資源簡介

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高考生物二輪復習微專題學案
9　PCR技術的熱點考法歸納及融合基因的原理和應用
一、PCR技術的熱點考法歸納
1.熒光定量PCR
例1 熒光定量PCR技術可定量檢測樣本中某種DNA的含量,其原理是在PCR體系中每加入一對引物的同時加入一個與某條模板鏈互補的熒光探針,當耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處,會水解探針,使熒光監測系統接收到熒光信號,即每擴增一次,就有一個熒光分子生成。下列敘述錯誤的是 (　)
A.引物與探針均具有特異性,與模板結合時遵循堿基互補配對原則
B.反應最終的熒光強度與起始狀態模板DNA含量呈負相關
C.耐高溫的DNA聚合酶催化DNA合成的方向總是從子鏈的5'端到 3'端
D.若用上述技術檢測某基因的轉錄水平,則需要用到逆轉錄酶
2.RT-PCR
例2 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中,一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA,再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。下列關于RT-PCR的敘述,正確的是 (　)
A.RT-PCR所用的酶包括逆轉錄酶和Taq DNA聚合酶
B.RT-PCR所用的兩種引物序列不同,兩者間可互補配對
C.RT-PCR反應過程中需要解旋酶解旋
D.正常情況下至少經過3次循環,方可獲取與目的基因等長的DNA單鏈
3.PCR定點突變技術——大引物PCR
例3 [2023·山東青島三模] 大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進行兩輪PCR即可獲得,第一輪加誘變引物和側翼引物,第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物,如圖表示利用大引物PCR對基因M進行定點誘變。下列說法錯誤的是 (　)
A.第一輪PCR中,至少需要2個循環才能獲得相應的大引物
B.第二輪PCR所用的引物是第一輪PCR的產物DNA的兩條鏈
C.擴增的定點誘變產物通常需具備啟動子、終止子等結構才能進行轉錄和翻譯
D.為了使兩輪PCR在同一支試管中進行,設計引物時應考慮不同的復性溫度
4.重疊PCR技術
例4 [2023·遼寧大連一模] “多發性骨性連接綜合征”是由編碼成纖維細胞生長因子(FGF9)的基因突變所致,患者FGF9基因中某堿基對發生替換,使FGF9中相應的氨基酸發生替換。科研人員欲利用基因工程等技術獲得含有該突變基因的模型小鼠,用來研究該病的發病機理。圖甲表示將FGF9 cDNA(由FGF9基因轉錄得到的mRNA逆轉錄而來)進行定點突變得到突變型FGF9 cDNA的流程,圖乙為研究中所用的質粒(SpeⅠ、HindⅢ、SmaⅠ和BglⅡ分別代表相應的限制酶切割位點,以上限制酶切割產生的黏性末端不同)。請回答下列問題:
(1)圖甲虛線方框中的a鏈與d鏈在延伸過程中的作用是既可作為　　　　又可以起到相當于　　　的作用,使　　　　　　　　　　酶能夠從a鏈與d鏈的3'端開始連接脫氧核苷酸。
(2)圖乙質粒中的C序列是　　　　,它是RNA聚合酶識別和結合的部位。圖甲中突變型FGF9 cDNA的a鏈所在的DNA單鏈為轉錄的模板鏈,則引物1和引物4的5'端需分別添加　　　　　　　　(酶)的識別序列,才能與圖乙中的質粒正確連接。
5.反向PCR測定未知DNA區域
例5 如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,簡捷地分析出已知序列兩側的序列,具體流程如下圖(以EcoRⅠ酶切為例):
請據圖回答問題:
(1)若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物,步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是　　　　(從引物①②③④中選擇,填編號)。
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知 序列 5'-AACTATGCGCTCATGAGCAATGCGTAGCCTCT-3' 　||||||||||||||||　|||||||||||||||| 3'-TTGATACGCGAGTACTCGTTACGCATCGGAGA-5'
PCR 引物 ①5'-AACTATGCGCTCATGA-3' ②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3' ③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3' ④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'
(2)對PCR產物測序,經分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列),結果正確的是　　　　。
A.5'-AACTATGCGAGCCCTT-3'
B.5'-AATTCCATGCTGAATT-3'
C.5'-GCAATGCGTTCGGGAA-3'
D.5'-TTGATACGCCGAGTAC-3'
6.巢式PCR
　　　　　　　　　　　　　　　　　
例6 為減少引物與模板之間的非特異性配對,人們對普通PCR技術進行了改良,發明了巢式PCR技術,其原理是利用兩套引物進行兩輪PCR擴增。首先利用第一對引物(外引物)對目的基因所在的DNA進行第一輪擴增(經過15~30次循環),第二輪擴增以第一輪擴增產物為模板,利用第二對引物(內引物或巢式引物)結合在第一輪擴增產物內部,經過15~30次循環,獲得第二輪擴增片段(即目的基因),最終第二輪擴增片段短于第一輪,基本過程如圖所示。下列敘述錯誤的是 (　)
A.兩對引物的堿基序列不相同,但均應為單鏈DNA片段
B.使用外引物至少經過3次循環,才能得到圖示的第一輪擴增產物
C.若第一輪擴增產生錯誤片段,則其進入第二輪擴增的概率極低
D.與巢式PCR相比,普通PCR特異性更強,錯誤率更高
二、融合基因的原理和應用
視野拓展:基因融合是指將兩個或多個基因的編碼區首尾相連,置于同一套調控序列(包括啟動子、增強子、核糖體結合序列、終止子等)控制之下,構成融合基因。
1.融合基因的構建
例7 我國科研人員利用光遺傳學開關控制細胞內的代謝過程,嘗試對糖尿病精準治療。
(1)細胞質基質中的光敏色素(P)是植物細胞的光信號受體,被紅光激活后,其　　　　　　發生改變。與核輸入蛋白(F)結合形成復合體,復合體會被轉運到細胞核中。遠紅光會誘導P和F分離。
(2)受此啟發,科研人員擬構建用于哺乳動物的紅光/遠紅光誘導的開關系統。Gal4蛋白能與誘導型啟動子UAS結合,但不能單獨激活UAS 下游的基因轉錄,VP蛋白不能與UAS結合但可以激活轉錄。
①為實現UAS控制的胰島素基因表達的光調控,需要構建的兩種融合基因是　　　　。
a.P-F融合基因 b.P-Gal4融合基因
c.F-Gal4融合基因 d.F-VP融合基因
e.Gal4-VP融合基因
②將上述兩種融合基因和UAS控制的胰島素基因導入一種通用受體細胞——人胚腎細胞后,在紅光照射下,細胞內形成　　　　　　　　復合體,招募細胞內的　　　　酶與UAS結合,啟動下游胰島素基因的表達。
例8 [2023·北大附中模擬] 癲癇是一種間歇發作的神經系統疾病,發作時表現為大腦特定區域神經元興奮性持續增強。研究人員發現神經元中C蛋白的表達量可指示神經元興奮性變化。
(1)將C蛋白和綠色熒光蛋白融合基因導入作為　　　　的腺相關病毒,感染小鼠神經元。
(2)研究人員用特定藥物誘導小鼠癲癇發作,出現綠色熒光的神經元興奮性　　　　　　。K+通道蛋白廣泛分布于中樞神經系統,激活后可促進K+大量外流并抑制突觸前膜釋放神經遞質。研究人員構建C蛋白、綠色熒光蛋白和不同K+通道蛋白的融合基因并轉入體外培養的神經元中。K+通道蛋白基因的插入位點應為圖中的　 (選取圖中序號)。
2.融合基因的檢測與鑒定
例9 B基因存在于水稻基因組中,其在體細胞和精子中正常表達,在卵細胞中不轉錄。為研究B基因表達對卵細胞的影響,設計并完成了如下實驗來獲取能夠在卵細胞中表達B基因的轉基因植株。請回答下列問題:
注:Luc基因表達的熒光素酶能催化熒光素產生熒光
(1)可利用　　　　　(細胞)中的RNA和PCR技術獲取大量的B基因,該過程需要用到　 酶;獲得B基因中編碼蛋白的序列后,將該序列與Luc基因連接成融合基因(表達的蛋白質能保留兩種蛋白質各自的功能),然后構建基因表達載體。
(2)外植體經　　　　形成的水稻愈傷組織放入農桿菌液浸泡后進行植物組織培養,培養基中需加入　　　　進行篩選。個體水平可以通過　　　　　　　　　　　　　　　　　　　篩選出能表達B基因的轉基因植株。
例10 [2023·福建龍巖三模] 重組PCR技術是一項新的PCR技術,通過重組PCR技術能將兩個不同的DNA連接成為一個新DNA分子。某科研小組從豬源大腸桿菌中擴增得到LTB和ST1兩個基因片段,利用重組PCR技術構建了LTB-ST1融合基因,制備過程如下圖所示。回答下列問題:
(1)從P2、P3兩種引物的角度分析,LTB和ST1基因能夠融合的關鍵是　　　　　　　。PCR1和PCR2不能在同一個反應體系中進行,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　。②過程不需要加入引物,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)科研小組為了檢測是否成功構建出融合基因,將反應后體系中的各種DNA分子進行電泳,結果如圖所示。則融合基因最可能是　　　　,判斷依據是　　　　　　　　　　　。
高考生物二輪復習微專題學案
9　PCR技術的熱點考法歸納及融合基因的原理和應用（參考答案）
例1　B　[解析] 引物與探針均具有特異性,與模板結合時遵循堿基互補配對原則,A正確;模板DNA含量越高,PCR擴增過程中形成的熒光分子越多,因此熒光強度越大,即反應最終的熒光強度與起始狀態模板DNA含量呈正相關,B錯誤;耐高溫的DNA聚合酶催化DNA合成的方向總是從子鏈的 5' 端到 3' 端,C正確;若要用熒光定量PCR技術檢測某基因的轉錄水平,即檢測細胞中 mRNA的含量,則先要將mRNA逆轉錄形成DNA再檢測,故需要用到逆轉錄酶,D正確。
例2　A　[解析] 根據題干信息,RT-PCR所用的酶包括逆轉錄酶和Taq DNA聚合酶,A正確;兩種引物之間不能互補配對,否則不能正常發揮作用,B錯誤;PCR反應過程中高溫即可解旋,不需要解旋酶解旋,C錯誤;正常情況下至少經過2次循環,方可獲取與目的基因等長的DNA單鏈,D錯誤。
例3　B　[解析] 第一輪PCR中,需要先合成一條鏈(即誘變引物延伸的子鏈),再用這條鏈合成互補鏈(大引物),至少需要2個循環才能獲得相應的大引物,A正確;第一輪產物DNA的一條鏈作第二輪PCR擴增的大引物,第二輪PCR仍需加入的另一種引物是側翼引物,B錯誤;若要使目的基因可以表達出蛋白質,則PCR擴增的定點誘變產物上需具備啟動子和終止子,誘導基因轉錄和翻譯,C正確;為了使兩輪PCR反應在同一支試管中進行,引物設計時應考慮不同的復性溫度,第二輪PCR的復性溫度應該比第一輪高,D正確。
例4　(1)模板　引物　耐高溫的DNA聚合
(2)啟動子　HindⅢ和SpeⅠ
[解析] (1)由題圖分析可知:圖甲虛線方框中的a鏈與d鏈在延伸過程中的作用是既可作為模板,又可以起到相當于引物的作用,使耐高溫的DNA聚合酶能夠從a鏈與d鏈的3'端開始連接脫氧核苷酸。(2)圖乙質粒中的C序列是啟動子,位于目的基因的上游,緊挨轉錄的起始位點,是RNA聚合酶識別和結合的部位。圖甲中突變型FGF9 cDNA的a鏈所在的DNA單鏈為轉錄的模板鏈,為了保證目的基因在啟動子和終止子之間且質粒上需要保留啟動子、終止子、復制原點和至少一個標記基因,使用雙酶切可以避免載體自身環化,因此選用HindⅢ和SpeⅠ切割質粒,為了便于目的基因和質粒連接,需要用相同的酶切割目的基因,以產生相同的黏性末端,所以引物1和引物4的5'端需分別添加HindⅢ和SpeⅠ的識別序列,才能與圖乙中的質粒正確連接。
例5　(1)②④
(2)B
[解析] (1)PCR引物是一小段單鏈核苷酸序列,引物5'端的堿基可以與DNA模板鏈的3'端的堿基進行堿基互補配對,可作為DNA復制的起始點,子鏈的延伸方向為5'→3',據題圖分析,結合片段F的已知序列可知,能與已知序列左邊配對的引物為④,能與已知序列右邊配對的引物為②,故步驟Ⅲ選用的PCR引物應為②④。(2)對PCR產物測序,得到片段F的完整序列,因為片段F是被限制酶EcoRⅠ剪切形成的,它識別的序列是GAATTC,且在G與A之間切割,切割之后對DNA兩端的黏性末端進行了補齊,所以5'端應該是AATTC,3'端是GAATT,故選B。
例6　D　[解析] 兩對引物的堿基序列不相同,但均應為單鏈DNA片段,以便與模板互補配對,A正確;根據DNA的半保留復制的特點,可知PCR前兩輪循環產生的四個DNA分子的兩條鏈均不等長,第三輪循環產生的DNA分子存在等長的兩條核苷酸鏈,即僅含引物之間的序列,因此,至少經過3次循環才能得到圖示的第一輪擴增產物,B正確;由于內引物擴增模板是外引物擴增后的產物,第二輪反應能否進行,也是對第一輪反應正確性的鑒定,如果第一輪擴增產生了錯誤片段,則第二輪能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低,C正確;巢式PCR中加入的組分與常規PCR相同,都含有模板、引物、熱穩定的DNA聚合酶、四種游離的脫氧核苷酸、緩沖液、Mg2+等,第一輪擴增中,外引物用以產生擴增產物,此產物在內引物的存在下進行第二輪擴增,從而提高反應的特異性,獲得的產物特異性更強,D錯誤。
例7　(1)空間結構
(2)bd　Gal4-P-F-VP(或VP-F-P-Gal4)　RNA聚合
[解析] (1)光敏色素是一類色素—蛋白復合體,被紅光激活后,其空間結構發生改變。(2)①結合題干“Gal4蛋白能與誘導型啟動子UAS結合,但不能單獨激活UAS下游的基因轉錄,VP蛋白不能與UAS結合但可以激活轉錄”與“細胞質基質中的光敏色素(P)是植物細胞的光信號受體,被紅光激活后與核輸入蛋白(F)結合形成復合體,復合體會被轉運到細胞核中”可知,為實現UAS控制的胰島素基因表達的光調控,需要將激活性質的P與Gal4基因融合,將協助轉運的F(可進入細胞核)與激活轉錄的VP基因融合,故選b、d。②結合題干“P被紅光激活后,其空間結構發生改變,與F結合形成復合體”可知兩種融合基因的表達產物可結合形成Gal4-P-F-VP(或VP-F-P-Gal4)復合體;結合題干“Gal4蛋白能與誘導型啟動子UAS結合”,啟動子是轉錄的起點,轉錄時RNA聚合酶會識別并結合啟動子,開始轉錄,驅動相關基因的表達。
例8　(1)載體
(2)持續增強　C
[解析] (1)某些病毒可以作為目的基因的載體,可將C蛋白和綠色熒光蛋白融合基因作為目的基因導入腺相關病毒,感染小鼠神經元。(2)癲癇是一種間歇發作的神經系統疾病,發作時表現為大腦特定區域神經元興奮性持續增強,神經元中C蛋白的表達量可指示神經元興奮性變化,將C蛋白和綠色熒光蛋白融合基因作為目的基因導入腺相關病毒,感染小鼠神經元,研究人員用特定藥物誘導小鼠癲癇發作,出現綠色熒光的神經元興奮性持續增強。K+通道蛋白基因的插入位點在C基因和綠色熒光蛋白基因之間,即圖中的C位置,才能構建C蛋白、綠色熒光蛋白和不同K+通道蛋白的融合基因并使其在體外培養的神經元中表達。
例9　(1)水稻體細胞或精子　逆轉錄酶和耐高溫DNA聚合
(2)脫分化　潮霉素　加入熒光素后檢測該植株卵細胞中是否發出熒光
[解析] (1)B基因只在水稻體細胞和精子中正常表達,合成相應的RNA,所以從水稻體細胞和精子中提取的RNA才能逆轉錄得到B基因,該過程需要用到逆轉錄酶,PCR過程中需要高溫處理,所以需要耐高溫DNA聚合酶。(2)外植體經脫分化形成愈傷組織。農桿菌在侵染植物時能將Ti質粒上的T-DNA轉移到被侵染的細胞,并且將其整合到該細胞的染色體DNA上,而T-DNA上含有潮霉素抗性基因,所以可以用加潮霉素的培養基篩選出成功導入目的基因的受體細胞。根據注解可知,B基因與Luc基因連接形成B-Luc融合基因,Luc基因表達的熒光素酶能催化熒光素產生熒光,可以通過加入熒光素后檢測該植株卵細胞中是否發出熒光,鑒定和篩選出能表達B基因的轉基因植物。
例10　(1)這兩種引物的部分區域能進行堿基互補配對　P2和P3能結合,會干擾引物和模板鏈的結合,影響PCR過程　兩條母鏈可作為合成子鏈的引物
(2)3　融合基因包含2個不同的基因,其相對分子質量較大,3表示的DNA相對分子質量最大
[解析] (1)LTB和ST1基因能夠融合的關鍵是P2和P3兩種引物的部分區域能發生堿基互補配對;由于P2和P3兩種引物能結合,引物之間的結合會干擾引物和模板鏈的結合,從而影響PCR過程,因此PCR1和PCR2不能在同一個反應體系中進行;②過程不需要加入引物,兩條母鏈可以作為合成子鏈的引物,為DNA聚合酶提供3'端。(2)PCR體系中存在融合和未融合的DNA分子,融合的DNA包括了2個DNA分子片段,其相對分子質量較大。根據電泳圖可知,3號DNA分子的相對分子質量最大,因此3號DNA分子最可能是融合基因。
21世紀教育網 www.21cnjy.com 精品試卷·第 2 頁 （共 2 頁）
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