒,待酒精燃盡后,　冷卻　涂布器。
③涂布:用涂布器將菌液　均勻　地涂布在培養基表面,涂布時可　轉動　培養皿,使涂布　均勻　。
3.培養:待涂布的菌液被培養基吸收后,將平板　倒置　,放入　恒溫培養箱　中培養1~2 d,觀察。
三、微生物的數量測定
1.稀釋涂布平板法
(1)原理:當樣品的　稀釋度　足夠高時,培養基表面生長的一個單菌落,來源于樣品稀釋液中的一個　活菌　。通過統計平板上的　菌落數　,就能推測出樣品中大約含有多少活菌。
(2)計數原則:平板上菌落數應為　30~300　,在同一稀釋度下,應至少對　3　個平板進行重復計數,然后求出　平均值　。
(3)不足:當兩個或多個細胞連在一起時,平板上觀察到的只是　一　個菌落,所以統計的菌落數往往比活菌的實際數目　少　。
2.顯微鏡直接計數法
(1)計數工具:顯微鏡、細菌計數板或血細胞計數板。
(2)不足:由于計數結果是活菌數和死菌數的總和,因此一般計數結果比活菌的實際數目　多　。
四、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
1.原理:絕大多數微生物都能利用葡萄糖,但是只有能合成　脲酶　的微生物才能分解尿素。利用以　尿素　作為唯一氮源的選擇培養基,可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。
2.實驗設計
(1)土壤取樣:從酸堿度接近中性且潮濕的土壤中取樣。鏟
去表層土,在距地表　3~8　cm的土壤層取樣。
(2)樣品的稀釋:測定土壤中細菌的數量,一般選用　1×104、1×105和1×106　倍稀釋的稀釋液進行平板培養。
(3)微生物的培養與觀察:細菌一般在　30~37　℃的溫度下培養　1~2　d。每隔　24　h統計一次菌落數目,選取菌落數目　穩定　時的記錄作為結果。
【合作探究】
任務　對分解尿素的微生物進行分離和計數
活動1　選擇培養基
下表是本任務使用的培養基的配方,根據配方配制培養基,分析并回答以下問題:
組分 含量
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g
尿素 1.0 g
瓊脂 15.0 g
H2O 定容至1000 mL
1.從物理性質上看,此培養基屬于哪種類型的培養基 判斷依據是什么
提示　此培養基從物理性質上看屬于固體培養基,因為加入了凝固劑(瓊脂)。
2.從功能上看,此培養基屬于哪種類型的培養基 此培養基是如何實現其功能的
提示　此培養基從功能上看屬于選擇培養基。此培養基的氮源只有尿素,只有能分泌脲酶的微生物才可利用尿素,因此能在此培養基上生長。
3.從表中配方可以看出,配制選擇培養基的原則是什么
提示　篩選菌株所用的選擇培養基具有能滿足所篩選微生物正常生長所需的營養物質或條件,同時不利于非篩選微生物的生長。
4. 要分離出分解纖維素的微生物,應在怎樣的環境中取土樣 該配制怎樣的培養基
提示　應從富含纖維素的土壤中取土樣,如樹林中多年落葉形成的腐殖土。可以配制以纖維素為唯一碳源的培養基。
5.如何判斷選擇培養基是否具有篩選作用
提示　將待選擇菌液同時接種到牛肉膏蛋白胨固體培養基上進行培養,觀察同一稀釋度的菌液接種的兩種培養基上菌落的數目(其他條件相同且適宜),進行對比得出結論。
認知生成
選擇培養基的三種培養方法
方法 特點 舉例
一 利用營養缺陷型選擇培養基進行的選擇培養 控制培養基的營養成分,使營養缺陷型微生物不能正常生長 缺乏氮源的培養基可以用于分離　固氮　微生物
二 利用某種化學物質進行的選擇培養 在完全培養基中加入某些化學物質,利用加入的化學物質對微生物產生的影響,　抑制　某些微生物的生長,從而選擇所需的微生物 加入青霉素的培養基可以用于篩選酵母菌和霉菌
三 利用培養條件進行的選擇培養 改變微生物的培養條件 將培養基放在高溫環境中培養可以得到　耐高溫　的微生物
例1　分離土壤中分解尿素的細菌,對培養基的要求是(　　)。
①加尿素　②不加尿素　③加瓊脂　④不加瓊脂　⑤加葡萄糖　⑥不加葡萄糖　⑦加硝酸鹽　⑧不加硝酸鹽　　　　　　　　　　　　　　　　
A.①③⑤⑦ B.②④⑥⑧
C.①③⑤⑧ D.①④⑥⑦
【答案】　C
【解析】　要分離土壤中分解尿素的細菌,培養基中尿素應是唯一的氮源,不能加硝酸鹽;在固體培養基上形成菌落,要加瓊脂作凝固劑;分解尿素的細菌是異養生物,要加有機碳源(如葡萄糖)。綜上所述,C符合題意。
對點練1　(2022·揚州期中)通過選擇培養基可從混雜的微生物群體中分離出所需的微生物。在缺乏氮源的培養基上大部分微生物無法生長;在培養基中加入青霉素可抑制細菌和放線菌的生長;在培養基中加入10%的酚可抑制細菌和霉菌的生長;在不含碳源的培養基上許多微生物無法生長。利用上述方法能從混雜的微生物群體中分別分離出(　　)。
①大腸桿菌　②霉菌　③放線菌　④固氮細菌　⑤自養微生物　　　　　　　　　　　　　　　
A.④②③⑤ B.⑤④①②
C.④③⑤② D.⑤①②③
【答案】　A
【解析】　 固氮細菌利用的氮源是氮氣,在缺乏氮源的培養基上大部分微生物無法生長,而④固氮細菌可以生長,因此缺乏氮源的培養基可用于分離出④固氮細菌;霉菌是真菌,在培養基中加入青霉素后,青霉素可以抑制細菌(如大腸桿菌、固氮細菌)和放線菌的生長,而不可以抑制真菌的生長,因此加入青霉素的培養基可用于分離②霉菌;培養基中加入10%的酚可以抑制細菌(如大腸桿菌、固氮細菌)和霉菌的生長,可以分離出③放線菌;自養型生物能制造有機物,不含碳源的培養基可分離出⑤自養微生物。綜上所述,A符合題意。
【知識拓展】
選擇培養基上生長的微生物不一定都是目的菌。原則上選擇培養基只能允許特定種類的微生物生長,但實際上有些微生物可以利用其他微生物的代謝物生長繁殖,因此能在選擇培養基上生長的微生物不一定都是目的菌,還需要進一步鑒定。
活動2　土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
下圖是土壤中分解尿素的細菌的分離與計數實驗的流程示意圖,請根據該流程進行實驗,并結合教材提供的資料,分析下列問題:
1.測定土壤中細菌的總量和能分解尿素的細菌的數量,選用的稀釋范圍相同嗎 為什么
提示　不同。因為土壤中能分解尿素的細菌的數量比細菌的總量少。
2.第一次實驗可以選擇用多大稀釋倍數的稀釋液進行涂布 第一次實驗時為什么要將稀釋范圍放寬一些
提示　第一次實驗時可以將1×103~1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上。為了確保能從中選出菌落數為30~300的平板進行計數。
3.在稀釋涂布平板法中,為何需至少涂布3個平板 為什么一般選擇菌落數為30~300的平板進行計數
提示　①作為重復實驗,統計時取平均值,以減少偶然因素對實驗結果的影響,增強實驗結果的說服力。②若平板上菌落數過多,說明稀釋度過低,菌體的密度大,就會出現更多的兩個或兩個以上的菌體形成的菌落,結果不準確,且計數較困難。若平板上菌落數過少,菌落形成的偶然性大,結果也不準確。
4.為什么要選取菌落數目穩定時的記錄作為結果
提示　盡量縮小統計的菌落數與實際活菌數的差值,因為繁殖慢的菌體開始看不出明顯的菌落。
5.稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數法對微生物計數產生的實驗誤差如何 試分析原因。
提示　稀釋涂布平板法計數的值比實際值小,原因是當兩個或多個細胞連在一起時,平板上觀察到的只是一個菌落;顯微計數法計數的結果比實際值大,原因是顯微鏡下無法區分細胞的死活,計數結果一般是活菌數和死菌數的總和。
認知生成
用稀釋涂布平板法計數微生物的方法
1.稀釋涂布平板法的操作要求:按照平行重復的原則,每一稀釋度的菌液涂布　3個或3個以上　平板。
2.計數的時機:當各平板上菌落數目　穩定　時進行計數。
3.選擇可用于計數的平板:選擇菌落數為　30~300　的平板進行計數,然后取平均值。
4.平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較
提醒:為了確定培養基的滅菌是否合格,微生物實驗一般會設置　空白　對照,即隨機取若干個滅菌后的空白平板培養基在適宜條件下培養一段時間,觀察培養基上是否有菌落生成。
例2　關于土壤中分解尿素的細菌的分離與計數實驗的敘述,錯誤的是(　　)。
A.土壤中的細菌之所以能分解尿素,是因為它們能合成脲酶
B.培養基應以尿素為唯一氮源,該細菌與硝化細菌所利用的碳源是相同的
C.若將10 mL土樣稀釋106倍后,取0.1 mL該溶液進行重復的涂布實驗,測得的菌落數分別為18、234、276,則該10 mL土樣中分解尿素的細菌數為2.55×1010
D.與平板劃線法相比,稀釋涂布平板法形成單菌落的效果更好
【答案】　B
【解析】　土壤中的細菌之所以能分解尿素,是因為它們能合成脲酶,脲酶將尿素分解成氨,A正確;從土壤中分離分解尿素的細菌實驗使用的培養基應以尿素為唯一氮源,分解尿素的細菌為異養型生物,利用的是有機碳源,硝化細菌是自養型生物,以CO2為碳源,CO2為無機物,B錯誤;通常選擇菌落數為30~300的實驗組平板進行計數,若將10 mL土樣稀釋106倍后,取0.1 mL該溶液進行重復涂布實驗,測得的菌落數分別為18、234、276,則該10 mL土樣中分解尿素的細菌數為[(234+276)÷2]÷0.1×106×10=2.55×1010,C正確;由于稀釋涂布平板法中能夠不斷調整稀釋度,因此利用該方法更易獲得單菌落,D正確。
【易錯辨析】　　兩種微生物計數方法的比較
比較項目 間接計數法稀釋涂布平板法) 直接計數法(顯微計數法)
原理 當樣品的稀釋度足夠高時,培養基表面生長的一個　單菌落　,來源于樣品稀釋液中的一個　活菌　,通過統計平板上的菌落數,就能推測出樣品中大約含有多少活菌 利用特定的細菌計數板或血細胞計數板,在顯微鏡下觀察、計數,再計算一定體積的樣品中微生物的數量
公式 每克樣品中的菌落數= ×M　 (C:某稀釋度下平板上生長的平均菌落數。V:涂布時所用的稀釋液的體積。M:稀釋倍數) 每毫升原液所含細菌數=　每小格內平均細菌數×400×104×稀釋倍數　
缺點 當兩個或多個細胞連在一起時,平板上觀察到的只是一個菌落 　不能區分細胞死活　
結果 比實際值　偏小　 比實際值　偏大　
對點練2　(不定項)下圖為“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數”實驗中樣品稀釋示意圖。據圖分析,下列敘述錯誤的是(　　)。
A.上述過程中采用了稀釋涂布平板法
B.3號試管中的樣品溶液稀釋倍數為103倍
C.5號試管的結果表明每克土壤中的菌株數為1.7×108個
D.該實驗使用的平板和試管較多,最好在使用前做好標記
【答案】　BC
【解析】　據題圖可知,圖中的接種方法為稀釋涂布平板法,A正確;錐形瓶中已經稀釋了10倍,圖中5支試管為梯度稀釋,因此3號試管中的樣品溶液稀釋倍數為104倍,B錯誤;5號試管進行稀釋涂布平板法計數的結果表明每克土壤中的菌株數為(168+175+167)÷3×106÷0.1=1.7×109個,C錯誤;該實驗使用的平板和試管較多,為了避免混淆,最好在使用前做好標記,D正確。
素能提升　選擇培養基與鑒別培養基
項目 選擇培養基 鑒別培養基
制備方法 培養基中加入某些化學物質 在基礎培養基中加入某種特殊的化學物質
原理 依據某些微生物的特殊營養需求或它們對某些化學物質具有的抗性 加入的特殊的化學物質會與某種微生物的代謝物發生反應,產生明顯的特征性變化
用途 將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來 將某種微生物與其他微生物區分開來
舉例 用不加氮源的培養基分離出固氮微生物,用不加碳源的培養基分離出自養型微生物,在培養基中加入青霉素分離出酵母菌等真菌 伊紅—亞甲藍瓊脂培養基可用于鑒別大腸桿菌(出現金屬光澤的深紫色菌落);剛果紅培養基可用于鑒別纖維素分解菌(纖維素被分解后出現透明圈)
在實際應用中,有時需要配制兼具選擇作用和鑒別作用的培養基。例如,金黃色葡萄球菌可以耐高濃度的NaCl,且能利用甘露糖醇產酸,可以根據這些特點來設計培養基,選擇并鑒別金黃色葡萄球菌:在培養基中加入濃度為7.5%的NaCl、甘露糖醇和酸堿指示劑,金黃色葡萄球菌能夠在這種培養基中生長,如果觀察到有些菌落周圍培養基顏色發生變化,可以推測這些菌落是金黃色葡萄球菌,之后再進行進一步鑒定;在“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數”實驗中,如果在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑(常用的酸堿指示劑,pH低于6.6呈現黃色,pH為6.6~8.0顯示橙色,pH高于8.4呈現紅色),能分解尿素的細菌合成的脲酶將尿素分解成NH3,NH3使培養基的pH升高,使指示劑變紅,可以初步鑒定尿素分解菌,這種培養基則是一種既有選擇作用又有鑒別作用的培養基。
1.(改編)廚房中的廚余垃圾多為濕垃圾,濕垃圾處理的有效方法之一是用微生物對其進行降解。回答下列問題:
(1)餐廚垃圾高溫堆肥是垃圾分類處理的常用方式。研究人員擬篩選出耐鹽、嗜熱的油脂降解菌用于餐廚垃圾高溫堆肥,為此進行篩選目的菌實驗。他們從餐廚垃圾處理廠取土壤制成浸出液,接種至含有上述培養基的錐形瓶中,在50 ℃、160 r/min的條件下振蕩培養。振蕩培養的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出兩點)。上述操作有利于篩選出目的菌,主要體現在　　　　　　　　　　　　　　　　　　等方面。
(2)振蕩培養后,用　　　　　　　　　　將菌液接種到固體培養基上,進而挑選出分解油脂能力強的菌株。餐廚垃圾中油脂成分復雜,為驗證挑選出的某種菌株的應用前景,在最佳條件下利用該菌株處理色拉油(食用植物油)、餐飲油(從餐飲廢水中提取,含動物脂、植物油等多種成分)等油脂,實驗結果如圖1所示。圖中結果表明該菌株　　　　(填“適合”或“不適合”)用于餐廚垃圾堆肥,依據是　 。
圖1
(3)科研人員為篩選高效降解淀粉的菌種應用于垃圾處理,進行了如圖2所示的試驗過程。
圖2
A.配制培養基后需進行滅菌處理,常用的滅菌方法是　　　　　　　　。培養基中加入的碳源是　　　　。據圖2,菌落①與菌落②周圍產生了透明圈,產生透明圈的原因是　。
B.對同一濃度的高效降解淀粉的菌種稀釋液,分別用血細胞計數板計數和稀釋涂布平板法計數,若不存在實驗失誤操作,則前者的數量多于后者,其原因是 　。
【答案】　(1)增大溶氧量、增大菌種與培養液的接觸面積　增大了目的菌的數量,使目的菌成為優勢菌種　(2)稀釋涂布平板法或平板劃線法　適合　該菌株能使色拉油和餐飲油中的油脂含量下降　(3)A.高壓蒸汽滅菌法(溫熱滅菌法)　淀粉　淀粉遇碘液顯藍色,產淀粉酶的菌落周圍淀粉被水解,形成透明圈　B.前者中該菌是分散的,活菌和死菌一起計數;后者只計數活菌,且存在多個菌株形成一個菌落的情況
【解析】　(1)振蕩培養既可以增大溶氧量,也可以增大菌種與培養液的接觸面積。振蕩培養可以增大目的菌的數量,且能使其成為優勢菌種,減少其他雜菌的比例,有利于篩選出目的菌。(2)稀釋涂布平板法或平板劃線法都可以將菌液接種到固體培養基上;分析圖1可知,該菌株能使色拉油和餐飲油中的油脂含量下降,適合用于餐廚垃圾堆肥。(3)培養基滅菌常用高壓蒸汽滅菌法(濕熱滅菌法)。本實驗目的是篩選高效降解淀粉的菌種,為了抑制不能分解淀粉的菌種的繁殖,培養基中需加入淀粉作為唯一碳源。淀粉遇碘液顯藍色,產淀粉酶的菌落周圍的淀粉被水解,因此會形成透明圈,圖中菌落①與菌落②周圍產生了透明圈,說明菌落①與菌落②能產生淀粉酶。對同一濃度的高效降解淀粉的菌種稀釋液,分別用血細胞計數板計數和稀釋涂布平板法計數,血細胞計數板計數是將該菌的活菌和死菌一起計數,而稀釋涂布平板法可能存在多個菌株形成一個菌落的情況,只計數一個活菌,因此若不存在實驗失誤操作,前者的數量多于后者。
2.(2023·北京期末)研究發現,感染毛霉能誘導臍橙產生具有抗病活性的紅色物質——CPRE。為探究CPRE能否替代化學殺菌劑保護采收后的臍橙,科研人員進行了研究。
(1)據表1配方配制培養基,溶解后分裝到錐形瓶中,用　　　　　　　　　　　法滅菌后冷卻至50 ℃左右倒平板。分別加入濃度為25、50、100、200 μg/mL的CPRE無菌溶液,搖勻備用,以無菌水作為對照。本培養基的氮源是　　　　。
表1　馬鈴薯培養基配方
成分 含量
馬鈴薯 200 g
葡萄糖 20 g
瓊脂 15~20 g
蒸餾水 定容至1000 mL
(2)將含不同濃度CPRE的培養基分別涂于載玻片上凝固后,接種20 μL指狀青霉孢子懸浮液,在適宜條件下培養一段時間后,用顯微鏡觀察孢子萌發情況。各組萌發率的計算公式為:視野內萌發孢子數/視野內孢子總數×100%。根據萌發率計算實驗組的萌發抑制率,計算公式為　　　　　　　　　　　　　　　　　　。統計結果表明,CPRE能抑制指狀青霉孢子萌發,且隨濃度的增加抑制效果增強。
(3)將直徑為0.5 cm的指狀青霉菌餅反貼在含不同濃度CPRE的培養基上,每個培養皿貼3塊,適宜條件下培養,每24 h測量菌餅直徑(單位:cm),計算平均值。結果見表2。
表2
時間 濃度/(μg/mL)
0 25 50 100 200
第1天 1.10 0.80 0.70 0.51 0.51
第2天 1.90 1.30 0.70 0.68 0.51
第3天 2.20 1.70 0.90 0.68 0.52
實驗結果說明 　。
(4)為進一步研究CPRE抑制指狀青霉的機理,研究者進行了如下檢測。
①檢測不同濃度CPRE處理,菌絲幾丁質(真菌細胞壁的主要成分)含量和胞外AKP酶活性,結果如圖1和圖2。
圖1
圖2
注:AKP酶(堿性磷酸酶)由細胞合成后分泌到細胞壁與細胞膜的間隙。
圖1和圖2的結果表明,CPRE改變了細胞壁的結構和功能,判斷依據是 。
②取指狀青霉菌絲用碘化丙啶(與DNA結合產生紅色熒光的染料)進行染色。結果為 ,說明CPRE破壞了細胞膜的完整性。
(5)請結合以上研究分析說明CPRE抵御指狀青霉感染的作用機制,并闡述臍橙受到“傷害”時才會啟動防御機制的意義: 。
【答案】　(1)高壓蒸汽滅菌(濕熱滅菌)　馬鈴薯　(2)(對照組萌發率-實驗組萌發率)/對照組萌發率　(3)CPRE可抑制指狀青霉的生長,一定范圍內隨CPRE濃度的增加,抑制效果增強　(4)①CPRE使青霉菌細胞壁中幾丁質的含量下降;隨CPRE濃度和時間的增加,胞外AKP酶活性升高　②對照組菌內無熒光,實驗組菌內出現紅色熒光,并隨CRPE濃度增加熒光強度增強　(5)CPRE破壞指狀青霉細胞壁和細胞膜,從而抑制指狀青霉孢子的萌發和菌體的生長,減少了指狀青霉的感染。受到“傷害”才啟動防御機制,有利于物質和能量的合理分配,避免浪費,利于植物的生長和繁殖
【解析】　(1)可用高壓蒸汽滅菌法對培養基進行滅菌。培養基中的葡萄糖和馬鈴薯都可以為微生物提供碳源,馬鈴薯還可以提供氮源。(2)各組萌發率的計算公式為視野內萌發孢子數/視野內孢子總數×100%,則根據萌發率計算實驗組的萌發抑制率的公式為(對照組萌發率-實驗組萌發率)÷對照組萌發率。(3)根據表2中的數據可知,與對照組相比,加入CPRE的培養基上菌餅直徑變小,說明CPRE可抑制指狀青霉的生長,一定范圍內隨CPRE濃度的增加抑制效果增強。(4)①據圖可知,CPRE使青霉細胞壁中幾丁質的含量下降;隨CPRE濃度和時間的增加,胞外AKP酶活性升高,說明CPRE改變了細胞壁的結構和功能。②由于只有活細胞的細胞膜具有選擇透過性,而對照組菌內無熒光,實驗組菌內出現紅色熒光,并隨CRPE濃度增加熒光強度增強,則說明CPRE破壞了細胞膜的完整性。(5)略。
【隨堂檢測】
課堂小結 課堂小測
1.以尿素為唯一氮源的平板能分離出可以合成脲酶的微生物。 (√) 2.在用涂布器涂布平板時,為了操作方便可完全打開培養皿的皿蓋。 (×) 3.可使用平板劃線法統計活細菌總數。 (×) 4.統計菌落數目時,統計的菌落數就是活菌的實際數目。 (×) 5.血細胞計數板既可用于酵母菌的數量測定,也可用于細菌的數量測定。 (×) 6.接種后未長出菌落的培養基可直接丟棄。 (×)
2

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