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新人教生物一輪復習微專題10
題型一　PCR技術的相關計算
1.PCR擴增過程中的循環圖示與規律
2.PCR中的數量關系
循環次數 1 2 3 n
DNA分子數 2 4 8 2n
含引物A(或B)的DNA分子數 1 3 7 2n－1
同時含引物A、B的DNA分子數 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物數量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
3.PCR技術的應用——新冠病毒核酸檢測
(1)RT PCR
RT PCR是將RNA的逆轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式反應(PCR)相結合的技術。首先經逆轉錄酶的作用，由RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，在DNA聚合酶的作用下擴增合成目的片段。
提醒　因為新冠病毒中的核酸為RNA，而RNA極易降解，為了防止RNA在檢測過程中降解，我們把它轉換為更穩定的DNA。
(2)實時熒光定量PCR
實時熒光定量PCR是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累，實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
TaqMan探針法是其中一種檢測方法。探針完整時，熒光報告基團(R基團)發射的熒光信號被熒光淬滅基團(Q基團)吸收；PCR擴增時，耐高溫的DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性將探針酶切降解，使熒光報告基團和熒光淬滅基團分離，從而使熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。
(3)實時熒光定量PCR方法檢測新冠病毒核酸
從樣本中提取病毒RNA，經逆轉錄酶作用形成cDNA。然后以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增，測定樣品中病毒核酸量。
在通過實時熒光定量PCR檢測新冠病毒感染時，檢測到的熒光強度變化如圖所示。與指數增長期相比，線性增長期目的基因數量的增長率下降，可能原因有底物濃度下降、酶活性下降等。Ct值的含義是指在PCR擴增過程中，每個反應管內的熒光信號達到設定的熒光閾值時所經歷的擴增循環數。當樣本中初始模板越多時，Ct值就越小。Ct≤37判定為陽性，Ct>40或無Ct值判定為陰性。上圖所示新冠病毒核酸檢測結果應判定為陽性。
[例1] (2023·山東煙臺期中)熒光定量PCR技術可定量檢測樣本中某種DNA含量。其原理是：在PCR體系中每加入一對引物的同時加入一個與某模板鏈互補的熒光探針，熒光探針兩端分別標記一個熒光發射基團和一個熒光淬滅基團，探針完整時，發射基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，熒光監測系統接收不到熒光信號。當耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處，會水解探針，使熒光監測系統接收到熒光信號。即每擴增一次，就有一個熒光分子生成(如圖所示)。相關敘述正確的是(　　)
A.擴增過程中引物先于探針結合到模板DNA上
B.在PCR系統中需加入解旋酶
C.熒光信號積累越多，說明PCR循環次數越多
D.若擴增n次，則其需要消耗2n－1個探針
答案　C
解析　基因擴增過程中需要特定的引物，該引物的作用是定位基因的位置，與模板鏈結合并為子鏈的延伸提供起點，擴增過程中引物和探針應同時結合到模板DNA上，A錯誤；在PCR反應系統中無需加入解旋酶，可通過高溫解旋DNA，B錯誤；據題干信息“即每擴增一次，就有一個熒光分子生成”可知，熒光信號積累越多，說明PCR循環次數越多，C正確；據題干信息“在PCR反應體系中每加入一對引物的同時加入一個與某模板鏈互補的熒光探針”，即每個DNA分子需要1個探針，擴增n次，可得到2n個DNA分子，則共需要消耗2n－1個探針，D錯誤。
[例2] (2023·湖南雅禮中學調研)新冠病毒是一種單鏈RNA病毒，常用“熒光RT PCR技術”進行檢測，方法是取受檢者的mRNA逆轉錄出cDNA，并大量擴增，用熒光標記的新冠病毒核酸探針來檢測樣品中新冠病毒的核酸含量。請回答下列問題：
(1)“熒光RT PCR技術”所用的試劑盒中通常都應該含有________、________、熒光標記的核酸探針、引物、dNTP、緩沖體系。
(2)如果要同時擴增兩種基因，則試劑盒中的引物應該有________種。圖1為新冠病毒的“ORFlab”基因對應的cDNA片段結構示意圖，則與之對應的引物結合的部位應該是圖中的________(子鏈延伸方向為其自身的5′→3′，用圖中數字作答)。若已知該基因的一條引物，________(填“能”或“不能”)依據其堿基序列設計出另一條引物，理由是______________________________________________
_________________________________________________________________。
圖1
(3)在檢測過程中，隨著PCR的進行，反應產物不斷積累，熒光信號的強度也隨之增加。根據熒光強度的變化監測產物量的變化，得到一條熒光擴增曲線(如圖2)。
圖2
①出現“平臺期”最可能的原因是_______________________________________
__________________________________________________________________。
②理論上，在檢測過程中，有熒光信號出現，則說明檢測結果呈________(填“陰”或“陽”)性，但為了保證檢測結果的準確性，一般要達到或超過閾值時才確診。現有兩個待檢樣本，檢測時都出現了如圖2所示的曲線，但甲的A點比乙的A點明顯左移。請給這種結果作出科學合理的解釋(試劑盒合格且正常，操作過程規范且準確)：______________________________________________
____________________________________________________________________。
答案　(1)逆轉錄酶　耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)(兩空順序可顛倒)　(2)4　4、1　不能　兩種引物的堿基序列沒有相關性
(3)①試劑盒中的原料、引物和探針數量一定，超出一定的循環數后，熒光分子不再增加　②陽　甲樣本中的新冠病毒核酸含量更高，達到閾值所需的循環數更少
解析　(1)根據題目信息可知，熒光RT PCR技術基本原理是將新冠病毒RNA逆轉錄為cDNA，因此熒光RT PCR技術所用的試劑盒中通常都應該含有逆轉錄酶、耐高溫的DNA聚合酶、引物、四種脫氧核苷酸、緩沖體系。(2)根據PCR的原理，在擴增DNA分子時每一條鏈均需與相應的引物結合才能進行擴增，因此如果要將兩種基因分別擴增出來，則在試劑盒中的引物應該有4種；在利用PCR擴增DNA分子過程中，DNA聚合酶只能從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，又由于DNA的兩條鏈是反向平行的，所以引物與DNA分子單鏈的3′端(—OH)相結合即圖示中的1和4所示部位。由于兩段引物的堿基序列沒有相關性，既不相同，也不互補，因此不能根據該基因一條引物的堿基序列設計出另一條引物。(3)①分析熒光擴增曲線圖，圖中曲線通過熒光強度變化反映產物量的變化，因此曲線中出現“平臺期”最可能的原因是試劑盒中的原料和探針數量一定，超出一定的循環數后，熒光強度不再增加。②理論上，在檢測過程中，有熒光信號出現，則說明檢測結果呈陽性，但為了保證檢測結果的準確性，一般要達到或超過閾值時才確診。檢測結果甲的A點比乙的A點明顯左移，說明甲樣本中的新冠病毒核酸含量更高，達到閾值所需的循環數更少。
題型二　DNA片段電泳與遺傳試題的綜合
DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團帶有正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。不同大小的DNA片段遷移速率不同，凝膠中的DNA分子通過染色可在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來。因此瓊脂糖凝膠電泳能夠用于分離、鑒定和純化DNA片段。等位基因由基因突變而來，若一對等位基因A、a經過限制酶切割后形成的DNA片段分子量不同，則在電場作用下移動距離不同，最終使得A、a得以分開，形成不同的條帶。
[例3] (2023·西安高新一中質檢)圖1是某遺傳病家系的系譜圖，對該家系中1～4號個體進行基因檢測，將含有該遺傳病基因或正常基因的相關DNA片段用電泳法分離。正常基因顯示一個條帶，患病基因顯示為另一個不同的條帶，結果如圖2所示。下列有關分析判斷錯誤的是(　　)
圖1
圖2
A.圖2中的編號c對應系譜圖中的4號個體
B.條帶2的DNA片段含有該遺傳病致病基因
C.8號個體的基因型與3號個體的基因型相同的概率為
D.9號個體與該遺傳病致病基因攜帶者結婚，孩子患病的概率為
答案　D
解析　分析系譜圖：1號和2號都正常，但他們的女兒患病，說明該病為常染色體隱性遺傳病。圖中4號為患者，屬于隱性純合子，對應圖2中的c，A正確；分析可知，1、2號都是雜合子，4號為隱性純合子，而圖2中a、b和d為雜合子，c為純合子，則3號也為雜合子，c為隱性純合子，則條帶2的DNA片段含有該遺傳病致病基因，B正確；假設相關基因用A、a表示，根據圖2可知，3號的基因型為Aa，根據圖1可知，8號的基因型及概率為AA或Aa，因此兩者相同的概率為，C正確；9號的基因型及概率為AA或Aa，他與該病攜帶者(Aa)結婚，孩子患病的概率為×＝，D錯誤。
[例4] (2023·廣東珠海調研)一對等位基因(用D、d表示)，在某種限制酶的作用下可以切割形成兩種不同長度的DNA片段。對酶切后獲得的DNA片段用凝膠電泳法進行分離，然后與特定的DNA探針雜交后可顯示出不同的帶譜。根據顯示出的帶譜組型可以判斷基因型組成。現有一對夫婦及其所生四個兒女的相關基因定位鑒定獲得的帶譜如圖，且1號性狀與家庭的其他成員不同。關于這四個兒女的基因型推斷正確的是(　　)
A.3號為Dd，4號為DD
B.1號為XdXd，2號為XDY
C.1號為DD，2號為dd
D.3號為XDXd，4號為XdYd
答案　A
解析　分析題圖可知，夫妻雙方的帶譜相同，因此不可能是伴X遺傳，B、D錯誤；又因為Ⅰ代的夫婦的基因定位鑒定獲得的帶譜是兩條，均為雜合子，則此夫婦基因型均為Dd，因此后代的基因型可能為DD、Dd、dd三種。分析子代的基因定位鑒定獲得的帶譜可知，1具有一條帶譜，且1號性狀與家庭的其他成員不同，說明1為隱性純合子dd，2號只有一條帶譜，且與1號性狀不同，為DD，C錯誤；3號含有兩條帶譜，為Dd，4號與2號相同，為DD，A正確。

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