資源簡介

3.2基因工程的基本操作程序的學案
【學習目標】
1.簡述PCR的原理、條件及過程。
2.簡述基因表達載體的組成及構建過程。
3.闡明將目的基因導入受體細胞的方法。
4.闡明目的基因的檢測與鑒定的方法。
【學習重難點】
教學重點
基因工程基本操作程序的四個步驟。
2、教學難點
（1）從基因文庫中獲取目的基因。
（2）利用PCR技術擴增目的基因。
【預習新知】
第一步：目的基因的篩選與獲取
1．目的基因
(1)概念：用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因。
(2)實例：培養轉基因抗蟲棉用到的目的基因是Bt抗蟲蛋白基因。
2．篩選合適的目的基因
(1)較為有效的方法：從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選。
(2)實例：在培育轉基因抗蟲棉之前，科學家不僅掌握了Bt基因的序列信息，也對Bt基因的表達產物——Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解。
(3)認識基因結構和功能的技術方法：DNA測序技術、遺傳序列數據庫、序列比對工具。
3．利用PCR獲取和擴增目的基因
(1)PCR的含義：PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫，它是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。
(2)條件：DNA模板、分別與兩條模板鏈結合的2種引物、四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶。
(3)過程：
①變性：溫度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受熱變性后解為單鏈。
②復性：溫度下降到50 ℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。
③延伸：溫度上升到72 ℃左右時，溶液中四種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子鏈。
④重復循環多次。
(4)結果：每次循環后目的基因的量增加一倍，即成指數形式擴增(約為2n)。
第二步：基因表達載體的構建
1.操作目的
使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠
作用。
2.基因表達載體的組成及其作用
一個基因表達載體的組成，除了 、 外，還必須有 、 等(如圖所示)。
3.基因表達載體的構建過程
(1)用一定的 切割載體，使其出現一個有黏性末端(或平末端)的切口。
(2)用 種或 的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)加入適量 ，使切下的目的基因片段拼接到載體的切口處。
第三步：將目的基因導入受體細胞
1.轉化的含義:_____ 目的基因____進入受體細胞內,并且在受體細胞內__維持穩定_______和__表達___的過程。
2.轉化的方法:
①導入植物細胞:花粉管通道法和____農桿菌轉化法_________。
②導入動物細胞:
③導入微生物細胞:用__Ca2+__處理大腸桿菌，使細胞處于一種能吸收周圍環境中
DNA分子的生理狀態。
第四步：目的基因的檢測與鑒定
1.分子水平的檢測
(1)導入水平
①技術手段： 等技術。
②檢測目的：檢測受體細胞的 上是否插入了 。
(2)轉錄水平
①技術手段： 等技術。
②檢測目的：檢測目的基因是否轉錄出了 。
(3)翻譯水平
①技術手段： 技術。
②檢測目的：檢測目的基因是否 。
2.個體水平的鑒定
(1)鑒定方法：例如通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲
(2)鑒定目的：確定目的基因是否賦予了轉基因生物特定的 及程度。
【易錯提示】
1．基因工程操作過程中堿基互補配對現象
基因工程操作過程中只有第三步“將目的基因導入受體細胞”沒有堿基互補配對現象；第一步篩選與獲取目的基因，用人工合成、PCR獲取或基因文庫獲取，三種常用方法都涉及堿基互補配對；第二步基因表達載體的構建中DNA連接酶連接目的基因與質粒載體，第四步利用分子雜交的方法檢測(DNA、mRNA)，也都存在堿基互補配對現象。
2．關于不同分子水平檢測的原理、場所、探針的異同
(1)原理：進行轉錄水平的檢測原理與復制水平的檢測原理是相似的，都遵循堿基互補配對原則，只是被檢測的物質不再是轉基因生物的基因組DNA，而是轉基因生物的細胞內的mRNA；進行翻譯水平的檢測，則是利用抗原與抗體特異性結合的原理。
(2)場所：不論是復制水平、轉錄水平還是翻譯水平的檢測，都是在體外進行的。
(3)探針：在DNA分子、mRNA分子上檢測目的基因是否插入、目的基因是否轉錄時，用的探針都是放射性同位素等標記的含有目的基因的DNA片段。
【深化探究】
1997年，我國政府首次批準商業化種植轉基因抗蟲棉。到2015年，我國已經育有轉基因抗蟲棉新品種100多個，減少農藥用量約40萬噸，增收節支社會經濟效應約450億元。Bt基因進入受體細胞后，是否穩定存在和表達，只有通過檢測與鑒定才能知道，這也是檢查轉基因抗蟲棉是否培育成功的一步。請回答下列問題。
1.該基因工程中的目的基因和載體分別是什么
提示：從題圖中可以看出:目的基因是Bt毒蛋白基因,載體是Ti質粒
2.一般情況下,為什么要用同一種限制酶處理目的基因和載體
提示：用同一種限制酶處理目的基因和載體,可以獲得相同的黏性末端,便于構建基因表達載體。
3.該實例中,采用何種方法導入目的基因
提示：采用的方法是農桿菌轉化法
4.目的基因怎樣整合到染色體的DNA上
提示：由于Ti質粒上的T-DNA可轉移到受體細胞且能整合到受體細胞的染色體DNA上,而目的基因插入T-DNA上,所以目的基因可以整合到受體細胞的染色體DNA上。
5.該實例中,檢測目的基因是否成功表達的常見方法有哪兩種
提示：抗原—抗體雜交法、用棉葉飼喂棉鈴蟲
6.轉基因抗蟲棉抗蟲的原理是什么 (生命觀念:結構與功能觀)
提示: Bt毒蛋白基因是從蘇云金芽孢桿菌中分離出來的抗蟲基因。當害蟲食用含有轉基因的植物時,Bt毒蛋白基因編碼的蛋白質會進入害蟲的腸道,在消化酶的作用下,蛋白質能夠降解成相對分子質量比較小的、有毒的多肽。多肽結合在腸上皮細胞的特異性受體上,會導致細胞膜穿孔,細胞腫脹裂解,最后造成害蟲死亡。
【鞏固訓練】
（一）鞏固訓練
1.新型冠狀病毒S蛋白的受體結構域（RBD）是介導病毒進入宿主細胞的關鍵結構。我國科研人員將GP67基因（指導合成一段信號肽，該信號肽引導新合成的蛋白分泌到細胞外）與RBD基因融合，構建融合基因，大量生產RBD蛋白，用于制備疫苗，流程如圖所示。下列相關敘述正確的是( )
A.過程①的理論基礎是生物的密碼子是共用的
B.過程②中融合基因被直接注射到受精卵內
C.過程③需用PCR技術檢測RBD是否成功合成
D.過程④分離獲得RBD無需裂解細胞
2.為提高大豆對磷元素的吸收能力，研究人員利用農桿菌轉化法將水稻的耐低磷基因OsPTF轉移到大豆植株中，如圖為重組Ti質粒上T-DNA的序列結構示意圖。下列相關敘述不正確的是( )
A.以水稻RNA為模板通過反轉錄及PCR擴增可獲得大量OsPTF基因
B.RNA聚合酶與啟動子1識別并結合后，啟動抗除草劑基因的轉錄
C.可用含除草劑的選擇培養基篩選含有目的基因的大豆愈傷組織
D.用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切重組Ti質粒后，經電泳分離至少得到三條帶
3.野生油菜（P1）具有低芥酸、抗病蟲害等特性，為了改良甘藍型油菜（P2），研究人員將兩種植物的體細胞進行融合獲得了雜種植物F1，然后加入一對引物進行PCR鑒定，結果如圖所示。下列敘述不正確的是( )
A.用PEG可促進兩個親本的原生質體融合
B.泳道M從下到上表示長短不同的DNA片段
C.本實驗中引物能與DNA上多個不同位點結合
D.F1-2最可能是有低芥酸、抗病蟲害等特性的雜種油菜
4.下列關于目的基因導入受體細胞的描述，不正確的是( )
A.我國科學家將Bt基因導入棉花細胞采用了農桿菌轉化法
B.顯微注射技術是轉基因動物中采用最多的方法
C.大腸桿菌細胞最常用的轉化方法是：Ca2+處理細胞
D.農桿菌轉化法是將目的基因導入植物細胞最常用的方法
5.利用外源基因在受體細胞中表達,可生產人類所需要的產品。下列各項中能說明目的基因完成了在受體細胞中表達的是( )
A.棉花二倍體細胞中檢測到細菌的抗蟲基因
B.大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNA
C.山羊乳腺細胞中檢測到人生長激素DNA序列
D.酵母菌細胞中提取到人干擾素蛋白
6.豬瘟病毒能與豬細胞膜上的LamR受體蛋白結合，進而侵入細胞引起豬瘟。利用基因編輯技術改變LamR受體蛋白基因，使LamR受體蛋白不能與豬瘟病毒正常結合，但不影響其生理功能，從而培育出抗豬瘟病毒豬。該技術主要由Cas9蛋白與向導RNA的復合物共同完成（如圖1所示），其中向導RNA可識別LamR基因中的特定序列。
(1)圖1中向導RNA與LamR基因按照_____________________原則特異性結合，Cas9蛋白切割LamR基因作用的化學鍵為_________________________。DNA雙鏈斷裂后，再通過隨機增添、刪除或替換部分堿基對，從而實現對LamR基因改造。實驗發現，CRISRP/Cas9基因編輯技術有時存在編輯對象出錯而造成“脫靶”，向導RNA的序列越短脫靶率越高。試分析脫靶最可能的原因_________________________。
(2)將改造好的LamR基因進行PCR擴增，由于LamR基因兩端沒有限制酶識別序列，為了保證LamR基因能正確插入質粒（如圖2）中，需要在兩種引物的5’端分別添加__________限制酶的識別序列。至少擴增_________次即可出現兩端帶上限制酶識別序列的LamR基因。
(3)構建好基因表達載體后，可用______________方法將重組質粒導入到豬受精卵中。請寫出從個體水平檢測抗豬瘟病毒豬培育成功的方法________________。
參考答案
1.答案：D
解析：過程①是將一個基因與另一個基因拼接在一起的過程，該過程的理論基礎是二者具有相同的空間結構和基本組成單位，A錯誤；圖示是利用動物細胞培養技術獲得RBD的技術流程，過程②中可將融合基因導入可在體外增殖的任意一種昆蟲細胞，而不是一定注射到受精卵內，B錯誤；由題意可知，RBD合成后會被分泌到細胞外，過程③中檢測RBD是否成功合成應進行抗原—抗體雜交，過程④分離獲得RBD無需裂解細胞，從培養液中分離既可，C錯誤、D正確。
2.答案：BD
解析：以水稻RNA為模板通過反轉錄可以合成cDNA，然后再以cDNA為模板利用PCR擴增可獲得大量OsPTF基因，A正確；據圖分析可知，抗除草劑基因位于啟動子2的后面，因此RNA聚合酶與啟動子2識別并結合后，啟動抗除草劑基因的轉錄，B錯誤；由于圖中T-DNA的序列中含有目的基因和抗除草劑基因，故可用含除草劑的選擇培養基篩選含有目的基因的大豆愈傷組織，C正確；質粒為環狀DNA，因此用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切重組Ti質粒后，至少會得到OsPTF基因片段及剩余部分的片段，D錯誤。
3.答案：D
解析：用化學試劑PEG可促進兩個親本的原生質體融合，A項正確；泳道M從下到上表示長短不同的DNA片段，B項正確；由電泳結果可知，本實驗中引物能與DNA上多個不同位點結合，C項正確；通過圖片中電泳結果看出，F1-1具有P1、P2的部分遺傳信息，其最可能是有低芥酸、抗病蟲害等特性的雜種油菜，D項錯誤。
4.答案：A
解析：我國科學家將Bt基因導入棉花細胞采用了花粉管通道法，A錯誤；顯微注射技術是將目的基因導入動物細胞最有效的方法，B正確；Ca2+處理法能使大腸桿菌細胞的生理狀態發生改變，使之成為易于吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，C正確；在自然條件下，農桿菌侵染雙子葉植物和裸子植物，因此農桿菌轉化法是將目的基因導入植物細胞最常用的方法，但大多數單子葉植物不適用，D正確。
5.答案：D
解析：棉花二倍體細胞中檢測到細菌抗蟲基因,說明目的基因已經成功導入受體細胞,但不能說明目的基因在受體細胞中已經完成表達,A錯誤;大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNA,說明目的基因已經成功導入受體細胞并轉錄,但不能說明目的基因完成了表達過程,B錯誤;山羊乳腺細胞中檢測到人生長素DNA序列,說明目的基因已經成功導入受體細胞,但不能說明目的基因在受體細胞中已經完成表達,C錯誤;酵母菌細胞中提取到人干擾素蛋白,說明目的基因已經在受體細胞中完成了表達,D正確。
6.答案：(1)堿基互補配對；磷酸二酯鍵；非基因編輯對象也可能含有與向導RNA配對的堿基序列，造成向導RNA選錯對象與之錯誤結合而脫靶
(2)EcoRI、PstI；3/三
(3)顯微注射；接種豬瘟病毒，不患病則培育成功

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