資源簡介

1.2.1微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)的學(xué)案
【學(xué)習(xí)目標(biāo)】
1.闡明在發(fā)酵工程中滅菌是獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的前提。
2.闡明無菌技術(shù)是在操作過程中，保持無菌物品與無菌區(qū)域不被微生物污染的技術(shù)。
3.概述平板劃線法和稀釋涂布平板法是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物分離和純化的常用方法。
【學(xué)習(xí)重難點(diǎn)】
【教學(xué)重點(diǎn)】
1.微生物純培養(yǎng)的基本操作要求，微生物選擇培養(yǎng)的原理。
2.酵母菌的純培養(yǎng)。
3.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)。
【教學(xué)難點(diǎn)】
1.酵母菌的純培養(yǎng)。
2.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)。
【預(yù)習(xí)新知】
培養(yǎng)基的配制
1．培養(yǎng)基
人們按照微生物對___________的不同需求，配制出的供其________的營養(yǎng)基質(zhì)。
2．培養(yǎng)基的用途：用以培養(yǎng)、分離、鑒定、________或____________。
3．培養(yǎng)基的配方
(1)各種培養(yǎng)基一般都含有水、________(提供________的物質(zhì))、________(提供氮元素的物質(zhì))和無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)。如下表為某微生物培養(yǎng)基的成分：
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 瓊脂 H2O
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 定容至 1 000 mL
該培養(yǎng)基中可以為微生物提供氮源的是________，可以為微生物提供碳源的是________和________。此培養(yǎng)基中加入了________，為固體培養(yǎng)基。
(2)還需要滿足微生物生長對pH、____________以及O2的需求。
微生物 乳酸桿菌 霉菌 細(xì)菌 厭氧微生物
特殊 需求 添加維生素 pH調(diào)至 酸性 pH調(diào)至中性 或弱堿性 提供無 氧環(huán)境
答案：
1．營養(yǎng)物質(zhì)　生長繁殖
2．保存微生物　積累其代謝物
3．(1)碳源　碳元素　氮源　尿素　葡萄糖　尿素　瓊脂(2)特殊營養(yǎng)物質(zhì)
無菌技術(shù)
1．獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵：防止__________。
2．消毒和滅菌
消毒 滅菌
概念 使用較為___的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體____或內(nèi)部一部分微生物 使用____的理化方法殺死物體內(nèi)外____的微生物，包括_______
常用方法 ___消毒法、巴氏消毒法、___消毒法、紫外線消毒法 ____滅菌、干熱滅菌、____滅菌
適用對象 操作空間、雙手等 接種環(huán)、接種針、玻璃器皿、培養(yǎng)基等
3.具體操作
(1)對實(shí)驗(yàn)操作的____、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和___。
(2)將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行____。
(3)為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在_________附近進(jìn)行。
(4)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與__________接觸。
微生物的純培養(yǎng)
1．純培養(yǎng)：在微生物學(xué)中，將接種于_____內(nèi)，在合適條件下形成的含_______的群體稱為培養(yǎng)物。由_________所獲得的微生物群體稱為純培養(yǎng)物，獲得________的過程就是純培養(yǎng)。
2．微生物純培養(yǎng)的步驟：微生物的純培養(yǎng)包括配制培養(yǎng)基、____、____、分離和培養(yǎng)等步驟。
3．酵母菌的純培養(yǎng)
(1)菌落：分散的微生物在適宜的________表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的__________。
(2)獲得單菌落的方法：_______法和__________法。
【易錯(cuò)提示】
無菌操作中的注意事項(xiàng)
(1)用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒效果最好，原因是濃度過高，使菌體表面蛋白質(zhì)凝固形成一層保護(hù)膜，酒精不能滲入其中；濃度過低，殺菌力減弱。
(2)接種室、接種箱和超凈工作臺在使用前，可以用紫外線照射30 min，以殺死物體表面或空氣中的微生物。在照射前，適量噴灑石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加強(qiáng)消毒效果。
(3)芽孢是某些細(xì)菌生長到一定階段，在細(xì)胞內(nèi)形成的休眠體。孢子是某些微生物的繁殖體。
(4)一般情況下，在實(shí)驗(yàn)操作過程中，對能滅菌的對象進(jìn)行滅菌處理，如培養(yǎng)皿及用到的各種器具；對無法滅菌的對象則進(jìn)行消毒處理，如實(shí)驗(yàn)操作者的衣著和雙手等。
(5)與煮沸消毒法相比，巴氏消毒法的優(yōu)點(diǎn)是在達(dá)到消毒目的的同時(shí)，營養(yǎng)物質(zhì)損失較少。
(6)無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還能有效避免污染環(huán)境以及操作者自身被微生物感染。
【深化探究】
1．(科學(xué)探究)請結(jié)合倒平板的操作程序探究：
(1)如圖一所示，為什么要使錐形瓶的瓶口通過火焰？
(2)如圖二所示，從防止雜菌污染的角度思考，為什么培養(yǎng)基冷卻凝固后將平板倒置？
(3)怎樣判斷培養(yǎng)基制備是否合格、成功，是否受到污染？
(1)提示：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。
(2)提示：培養(yǎng)基冷卻凝固后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以避免培養(yǎng)基中的水分過快地蒸發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基造成污染。
(3)提示：將未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫一段時(shí)間后，如果無菌落生長，說明培養(yǎng)基制備成功、合格，未受到污染。
2．(科學(xué)思維)請結(jié)合平板劃線法探究：
(1)平板劃線操作時(shí)，需要對接種環(huán)灼燒滅菌，比較下列灼燒滅菌的目的。
項(xiàng)目 目的
蘸取菌液前灼燒
每次劃線前灼燒
劃線結(jié)束后灼燒
(2)在做第二次劃線以及其后的操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？
提示：(1)避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染菌種　殺死上一次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)接種環(huán)上的菌種直接來自上一次劃線的末端　及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免菌種污染環(huán)境和感染操作者
(2)劃線的末端含有的細(xì)菌數(shù)目較少，每次從上一次的末端開始劃線能夠使細(xì)菌的數(shù)目隨劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終分散成單個(gè)細(xì)胞。
【鞏固訓(xùn)練】
1.安全工作，人人有責(zé)。為了確保實(shí)驗(yàn)室中微生物實(shí)驗(yàn)操作的安全性，需要實(shí)驗(yàn)者遵循基本的安全規(guī)則，下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是( )
A.所有微生物實(shí)驗(yàn)的操作者必須要穿實(shí)驗(yàn)服、戴防護(hù)鏡等
B.處理微生物實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，必須遵守?zé)o菌操作的規(guī)程
C.微生物實(shí)驗(yàn)材料丟棄前必須要進(jìn)行滅菌處理
D.必須禁止在實(shí)驗(yàn)室吃喝東西
2.將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基都放入37℃恒溫箱的目的是( )
A.對比觀察培養(yǎng)基有沒有被微生物利用
B.對比分析培養(yǎng)基上是否生有雜菌
C.沒必要放入未接種的培養(yǎng)基
D.為了下次接種時(shí)再使用
3.培養(yǎng)基需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及O2的需求。下列敘述錯(cuò)誤的是( )
A.培養(yǎng)霉菌時(shí)，培養(yǎng)液調(diào)至酸性
B.培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，培養(yǎng)基調(diào)至強(qiáng)堿性
C.培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)，提供無氧的條件
D.培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)，培養(yǎng)基中添加維生素
4.下列關(guān)于消毒、滅菌及無菌操作的敘述，錯(cuò)誤的是( )
A.消毒就是要?dú)⑺牢矬w內(nèi)外所有的微生物
B.操作者的雙手可以用酒精擦拭進(jìn)行消毒
C.接種室和工作臺可以用紫外線進(jìn)行消毒
D.玻璃器皿可以采用干熱滅菌法進(jìn)行滅菌
5.下表為某培養(yǎng)基的部分配方，下列有關(guān)敘述正確的是( )
成分 蛋白胨 葡萄糖 K2HPO4 瓊脂 FeSO4 蒸餾水
含量 10g 10g 2g 15g 0.5g 1000mL
A.配制培養(yǎng)基、倒平板、接種均需要在酒精燈火焰旁進(jìn)行
B.該培養(yǎng)基的有機(jī)碳源包括蛋白胨、葡萄糖和瓊脂
C.除去蛋白胨，該培養(yǎng)基可用于選擇培養(yǎng)固氮微生物
D.倒好的平板需立即使用，以免表面干燥，影響細(xì)菌的生長
6.3—苯氧基苯甲酸（簡稱為3—PBA，分子式C13H9O3）是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解中間產(chǎn)物，自然條件下難降解、易產(chǎn)生遷移和蓄積，具有較大的危害性。我國研究團(tuán)隊(duì)通過“土壤取樣→富集培養(yǎng)→純化培養(yǎng)→菌種鑒定→提取和分離降解酶”途徑開展了降解3—PBA的相關(guān)研究。經(jīng)鑒定，從土壤中分離到的菌種為米曲霉。回答下列問題：
（1）純化培養(yǎng)時(shí)，制備固體培養(yǎng)基的一般流程是：計(jì)算→稱量→溶化→_________→_________。用平板劃線法分離米曲霉時(shí)，需要使用_________挑取菌落，劃線的某個(gè)平板培養(yǎng)后第一劃線區(qū)域的劃線上都不間斷地長滿了菌落，其他區(qū)域的劃線上卻均無菌落。操作失誤的原因可能是________。
（2）富集培養(yǎng)和純化培養(yǎng)都使用以3—PBA作唯一_________的_________培養(yǎng)基，原因是：_________。
（3）下圖為不同濃度3-PBA對米曲霉干重的影響。由下圖可知，降解菌干重先增加后減少的原因是_________。
參考答案
1.答案：A
解析：所有微生物實(shí)驗(yàn)的操作者必須要穿實(shí)驗(yàn)服,但不一定都要戴上防護(hù)鏡,A錯(cuò)誤。
2.答案：B
解析：未接種的培養(yǎng)基作為空白對照，將接種后的培養(yǎng)基和未接種的培養(yǎng)基同時(shí)放入37℃的恒溫箱中，可以對比分析培養(yǎng)基上是否生有雜菌。
3.答案：B
解析：培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，需要將培養(yǎng)基調(diào)至中性或弱堿性，B錯(cuò)誤。
4.答案：A
解析：A、無菌操作包括滅菌和消毒，消毒只殺死一部分微生物，A錯(cuò)誤；
B、超凈工作臺和操作者雙手可以使用酒精消毒，B正確；
C、空氣、接種室和工作臺可以用紫外線消毒，C正確；
D、玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法進(jìn)行滅菌，D正確。
故選A。
5.答案：C
解析：A、培養(yǎng)基配制好后需要進(jìn)行滅菌，故配制培養(yǎng)基過程不需要在酒精燈火焰旁進(jìn)行，A錯(cuò)誤;B、瓊脂只是凝固劑，不是碳源，B錯(cuò)誤;C、除去蛋白胨，該培養(yǎng)基就是無氮培養(yǎng)基，只有利用空氣中的氮?dú)庾鳛榈吹墓痰⑸锬軌蛟谏厦嫔L，C正確;D、倒好的平板要等冷卻凝固后再使用，D錯(cuò)誤。
6.答案：
（1）滅菌；倒平板；接種環(huán)；第一區(qū)域劃線結(jié)束，接種環(huán)灼燒后未冷卻
（2）碳源；選擇；只有能分解利用3-PBA的菌株才能生存繁殖
（3）3-PBA作為碳源增多，促進(jìn)降解菌的生長增殖；濃度過高時(shí)，降解菌滲透失水，影響生長
解析：(1)純化培養(yǎng)時(shí)，制備固體培養(yǎng)基的一般流程是:計(jì)算→稱量→溶化→滅菌→倒平板。用平板劃線法分離米曲霉時(shí)，需要使用接種環(huán)進(jìn)行挑取菌落，接種前為了避免雜菌污染，需要灼燒滅菌。劃線的某個(gè)平板培養(yǎng)后第一劃線區(qū)域的劃線上都不間斷地長滿了菌落，其他區(qū)域的劃線上卻均無菌落，其可能原因是第一區(qū)域劃線結(jié)束后，接種環(huán)灼燒滅菌后并未冷卻，直接進(jìn)行了第二劃線區(qū)的劃線操作，使得微生物因高溫而死亡，無法長出菌落;也可能是第二次劃線未從第一區(qū)域的末端開始劃線，導(dǎo)致未獲得菌種。
(2)3-PBA的分子式是C13H9O3，故富集培養(yǎng)和純化培養(yǎng)都使用以3-PBA作唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，這樣的選擇培養(yǎng)基由于只含有3-PBA，大部分的微生物無法分解3-PBA獲取能量，只有能分解利用3-PBA的菌株才能在這樣的培養(yǎng)基上生存繁殖，以增加3-PBA降解菌的數(shù)量。
(3)分析柱狀圖可知，隨著3-PBA濃度增加，降解菌的干重先增加后減少，說明在一定范圍內(nèi)，作為碳源的3-PBA含量增多，促進(jìn)降解菌的生長增殖，但是如果3-PBA的濃度過高時(shí)，高于降解菌細(xì)胞內(nèi)的濃度，會導(dǎo)致降解菌滲透失水，影響生長。

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