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本章整合
1．(2023·新課標卷，6)某同學擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點)和質(zhì)粒進行切割、連接，以構(gòu)建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。
下列重組表達載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是( C )
A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接
B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接
C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接
D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接
解析： 酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4DNA連接酶連接，A錯誤；質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接，B錯誤；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C正確；若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達載體缺少標記基因，無法進行后續(xù)的篩選，D錯誤。故選C。
2．(2023·湖北卷，4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是( D )
A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否
D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落
解析： 若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；若用PvuⅠ酶切，重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；DNA凝膠電泳技術(shù)可以分離不同大小的DNA片段，重組質(zhì)粒的大小與質(zhì)粒不同，能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；SphⅠ的酶切位點位于四環(huán)素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯誤。故選D。
3．(2023·浙江卷，19)某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3－GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計了引物1和引物2用于PCR擴增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。
下列敘述正確的是( B )
A．Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因的表達
B．翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3－GFP基因純合子
D．若用引物1和引物3進行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子
解析： 分析圖中可知，啟動子在左側(cè)，GFP基因整合在Gata3基因的右側(cè)，啟動子啟動轉(zhuǎn)錄后，可以使GEP基因轉(zhuǎn)錄，Gata3基因的啟動子能控制GFP基因的表達，A錯誤；因啟動子在左側(cè)，轉(zhuǎn)錄的方向向右，合成的mRNA從左向右為5′→3′，剛好是翻譯的方向，所以翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；整合GFP基因后，核酸片段變長，2號個體只有大片段，所以是Gata3－GFP基因純合子，4號個體只有小片段，是野生型，C錯誤；用引物1和引物3進行PCR擴增，擴增出的片段大小差異較小，無法較好的區(qū)分片段，D錯誤。故選B。
4．(2022·山東卷，13)關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是( B )
A．過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進行是為了防止DNA降解
B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀
C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)
解析：低溫時DNA酶的活性較低，過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進行是為了防止DNA降解，A正確；離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀，B錯誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色，C正確；細胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶解于酒精，可能有蛋白質(zhì)不溶于酒精，在95%的冷酒精中與DNA一塊兒析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)，D正確。
5．(2019·北京卷)甲、乙是嚴重危害某二倍體觀賞植物的病害。研究者先分別獲得抗甲、乙的轉(zhuǎn)基因植株，再將二者雜交后得到F1，結(jié)合單倍體育種技術(shù)，培育出同時抗甲、乙的植物新品種。以下對相關(guān)操作及結(jié)果的敘述，錯誤的是( D )
A．將含有目的基因和標記基因的載體導(dǎo)入受體細胞
B．通過接種病原體對轉(zhuǎn)基因的植株進行抗病性鑒定
C．調(diào)整培養(yǎng)基中植物激素比例獲得F1花粉再生植株
D．經(jīng)花粉離體培養(yǎng)獲得的若干再生植株均為二倍體
解析： 基因工程中需在體外先將目的基因與帶有標記基因的載體結(jié)合，再將其導(dǎo)入受體細胞，A項正確；在個體生物學水平上，可通過接種病原體對轉(zhuǎn)基因的植株進行抗病性鑒定，B項正確；在花粉離體培養(yǎng)過程中，合理調(diào)整培養(yǎng)基中生長素和細胞分裂素的比例，可使愈傷組織再分化，獲得F1花粉再生植株，C項正確；經(jīng)花粉離體培養(yǎng)獲得的若干再生植株一般為單倍體，D項錯誤。
6．(2019·江蘇卷)下列生物技術(shù)操作對遺傳物質(zhì)的改造，不會遺傳給子代的是( D )
A．將胰島素基因表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，篩選獲得基因工程菌
B．將花青素代謝基因?qū)胫参矬w細胞，經(jīng)組培獲得花色變異植株
C．將腸乳糖酶基因?qū)肽膛Ｊ芫?，培育出產(chǎn)低乳糖牛乳的奶牛
D．將腺苷酸脫氨酶基因轉(zhuǎn)入淋巴細胞后回輸患者，進行基因治療
解析： 基因工程菌中含目的基因，能通過繁殖遺傳給子代，A項不符合題意；經(jīng)組培獲得的轉(zhuǎn)基因植株的細胞中都含目的基因，能夠遺傳給子代，B項不符合題意；培育得到的轉(zhuǎn)基因奶牛的細胞中都含目的基因，故能遺傳給子代，C項不符合題意；由題干信息可知，進行題述基因治療時只有淋巴細胞含目的基因，生殖細胞不含目的基因，故不能遺傳給子代，D項符合題意。
7．(2023·全國乙卷)GFP是水母體內(nèi)存在的能發(fā)綠色熒光的一種蛋白?？蒲腥藛T以GFP基因為材料，利用基因工程技術(shù)獲得了能發(fā)其他顏色熒光的蛋白，豐富了熒光蛋白的顏色種類。回答下列問題。
(1)構(gòu)建突變基因文庫，科研人員將GFP基因的不同突變基因分別插入載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌制備出GFP基因的突變基因文庫。通常，基因文庫是指_將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因__。
(2)構(gòu)建目的基因表達載體?？蒲腥藛T從構(gòu)建的GFP突變基因文庫中提取目的基因(均為突變基因)構(gòu)建表達載體，其模式圖如下所示(箭頭為GFP突變基因的轉(zhuǎn)錄方向)。圖中①為_終止子__；②為_啟動子__，其作用是_RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄__；圖中氨芐青霉素抗性基因是一種標記基因，其作用是_鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來__。
(3)目的基因的表達。科研人員將構(gòu)建好的表達載體導(dǎo)入大腸桿菌中進行表達，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌有的發(fā)綠色熒光，有的發(fā)黃色熒光，有的不發(fā)熒光。請從密碼子特點的角度分析，發(fā)綠色熒光的可能原因是_密碼子具有簡并性__(答出1點即可)。
(4)新蛋白與突變基因的關(guān)聯(lián)性分析。將上述發(fā)黃色熒光的大腸桿菌分離純化后，對其所含的GFP突變基因進行測序，發(fā)現(xiàn)其堿基序列與GFP基因的不同，將該GFP突變基因命名為YFP基因(黃色熒光蛋白基因)。若要通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細胞中表達，實驗思路是_將構(gòu)建好的表達載體(含有目的基因YFP基因)導(dǎo)入酵母菌中進行表達__。
解析：有關(guān)密碼子，考生可從以下幾方面把握：①概念：密碼子是mRNA上決定氨基酸的相鄰的3個堿基。②種類：64種，其中有3種是終止密碼子，不編碼氨基酸。③特點：一種密碼子只能編碼一種氨基酸，但一種氨基酸可能由一種或多種密碼子編碼；密碼子具有通用性，即自然界所有的生物共用一套遺傳密碼。(1)將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。(2)一個基因表達載體的組成，除了目的基因外，還必須有啟動子，終止子以及標記基因等，且基因的轉(zhuǎn)錄方向為從啟動子到終止子，故圖中①為終止子，②為啟動子，啟動子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)。標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，如抗生素基因就可以作為這種基因。(3)正常情況下，GFP突變基因應(yīng)該不發(fā)綠色熒光，而大腸桿菌有的發(fā)綠色熒光，從密碼子特點的角度分析，原因是密碼子具有簡并性，即一種氨基酸可能由一種或多種密碼子決定。(4)基因工程研究中常用的真核表達系統(tǒng)有酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。要通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細胞中表達，可將構(gòu)建好的表達載體(含有目的基因YFP基因)導(dǎo)入酵母菌中進行表達，如果酵母菌發(fā)出黃色熒光，說明YFP基因能在真核細胞中表達，反之則不能在真核細胞中表達。
8．(2023·山東卷)科研人員構(gòu)建了可表達J－V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進行了檢測，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。
(1)與圖甲中啟動子結(jié)合的酶是_RNA聚合酶__。除圖甲中標出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有_限制酶切割位點、標記基因、復(fù)制原點等__(答出2個結(jié)構(gòu)即可)。
(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物_F2和R1或F1與R2__。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的_a鏈__(填“a鏈”或“b鏈”)相應(yīng)部分的序列相同。
(3)重組質(zhì)粒在受體細胞內(nèi)正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應(yīng)蛋白是否表達以及表達水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細胞內(nèi)表達了_J－V5融合蛋白__，條帶2所檢出的蛋白_不是__(填“是”或“不是”)由重組質(zhì)粒上的J基因表達的。
解析：基因工程的關(guān)鍵步驟是構(gòu)建基因表達載體，基因表達載體主要由啟動子、目的基因、標記基因和終止子組成，其中標記基因用于篩選重組DNA分子，可以是四環(huán)素、氨芐青霉素等抗性基因，也可以是熒光蛋白基因或產(chǎn)物能顯色的基因。(1)基因表達載體的構(gòu)建啟動子是為了啟動下游基因的“表達”，表達首先需要轉(zhuǎn)錄，因此RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位才是轉(zhuǎn)錄的起始。作為運載體必須具備的條件：①要具有限制酶的切割位點；②要有標記基因(如抗性基因)，以便于重組后重組子的篩選；③能在宿主細胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制；④是安全的，對受體細胞無害，而且要易從供體細胞分離出來，圖中甲有啟動子和終止子等，因此質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有限制酶的切割位點、標記基因、復(fù)制原點等。(2)據(jù)圖甲可知，引物F2與R1或F1與R2結(jié)合部位包含J基因的堿基序列，因此推測為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，進行PCR檢測時，若僅用一對引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物F2和R1或F1與R2。b是模板鏈，而根據(jù)圖上啟動子和終止子的位置可知轉(zhuǎn)錄方向是圖上從左向右，對應(yīng)的模板鏈方向應(yīng)該是3′－5′，非模板鏈(也就是a鏈)是5′－3′；考慮到DNA復(fù)制的方向是子鏈的5′－3′，引物延伸的方向肯定是5′－3′，所以引物結(jié)合的單鏈其方向是3′－5′；圖中F1是前引物，在左側(cè)，所以其配對的單鏈是3′－5′的b鏈，故其序列應(yīng)該與a鏈相應(yīng)部分的序列相同。(3)據(jù)圖乙可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測，均出現(xiàn)條帶1，說明條帶1是J－V5融合蛋白。抗J蛋白抗體檢測出現(xiàn)條帶2，抗V5抗體檢測不出條帶2，說明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質(zhì)粒上的J基因表達的。
9．(2022·廣東卷，22)“綠水逶迤去，青山相向開”大力發(fā)展低碳經(jīng)濟已成為全社會的共識?；谀承┧缶奶厥獯x能力，有研究者以某些工業(yè)廢氣(含CO2等一碳溫室氣體，多來自高污染排放企業(yè))為原料，通過厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丙酮，構(gòu)建一種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)。
回答下列問題：
(1)研究者針對每個需要擴增的酶基因(如圖)設(shè)計一對 引物　，利用PCR技術(shù)，在優(yōu)化反應(yīng)條件后擴增得到目標酶基因。
(2)研究者構(gòu)建了一種表達載體pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因組合表達庫，經(jīng)篩選后提高丙酮的合成量。該載體包括了啟動子、終止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是 作為標記基因，篩選含有基因表達載體的受體細胞　，終止子的作用是 終止轉(zhuǎn)錄，使轉(zhuǎn)錄在需要的地方停下來　。
(3)培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)重組梭菌大量表達上述酶蛋白時，出現(xiàn)了生長遲緩的現(xiàn)象，推測其原因可能是 二氧化碳等氣體用于大量合成丙酮，而不是用于重組梭菌的生長　，此外丙酮的積累會傷害細胞，需要進一步優(yōu)化菌株和工藝才能擴大應(yīng)用規(guī)模。
(4)這種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)，實現(xiàn)了 廢物的資源化　，體現(xiàn)了循環(huán)經(jīng)濟特點。從“碳中和”的角度看，該技術(shù)的優(yōu)勢在于 不僅不排放二氧化碳，而且還可以消耗工業(yè)廢氣中的二氧化碳　，具有廣泛的應(yīng)用前景和良好的社會效益。
解析：(1)利用PCR技術(shù)擴增目標酶基因，首先需要根據(jù)目標酶基因兩端的堿基序列設(shè)計一對引物，引物與模板鏈結(jié)合后，Taq酶才能從引物的3′端延伸子鏈。(2)基因表達載體中，抗生素抗性基因作為標記基因，可用于篩選含有基因表達載體的受體細胞，終止子可終止轉(zhuǎn)錄，使轉(zhuǎn)錄在需要的地方停下來。(3)重組梭菌大量表達上述酶蛋白時，在這些酶蛋白的作用下，二氧化碳等氣體大量用于合成丙酮，而不是用于重組梭菌的生長，所以會導(dǎo)致生長遲緩。(4)根據(jù)題意可知，這種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)，以高污染企業(yè)排放的二氧化碳等一碳溫室氣體為原料，實現(xiàn)了廢物的資源化，體現(xiàn)了循環(huán)經(jīng)濟特點。從“碳中和”的角度看，該技術(shù)生產(chǎn)丙酮的過程不僅不排放二氧化碳，而且還可以消耗工業(yè)廢氣中的二氧化碳，有利于減緩溫室效應(yīng)，并實現(xiàn)較高的經(jīng)濟效益，所以具有廣泛的應(yīng)用前景和良好的社會效益。
10．(2022·湖南卷，22)水蛭是我國的傳統(tǒng)中藥材，主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。擬通過蛋白質(zhì)工程改造水蛭素結(jié)構(gòu)，提高其抗凝血活性?；卮鹣铝袉栴}：
(1)蛋白質(zhì)工程流程如圖所示，物質(zhì)a是 氨基酸序列多肽鏈　，物質(zhì)b是 mRNA　。在生產(chǎn)過程中，物質(zhì)b可能不同，合成的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象卻相同，原因是 密碼子的簡并性　。
(2)蛋白質(zhì)工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有 從基因文庫中獲取目的基因　、 通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成　和利用 PCR 技術(shù)擴增。PCR 技術(shù)遵循的基本原理是 DNA雙鏈復(fù)制　。
(3)將提取的水蛭蛋白經(jīng)甲、乙兩種蛋白酶水解后，分析水解產(chǎn)物中的肽含量及其抗凝血活性，結(jié)果如圖所示。推測兩種處理后酶解產(chǎn)物的抗凝血活性差異主要與肽的 種類　(填“種類”或“含量”)有關(guān)，導(dǎo)致其活性不同的原因是 提取的水蛭蛋白的酶解時間和處理的酶的種類不同，導(dǎo)致水蛭蛋白空間結(jié)構(gòu)有不同程度破壞　。
(4)若要比較蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，簡要寫出實驗設(shè)計思路： 取3支試管，分別加入等量的蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一種動物(如家兔)血液，立即將等量的血液加入1、2、3號三支試管中，靜置相同時間，統(tǒng)計三支試管中血液凝固時間　。
解析：(1)據(jù)分析可知，物質(zhì)a是氨基酸序列多肽鏈，物質(zhì)b是mRNA。在生產(chǎn)過程中，物質(zhì)b可能不同，合成的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象卻相同，原因是密碼子的簡并性，即一種氨基酸可能有幾個密碼子。 (2)蛋白質(zhì)工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有從基因文庫中獲取目的基因、通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成和利用 PCR 技術(shù)擴增。PCR 技術(shù)遵循的基本原理是 DNA雙鏈復(fù)制。(3)將提取的水蛭蛋白經(jīng)甲、乙兩種蛋白酶水解后，據(jù)圖可知，水解產(chǎn)物中的肽含量隨著酶解時間的延長均上升，且差別不大；而水解產(chǎn)物中抗凝血活性有差異，經(jīng)酶甲處理后，隨著酶解時間的延長，抗凝血活性先上升后相對穩(wěn)定，經(jīng)酶乙處理后，隨著酶解時間的延長，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲處理后的酶解產(chǎn)物的抗凝血活性最終高于經(jīng)酶乙處理后的酶解產(chǎn)物的抗凝血活性，差異明顯，據(jù)此推測兩種處理后酶解產(chǎn)物的抗凝血活性差異主要與肽的種類有關(guān)，導(dǎo)致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解時間和酶的種類不同，導(dǎo)致水蛭蛋白空間結(jié)構(gòu)有不同程度破壞。(4)若要比較蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，實驗設(shè)計思路為：取3支試管，分別加入等量的蛋白質(zhì)工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產(chǎn)物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一種動物(如家兔)血液，立即將等量的血液加入1、2、3號三支試管中，靜置相同時間，統(tǒng)計三支試管中血液凝固時間。
11．(2022·全國乙卷)新冠疫情出現(xiàn)后，病毒核酸檢測和疫苗接種在疫情防控中發(fā)揮了重要作用?；卮鹣铝袉栴}。
(1)新冠病毒是一種RNA病毒，檢測新冠病毒RNA(核酸檢測)可以采取RT－PCR法。這種方法的基本原理是先以病毒RNA為模板合成cDNA，這一過程需要的酶是 逆轉(zhuǎn)錄酶(反轉(zhuǎn)錄酶)　，再通過PCR技術(shù)擴增相應(yīng)的DNA片段。根據(jù)檢測結(jié)果判斷被檢測者是否感染新冠病毒。
(2)為了確保新冠病毒核酸檢測的準確性，在設(shè)計PCR引物時必須依據(jù)新冠病毒RNA中的 特異性核苷酸序列　來進行。PCR過程每次循環(huán)分為3步，其中溫度最低的一步是 退火(復(fù)性)　。
(3)某人同時進行了新冠病毒核酸檢測和抗體檢測(檢測體內(nèi)是否有新冠病毒抗體)，若核酸檢測結(jié)果為陰性而抗體檢測結(jié)果為陽性，說明 曾感染新冠病毒，已康復(fù)　(答出1種情況即可)；若核酸檢測和抗體檢測結(jié)果均為陽性，說明 已感染新冠病毒，是患者　。
(4)常見的病毒疫苗有滅活疫苗、蛋白疫苗和重組疫苗等。已知某種病毒的特異性蛋白S(具有抗原性)的編碼序列(目的基因)。為了制備蛋白疫苗，可以通過基因工程技術(shù)獲得大量蛋白S?；蚬こ痰幕静僮髁鞒淌?獲取S蛋白基因→構(gòu)建S蛋白基因與運載體的表達載體→導(dǎo)入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定 (檢測受體能否產(chǎn)生S蛋白)　。
解析：(1)分析題意可知，新冠病毒的遺傳物質(zhì)是RNA，而RT－PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的過程屬于逆轉(zhuǎn)錄過程，逆轉(zhuǎn)錄過程需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶(反轉(zhuǎn)錄酶)。(2)PCR過程需要加入引物，設(shè)計引物時應(yīng)有一段已知目的基因的核苷酸序列，在該過程中為了確保新冠病毒核酸檢測的準確性，在設(shè)計PCR引物時必須依據(jù)新冠病毒RNA中的特異性核苷酸序列來進行；PCR過程每次循環(huán)分為3步，分別為變性(90～95 ℃)、復(fù)性(55～60 ℃)、延伸(70～75 ℃)，故其中溫度最低的一步是復(fù)性。(3)某人同時進行了新冠病毒核酸檢測和抗體檢測，若核酸檢測結(jié)果為陰性而抗體檢測結(jié)果為陽性，說明該個體曾經(jīng)感染過新冠病毒，機體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體，將病毒消滅已康復(fù)，則核酸檢測為陰性，但由于抗體有一定的時效性，能在體內(nèi)存在一段時間，故抗體檢測為陽性；若核酸檢測和抗體檢測結(jié)果均為陽性，說明該個體體內(nèi)仍含有病毒的核酸，機體仍進行特異性免疫過程，能產(chǎn)生抗體，則說明該人已經(jīng)感染新冠病毒，為患者。(4)基因工程的基本操作流程是：獲取目的基因→基因表達載體的構(gòu)建(基因工程的核心)→將目的基因?qū)胧荏w細胞→目的基因的檢測與鑒定，結(jié)合題意，本基因工程的目的是獲得大量的S蛋白，故具體流程為：獲取S蛋白基因→構(gòu)建S蛋白基因與運載體的表達載體→導(dǎo)入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定 (檢測受體能否產(chǎn)生S蛋白)。
12．(2021·全國甲卷)PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，醫(yī)生進行了相關(guān)操作：①分析PCR擴增結(jié)果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴增DNA片段；④采集病人組織樣本?；卮鹣铝袉栴}：
(1)若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是_④②③①__(用數(shù)字序號表示)。
(2)操作③中使用的酶是_Taq酶(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)__。PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、_延伸__三步，其中復(fù)性的結(jié)果是_Taq酶從引物起始進行互補鏈的合成__。
(3)為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與_兩條單鏈DNA__特異性結(jié)合。
(4)PCR(多聚酶鏈式反應(yīng))技術(shù)是指_一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)__。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。
解析：(1)PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測，若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是④采集病人組織樣本→②從病人組織樣本中提取DNA→③利用PCR擴增DNA片段→①分析PCR擴增結(jié)果。(2)在用PCR技術(shù)擴增DNA時，DNA的復(fù)制過程與細胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似，操作③中使用的酶是Taq酶(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)，PCR 反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、延伸三步，其中復(fù)性的結(jié)果是Taq酶從引物起始進行互補鏈的合成(引物通過堿基互補配對和單鏈DNA結(jié)合)。(3)DNA復(fù)制需要引物，為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與兩條單鏈DNA特異性結(jié)合。(4)據(jù)分析可知，PCR(多聚酶鏈式反應(yīng))技術(shù)是指一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。
13．(2020·江蘇卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如下圖(以EcoR Ⅰ酶切為例)：
請據(jù)圖回答問題：
(1)步驟Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一種限制性內(nèi)切核酸(或限制)酶，它通過識別特定的核苷酸序列切割特定位點。
(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′—羥基與5′—磷酸間形成磷酸二酯鍵；PCR循環(huán)中，升溫到95 ℃是為了獲得DNA單鏈；TaqDNA聚合酶的作用是催化以DNA為模板的DNA子鏈的延伸。
(3)若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是②④(從引物①②③④中選擇，填編號)。
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′—AACTATGCGCTCATGA—3′②5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′③5′—AGAGGCTACGCATTGC—3′④5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′
(4)對PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結(jié)果正確的是_B__。
A. 5′—AACTATGCG——AGCCCTT—3′
B．5′—AATTCCATG——CTGAATT—3′
C．5′—GCAATGCGT——TCGGGAA—3′
D．5′—TTGATACGC——CGAGTAC—3′
解析：(1)EcoR I是一種限制性內(nèi)切核酸酶，它通過識別特定的核苷酸序列切割特定的位點。(2)DNA連接酶可催化相鄰核苷酸之間的3′—羥基和5′—磷酸之間形成磷酸二酯鍵；PCR循環(huán)中，升溫到95 ℃時，DNA受熱變性后解旋為單鏈；TaqDNA聚合酶是一種耐高溫的依賴于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA鏈為模板的DNA子鏈的延伸。(3)引物是一小段單鏈DNA，引物5′端的堿基可以與DNA兩條鏈的3′端的堿基進行堿基互補配對，可作為DNA復(fù)制的起始點，子鏈的延伸方向從5′→3′，據(jù)題圖分析，結(jié)合已知序列可知，能與片段F左邊配對的引物為④，與右邊配對的引物為②，故步驟Ⅲ選用的PCR引物應(yīng)當為②④。(4)對PCR產(chǎn)物測序，得到片段F的完整序列，因為片段F是被限制酶EcoR I剪切的兩端，它識別的序列是GAATTC，且在G與A之間切割，所以5′端應(yīng)該是AATTC,3′端是GAATT，故選B。
14．(2021·廣東卷)非細胞合成技術(shù)是一種運用合成生物學方法，在細胞外構(gòu)建多酶催化體系，獲得目標產(chǎn)物的新技術(shù)，其核心是各種酶基因的挖掘、表達等。中國科學家設(shè)計了4步酶促反應(yīng)的非細胞合成路線(如圖)，可直接用淀粉生產(chǎn)肌醇(重要的醫(yī)藥食品原料)，以期解決高溫強酸水解方法造成的嚴重污染問題，并可以提高產(chǎn)率。
回答下列問題：
(1)研究人員采用PCR技術(shù)從土壤微生物基因組中擴增得到目標酶基因。此外，獲得酶基因的方法還有_從基因文庫中獲取、人工合成法__。(答出兩種即可)
(2)高質(zhì)量的DNA模板是成功擴增出目的基因的前提條件之一。在制備高質(zhì)量DNA模板時必須除去蛋白，方法有_鹽析法、酶解法或高溫變性__。(答出兩種即可)
(3)研究人員使用大腸桿菌BL21作為受體細胞、pET20b為表達載體分別進行4種酶的表達。表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時，首先應(yīng)制備_感受態(tài)__細胞。為了檢測目的基因是否成功表達出酶蛋白，需要采用的方法有_抗原—抗體雜交技術(shù)__。
(4)依圖所示流程，在一定的溫度、pH等條件下，將4種酶與可溶性淀粉溶液混合組成一個反應(yīng)體系。若這些酶最適反應(yīng)條件不同，可能導(dǎo)致的結(jié)果是_有的酶失活而使反應(yīng)中斷__。在分子水平上，可以通過改變_基因的堿基序列__，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)對酶特性的改造和優(yōu)化。
解析：(1)分析題意，研究人員從土壤微生物基因組中擴增得到目標酶基因采用了PCR技術(shù)，此外獲得酶基因的方法還有從基因文庫中獲取和人工合成法。(2)高質(zhì)量的DNA模板是成功擴增出目的基因的前提條件之一。在制備高質(zhì)量DNA模板時必須除去蛋白，可根據(jù)DNA和蛋白質(zhì)的溶解性以及對酶、高溫和洗滌劑的耐受性去除蛋白質(zhì)，方法有鹽析、酶解法或高溫變性法等。(3)研究人員使用大腸桿菌BL21作為受體細胞、pET20b為表達載體分別進行4種酶的表達。表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時，首先應(yīng)制備感受態(tài)細胞， 即利用鈣離子處理大腸桿菌，使其成為感受態(tài)細胞，使其易于接受外來的DNA分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表達的產(chǎn)物酶蛋白的化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)，常用抗原—抗體雜交技術(shù)進行檢測。(4)依圖所示流程，在一定的溫度、pH等條件下，將4種酶與可溶性淀粉溶液混合組成一個反應(yīng)體系。由于酶的作用條件較溫和，若這些酶最適反應(yīng)條件不同，則可能導(dǎo)致有的酶失活而使反應(yīng)中斷。在分子水平上，可以通過改變基因的堿基序列，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)對酶特性的改造和優(yōu)化。
15．(2020·山東卷，25)水稻胚乳中含直鏈淀粉和支鏈淀粉，直鏈淀粉所占比例越小糯性越強?？蒲腥藛T將能表達出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列轉(zhuǎn)入水稻，實現(xiàn)了對直鏈淀粉合成酶基因(Wx基因)啟動子序列的定點編輯，從而獲得了3個突變品系。
(1)將能表達出基因編輯系統(tǒng)的DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時，所需的酶是限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶,_重組載體進入水稻細胞并在細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程稱為轉(zhuǎn)化。
(2)根據(jù)啟動子的作用推測，Wx基因啟動子序列的改變影響了RNA聚合酶與啟動子的識別和結(jié)合，從而改變了Wx基因的轉(zhuǎn)錄水平。與野生型水稻相比，3個突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列不發(fā)生 (填：“發(fā)生”或“不發(fā)生”)改變，原因是編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動子。
(3)為檢測啟動子變化對Wx基因表達的影響，科研人員需要檢測Wx基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA (Wx mRNA)的量。檢測時分別提取各品系胚乳中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄(或反轉(zhuǎn)錄)過程獲得總 cDNA。通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性的擴增出 Wx基因的cDNA，原因是引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計合成的(或：引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)。
(4)各品系Wx mRNA量的檢測結(jié)果如圖所示，據(jù)圖推測糯性最強的品系為品系3，原因是品系3的Wx_mRNA最少，控制合成的直鏈淀粉合成酶最少，直鏈淀粉合成量最少，糯性最強。
解析：(1)將目的基因與Ti質(zhì)粒構(gòu)建基因表達載體時，需要限制酶的切割，將目的基因插入載體時需要DNA連接酶的連接，重組載體進入水稻細胞并在細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程稱為轉(zhuǎn)化。(2)根據(jù)以上分析可知，啟動子是RNA聚合酶識別并結(jié)合的位點，如果啟動子序列改變將會影響RNA聚合酶與之結(jié)合和識別，進而影響基因的轉(zhuǎn)錄水平。在真核生物中，編碼蛋白質(zhì)的序列是基因中編碼區(qū)，編碼區(qū)中不包括啟動子序列，因此直鏈淀粉合成酶的基因堿基序列中不含有啟動子，因此3個突變品系中Wx基因中控制合成直鏈淀粉酶的氨基酸序列不發(fā)生改變。(3)以mRNA為模板合成cDNA的過程為逆轉(zhuǎn)錄，利用PCR技術(shù)擴增Wx基因的cDNA，需要以Wx基因合成的引物，這樣引物能夠在總cDNA中與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合，從而利用PCR擴增技術(shù)專一性擴增出Wx基因的cDNA。(4)識圖分析可知，圖中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直鏈淀粉酶最少，直鏈淀粉合成量最少，因此該水稻胚乳中含的直鏈淀粉比例最小，糯性最強。
16．(2021·河北卷)采礦污染和不當使用化肥導(dǎo)致重金屬鎘(Cd)在土壤中過量積累。利用植物修復(fù)技術(shù)將土壤中的Cd富集到植物體內(nèi)，進行后續(xù)處理(例如，收集植物組織器官異地妥善儲存)，可降低土壤中Cd的含量。為提高植物對Cd污染土壤的修復(fù)能力，研究者將酵母液泡Cd轉(zhuǎn)運蛋白(YCF1)基因?qū)胧茉囍参?，并檢測了相關(guān)指標。
回答下列問題：
(1)為獲取YCF1基因，將酵母細胞的全部DNA提取、切割后與載體連接，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，這個群體稱為_基因組文庫__。
(2)將DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時，所需要的兩種酶是_限制酶和DNA連接酶__。構(gòu)建的重組基因表達載體中必須含有標記基因，其作用是_便于目的基因的篩選和鑒定__。
(3)進行前期研究時，將含有YCF1基因的重組載體導(dǎo)入受試雙子葉植物印度芥菜，采用最多的方法是_農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法__。研究者進一步獲得了轉(zhuǎn)YCF1基因的不育楊樹株系，采用不育株系作為實驗材料的目的是_避免目的基因在自然界中的擴散__。
(4)將長勢一致的野生型和轉(zhuǎn)基因楊樹苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后測定植株干重(圖1)及不同器官中Cd含量(圖2)。據(jù)圖1可知，與野生型比，轉(zhuǎn)基因植株對Cd具有更強的_耐性__(填“耐性”或“富集能力”)；據(jù)圖2可知，對轉(zhuǎn)基因植株的_莖、葉__進行后續(xù)處理對于緩解土壤Cd污染最為方便有效。
(5)已知YCF1特異定位于轉(zhuǎn)基因植物細胞的液泡膜上。據(jù)此分析，轉(zhuǎn)基因楊樹比野生型能更好地適應(yīng)高Cd環(huán)境的原因是 YCF1可通過主動運輸將Cd離子運到液泡中，提高了細胞液的濃度，有利于植株吸水　。相較于草本植物，采用楊樹這種喬木作為Cd污染土壤修復(fù)植物的優(yōu)勢在于_楊樹具有發(fā)達的根系和高大的樹冠，更適應(yīng)污染礦區(qū)等不良環(huán)境，同時可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便運輸、利用__(寫出兩點即可)。
解析：(1)為獲取YCF1基因，將酵母細胞的全部DNA提取、切割后與載體連接，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，這個群體含有酵母菌的全部基因，稱為基因組文庫。(2)將DNA序列插入Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體時，需要用限制酶切割供體DNA和質(zhì)粒，以產(chǎn)生相同的黏性末端，然后用DNA連接酶進行連接。基因表達載體中的標記基因可用于目的基因的篩選和鑒定。(3)農(nóng)桿菌容易侵染雙子葉植物，其質(zhì)粒中的T－DNA可轉(zhuǎn)移并插入到受體細胞染色體DNA中，將含有YCF1基因的重組載體導(dǎo)入受試雙子葉植物印度芥菜，采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法?？紤]轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全性，采用不育株系作為實驗材料，可避免目的基因在自然界中的擴散。(4)根據(jù)分析可知，與野生型比，轉(zhuǎn)基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，說明轉(zhuǎn)基因植株在Cd污染的土壤中生長較好，即對Cd具有更強的耐性；據(jù)圖2分析，轉(zhuǎn)基因植株的莖、葉中Cd含量高于野生型，因此對轉(zhuǎn)基因植株的莖、葉進行后續(xù)處理，可使轉(zhuǎn)基因植株持續(xù)發(fā)揮富集Cd的作用，對于緩解土壤Cd污染最為方便有效。(5)YCF1特異定位于轉(zhuǎn)基因植物細胞的液泡膜上，可通過主動運輸將Cd離子運到液泡中，提高了細胞液的濃度，有利于植株吸水，所以轉(zhuǎn)基因楊樹比野生型能更好地適應(yīng)高Cd環(huán)境。相較于草本植物，楊樹具有發(fā)達的根系和高大的樹冠，更適應(yīng)污染礦區(qū)等不良環(huán)境，同時可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便運輸、利用，作為Cd污染土壤修復(fù)植物更具有優(yōu)勢。第4節(jié)　蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用
課標要求
1．說出蛋白質(zhì)工程崛起的緣由。
2．概述蛋白質(zhì)工程的基本原理。
3．舉例說明依據(jù)人類需要對原有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行基因改造、生產(chǎn)目標蛋白的過程。
核心素養(yǎng)
1．科學思維——嘗試通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)，根據(jù)人類需要的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，設(shè)計或改造某一蛋白質(zhì)的設(shè)計流程。
2．社會責任——嘗試運用逆向思維分析和解決問題。
知識點一　蛋白質(zhì)工程的原理
基礎(chǔ)知識·雙基夯實
一、蛋白質(zhì)工程
1．概念
(1)基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)分子的_結(jié)構(gòu)規(guī)律__及其與_生物功能__的關(guān)系。
(2)手段：通過_基因改造__或_基因合成__，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)。
(3)目的：獲得滿足人類的生產(chǎn)和生活需求的_蛋白質(zhì)__。
2．理論和技術(shù)條件：_分子生物學__、_晶體學__以及_計算機__技術(shù)的迅猛發(fā)展。
二、蛋白質(zhì)工程崛起的緣由
1．基因工程的實質(zhì)：將一種生物的_基因__轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi)，后者可以產(chǎn)生它本不能產(chǎn)生的_蛋白質(zhì)__，進而表現(xiàn)出_新的性狀__。
2．基因工程的不足：基因工程在原則上只能產(chǎn)生自然界中_已存在__的蛋白質(zhì)。
3．天然蛋白質(zhì)的不足：天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能符合_特定物種__生存的需要，卻不一定完全符合_人類生產(chǎn)和生活__的需要。
4．實例：玉米中賴氨酸的含量比較低，賴氨酸合成中兩種酶的_氨基酸__被替換，就可以使玉米葉片和種子中游離賴氨酸分別提高5倍和2倍。
三、蛋白質(zhì)工程的基本原理
1．目標：根據(jù)人們對_蛋白質(zhì)__功能的特定需求，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行設(shè)計改造。
2．方法：_改造基因__或_合成基因__。
3．流程：預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計預(yù)期的_蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)__→推測應(yīng)有的_氨基酸__序列→找到相對應(yīng)的_脫氧核苷酸__序列(基因)或合成新的_基因__→獲得所需要的蛋白質(zhì)。
活 | 學 | 巧 | 練
1.蛋白質(zhì)工程是在分子水平上對蛋白質(zhì)分子直接進行操作，定向改變分子的結(jié)構(gòu)。( × )
2．蛋白質(zhì)工程能產(chǎn)生自然界中不存在的新型蛋白質(zhì)分子。( √ )
3．實施蛋白質(zhì)工程的前提條件是了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。( √ )
4．基因工程遵循中心法則，而蛋白質(zhì)工程不遵循。( × )
合 | 作 | 探 | 究
1.為什么蛋白質(zhì)工程不是直接改造蛋白質(zhì)而是通過基因改造和基因合成來完成？
提示：①任何一種天然蛋白質(zhì)都是由基因編碼的，改造了基因即對蛋白質(zhì)進行了改造，而且改造過的蛋白質(zhì)可以遺傳下去。如果對蛋白質(zhì)直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白質(zhì)也是無法遺傳下去的。②對基因進行改造比對蛋白質(zhì)進行直接改造容易操作，難度小得多。
2．蛋白質(zhì)工程的操作程序的基本思路與基因工程有什么不同？
提示：基因工程操作程序的基本思路遵循中心法則，從DNA→mRNA→多肽→折疊產(chǎn)生蛋白質(zhì)，基本上是生產(chǎn)出自然界中已有的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程是按照相反的思路進行的，確定蛋白質(zhì)的功能→蛋白質(zhì)應(yīng)有的高級結(jié)構(gòu)→蛋白質(zhì)具備的折疊狀態(tài)→應(yīng)有的氨基酸序列→基因中的堿基序列，可以創(chuàng)造自然界不存在的蛋白質(zhì)。
課內(nèi)探究·名師點睛
1．對蛋白質(zhì)工程的2點說明
(1)改造對象：通過改造控制蛋白質(zhì)合成的基因的結(jié)構(gòu)來改造某種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
①任何一種天然蛋白質(zhì)都是由基因編碼的，改造了基因即對蛋白質(zhì)進行了改造，而且可以遺傳下去。如果對蛋白質(zhì)直接改造，即使改造成功，被改造過的蛋白質(zhì)分子還是無法遺傳的。
②對基因進行改造比對蛋白質(zhì)直接進行改造要容易操作，難度要小得多。
(2)蛋白質(zhì)工程中經(jīng)過處理得到的新基因與基因突變得到的新基因有較大差別：基因突變的新基因中含有不編碼蛋白質(zhì)的序列，而蛋白質(zhì)工程中經(jīng)處理得到的新基因則沒有。
2．蛋白質(zhì)工程的基本流程
典例1　科學家為提高玉米中賴氨酸含量，計劃將天冬氨酸激酶的第352位的蘇氨酸變成異亮氨酸，將二氫吡啶二羧酸合成酶中第104位的氨基酸由天冬酰胺變成異亮氨酸，就可以使玉米葉片和種子中的游離賴氨酸的含量分別提高5倍和2倍。下列對蛋白質(zhì)的改造，操作正確的是( C )
A．直接通過分子水平改造蛋白質(zhì)
B．直接改造相應(yīng)的mRNA
C．對相應(yīng)的基因進行操作
D．重新合成新的基因
解析：蛋白質(zhì)工程的目的是對蛋白質(zhì)進行改造，從而使蛋白質(zhì)功能可以滿足人們的需求。蛋白質(zhì)行使功能與其高級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)又非常復(fù)雜，所以直接對蛋白質(zhì)進行改造非常困難，而蛋白質(zhì)是由基因控制合成的，對基因進行操作卻容易得多。另外，通過改造基因而改造蛋白質(zhì)可以遺傳，而對蛋白質(zhì)直接改造，即使成功也不能遺傳。
變式訓(xùn)練 葡萄糖異構(gòu)酶(GI)在工業(yè)上應(yīng)用廣泛，為提高其熱穩(wěn)定性，科學家對GI基因進行體外定點誘變，以脯氨酸(Pro138)替代甘氨酸(Gly138)，含突變體的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達，結(jié)果最適反應(yīng)溫度提高10～12 ℃。這屬于生物工程中的( B )
A．基因工程　　　　 B．蛋白質(zhì)工程
C．發(fā)酵工程 D．酶工程
解析：題中是對基因進行改造，以實現(xiàn)對現(xiàn)有蛋白質(zhì)的改造，屬于蛋白質(zhì)工程。
知識點二　蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用
基礎(chǔ)知識·雙基夯實
1．在醫(yī)藥工業(yè)方面的應(yīng)用
(1)研發(fā)速效胰島素類似物：科學家通過改造_胰島素基因__使B28位脯氨酸替換為天冬氨酸或者將它與B29位的賴氨酸交換位置，從而有效抑制了_胰島素的聚合__，研發(fā)出速效胰島素類似物。
(2)提高干擾素的保存期：將干擾素分子上的一個
_半胱氨酸__變成_絲氨酸__，提高了干擾素的保存時間。
(3)改造抗體：將小鼠單克隆抗體上_結(jié)合抗原的區(qū)域__“嫁接”到人的抗體上，降低了誘發(fā)人體免疫反應(yīng)的強度。
2．在其他工業(yè)和農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用
(1)改進酶的性能或開發(fā)新的工業(yè)用酶：利用蛋白質(zhì)工程獲得蛋白酶的多種_突變體__。
(2)改造某些重要的酶：利用蛋白質(zhì)工程改造參與
_調(diào)控光合作用__的酶，以提高植物光合作用的效率。
合 | 作 | 探 | 究
利用蛋白質(zhì)工程可以提高玉米賴氨酸含量，改造途徑如下：
結(jié)果：改造后玉米葉片和種子中游離賴氨酸含量分別提高5倍和2倍。
(1)結(jié)合上述資料，可以通過何種途徑提高玉米中的賴氨酸含量？
提示：改變賴氨酸合成途徑中關(guān)鍵酶的活性，來提高賴氨酸的含量。
(2)為什么改變一個氨基酸就可以改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性甚至某種蛋白質(zhì)酶的活性？
提示：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是由其氨基酸組成決定的，個別氨基酸的改變就會導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的改變，從而影響到其性質(zhì)和功能。
課內(nèi)探究·名師點睛
典例2　新冠病毒的表面刺突蛋白(S蛋白)的受體結(jié)合域(RBD)與人體細胞表面的ACE2受體相互作用感染細胞。科學家設(shè)計了一種自然界中不存在的蛋白質(zhì)LCB1，可與S蛋白RBD緊密結(jié)合，以干擾新冠病毒的感染。下列說法不合理的是( C )
A．LCB1的作用機理與S蛋白的抗體類似
B．LCB1可依據(jù)S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)進行設(shè)計
C．LCB1是通過細胞中原有基因表達產(chǎn)生的
D．可用蛋白質(zhì)工程進行LCB1的設(shè)計和生產(chǎn)
解析：S蛋白的抗體能與S蛋白RBD特異性結(jié)合，而根據(jù)題干可知，LCB1可與S蛋白RBD緊密結(jié)合，說明LCB1的作用機理與S蛋白的抗體類似，A合理；由于LCB1可與S蛋白RBD緊密結(jié)合，故LCB1可依據(jù)S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)進行設(shè)計，B合理；由題意知，蛋白質(zhì)LCB1是一種自然界中不存在的蛋白質(zhì)，故不能通過細胞中原有基因表達產(chǎn)生的，C不合理；可用蛋白質(zhì)工程進行LCB1的設(shè)計和生產(chǎn)，D合理。
變式訓(xùn)練 科學家將β－干擾素基因進行定點突變導(dǎo)入大腸桿菌表達，使干擾素第十七位的半胱氨酸，改變成絲氨酸，結(jié)果大大提高了β－干擾素的抗病活性，并且提高了儲存穩(wěn)定性。該生物技術(shù)為( B )
A．基因工程　　　　 B．蛋白質(zhì)工程
C．基因突變 D．細胞工程
解析：基因工程是將符合人們要求的目的基因?qū)脒m宜的生物體內(nèi)，使其高效表達，從中提取人們所需的蛋白質(zhì)，或表現(xiàn)出某種性狀，蛋白質(zhì)產(chǎn)品仍然是天然存在的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程是對控制蛋白質(zhì)合成的基因進行改造，從而實現(xiàn)對相應(yīng)蛋白質(zhì)的改變，所得到的蛋白質(zhì)已不是天然存在的蛋白質(zhì)。題干中的操作涉及的基因顯然不再是原來的基因，其合成的β－干擾素也不是天然的β－干擾素，而是經(jīng)過人工改造的、符合人類需求的蛋白質(zhì)，因而該生物技術(shù)為蛋白質(zhì)工程。
蛋白質(zhì)工程與基因工程的區(qū)別與聯(lián)系
比較項目 蛋白質(zhì)工程 基因工程
區(qū)別 起點 預(yù)期的蛋白質(zhì)功能 目的基因
過程 預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列→獲得需要的蛋白質(zhì) 獲取目的基因→構(gòu)建基因表達載體→將目的基因?qū)胧荏w細胞→目的基因的檢測與鑒定
目標 定向改造或生產(chǎn)人類所需的蛋白質(zhì) 定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產(chǎn)品
結(jié)果 生產(chǎn)非天然的蛋白質(zhì) 生產(chǎn)自然界已有的蛋白質(zhì)
聯(lián)系 ①都在生物體外對基因進行操作；②蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎(chǔ)上延伸出來的第二代基因工程
“二看法”判斷基因工程和蛋白質(zhì)工程
一看對基因的操作方法—
二看合成的蛋白質(zhì)種類—
典例3　中華鱘是地球上最古老的脊椎動物，被稱為“活化石”。研究者試圖通過蛋白質(zhì)工程改造中華鱘體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)，使其更加適應(yīng)現(xiàn)在的水域環(huán)境，以下說法錯誤的是( D )
A．該工程可以定向改變蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)
B．改造蛋白質(zhì)是通過改造基因結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)的
C．改造后的中華鱘和現(xiàn)有中華鱘仍是同一物種
D．改造后的中華鱘的后代不具有改造的蛋白質(zhì)
解析：改造后的中華鱘具有新的性狀，但其和現(xiàn)有中華鱘仍是同一物種；蛋白質(zhì)工程改造的是基因，可以遺傳給子代，因此改造后的中華鱘的后代也具有改造的蛋白質(zhì)。
學 | 霸 | 記 | 憶
1.基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界中已存在的蛋白質(zhì)。
2．蛋白質(zhì)工程并不是直接改造蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，而是通過基因操作來實現(xiàn)對天然蛋白質(zhì)的改造。
3．蛋白質(zhì)工程的基本途徑：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有的氨基酸序列→找到并改變相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質(zhì)
4．蛋白質(zhì)工程是以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因改造或基因合成，來改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需要。
1．關(guān)于蛋白質(zhì)工程的基本流程，下列敘述正確的是( A )
①設(shè)計預(yù)期蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)
②推測氨基酸序列
③預(yù)期蛋白質(zhì)功能
④找出相應(yīng)脫氧核苷酸序列
A．③→①→②→④　 B．④→②→①→③
C．①→②→③→④ D．③→④→①→②
解析：蛋白質(zhì)工程的基本流程是：從③預(yù)期蛋白質(zhì)功能出發(fā)→①設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→②推測應(yīng)有的氨基酸序列→④找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列，A正確。
2．科研人員利用相關(guān)技術(shù)改變了胰島素B鏈的第9位氨基酸，從而避免了胰島素結(jié)合成無活性的二聚體形式。下列相關(guān)敘述中，不正確的是( A )
A．該過程的操作對象是胰島素分子
B．可通過測定DNA序列確定突變是否成功
C．對胰島素結(jié)構(gòu)的改造屬于蛋白質(zhì)工程
D．胰島素的本質(zhì)是蛋白質(zhì)不宜口服使用
解析：蛋白質(zhì)工程的直接操作對象是基因，而不是蛋白質(zhì)，A錯誤；可通過測定DNA序列確定突變是否成功，B正確；胰島素是蛋白質(zhì)，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改造屬于蛋白質(zhì)工程，C正確；胰島素為蛋白質(zhì)，若口服會被消化酶分解，因此胰島素不宜口服使用，D正確。
3．豬胰島素用于降低人體血糖濃度的效果并不明顯，原因是豬胰島素分子中有一個氨基酸與人的不同。為了使豬胰島素能夠用于臨床治療糖尿病，利用蛋白質(zhì)工程對豬胰島素分子設(shè)計的最佳方案是( A )
A．對豬胰島素進行一個不同氨基酸的替換
B．將豬胰島素和人胰島素進行拼接組成新的胰島素
C．將豬和人的胰島素混合在一起治療糖尿病
D．根據(jù)人的胰島素設(shè)計制造一種全新的胰島素
解析： 由于豬胰島素分子中只有一個氨基酸與人的胰島素不同，所以只需替換這一個不同的氨基酸即可。雖然根據(jù)人胰島素分子設(shè)計一種全新的胰島素也可以用于臨床治療，但是在分子設(shè)計和胰島素的生產(chǎn)方面都存在很多的困難，所以并不是最佳方案。第2節(jié)　基因工程的基本操作程序
課標要求
1．闡明基因工程的原理和基本操作程序。
2．針對人類生產(chǎn)或生活中的某一需求，選取適當?shù)幕蚬こ痰募夹g(shù)和方法，嘗試設(shè)計獲得某一轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方案。
3．嘗試進行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產(chǎn)物。
核心素養(yǎng)
1．科學思維——結(jié)合生產(chǎn)實例，舉例說出基因工程的基本操作程序。
2．科學探究——針對人類生產(chǎn)和生活的某一需求，嘗試提出初步的基因工程構(gòu)想，完成初步設(shè)計。
知識點一　目的基因的篩選與獲取
基礎(chǔ)知識·雙基夯實
1．目的基因
(1)概念：用于改變_受體細胞性狀__或獲得_預(yù)期表達產(chǎn)物__等的基因。
(2)實例：培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的目的基因是_Bt抗蟲蛋白基因__。
2．獲取方法
特別提醒：引物是依據(jù)目的基因的已知序列設(shè)計而成的，其提供3′端，以便DNA聚合酶催化單個脫氧核苷酸連接。
活 | 學 | 巧 | 練
1.目的基因只能是編碼蛋白質(zhì)的基因。( × )
2．PCR需要的條件與細胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件完全一致。( × )
3．PCR復(fù)性時，溫度一般為72 ℃。( × )
合 | 作 | 探 | 究
1.PCR過程中為什么需要引物？DNA鏈復(fù)制的方向是怎樣的？
提示：DNA聚合酶不能從頭合成子鏈，只能把游離的脫氧核苷酸連接到已經(jīng)存在的片段上。加入引物，能夠使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。DNA鏈復(fù)制的方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。
2．PCR擴增目的基因時，復(fù)性溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。復(fù)性溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對，復(fù)性溫度過低又會造成引物不能與DNA模板鏈的特定部位結(jié)合。復(fù)性溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，假設(shè)引物的長度相同，在GC含量高時，對復(fù)性溫度的設(shè)定有什么要求？說明理由。
提示：在引物的GC含量高時，設(shè)定的復(fù)性溫度要高一些。因為DNA分子中G—C之間有三個氫鍵，A—T之間有兩個氫鍵。
3．在利用PCR獲取和擴增目的基因時，從第幾輪循環(huán)才會產(chǎn)生完整的目的基因？
提示：第3輪
課內(nèi)探究·名師點睛
1．目的基因
用于改變受體細胞性狀或獲得預(yù)期表達產(chǎn)物等的基因，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。
2．目的基因的獲取方法
(1)從基因文庫中獲取。
(2)利用PCR技術(shù)擴增。
(3)通過化學方法人工合成。
3．PCR反應(yīng)
(1)條件
①模板：DNA母鏈(目的基因所在的DNA片段)。
②酶：耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。
③兩種引物：分別與兩條模板鏈相結(jié)合。
④原料：四種脫氧核苷酸。
(2)過程
過程 說明 圖解
變性 溫度上升到90 ℃左右，雙鏈DNA解聚為單鏈
復(fù)性 溫度下降到50 ℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合
延伸 溫度上升到72 ℃左右，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下從引物起始合成互補鏈，可使新鏈由5′端向3′端延伸
(3)結(jié)果
上述三步反應(yīng)完成后，一個DNA分子就變成了兩個DNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反應(yīng)過程都是在PCR擴增儀中完成的。
典例1　下列關(guān)于PCR反應(yīng)體系中所加物質(zhì)作用的敘述，錯誤的是( B )
A．耐高溫的DNA聚合酶用于催化DNA子鏈的合成
B．引物使TaqDNA聚合酶能從引物的5′端延伸DNA鏈
C．目標DNA母鏈用作合成DNA復(fù)制的模板
D．四種脫氧核苷酸為PCR提供原料
解析：通過PCR技術(shù)擴增目的基因時，需要用耐高溫的DNA聚合酶催化單個脫氧核苷酸聚合形成DNA子鏈，A正確；在復(fù)制時，引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶從引物的3′端開始延伸DNA鏈，因此DNA合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，B錯誤；PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制，DNA復(fù)制時兩條鏈均作為復(fù)制的模板，C正確；DNA合成的原料是四種脫氧核苷酸，D正確。
關(guān)于引物
①概念：引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物長度一般為20～30個核苷酸。
②作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，見下圖：
③ 引物類型
變式訓(xùn)練 下圖表示基因工程中獲取水稻某目的基因的不同方法。下列相關(guān)敘述中正確的是( A )
A．三種方法都需要酶并均在體外進行
B．①②③堿基對的排列順序均相同
C．三種方法均屬于人工合成法
D．方法a不遵循中心法則
解析：這三種方法都是在體外進行的，且都用到酶(方法a需要逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶；方法b需要限制酶；方法c需要DNA聚合酶)，A正確；通過方法a得到的目的基因不含有內(nèi)含子，通過方法c得到的目的基因的堿基序列可能有多種，因此①②③堿基對的排列順序不一定相同，B錯誤；圖示a和c屬于人工合成法，而b是從供體細胞的DNA中直接分離目的基因的方法，C錯誤；方法a遵循中心法則，D錯誤。
知識點二　基因表達載體的構(gòu)建
基礎(chǔ)知識·雙基夯實
1．構(gòu)建基因表達載體的目的
(1)使目的基因在受體細胞中_穩(wěn)定存在__，并且可以_遺傳__給下一代。
(2)使目的基因能夠_表達__和發(fā)揮作用。
2．基因表達載體的組成[填圖]
3．基因表達載體的構(gòu)建
首先用一定的_限制酶__切割載體，使它出現(xiàn)一個切口，然后用_同種__限制酶或_能產(chǎn)生相同末端__的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用_DNA連接酶__將目的基因片段拼接到載體的切口處。
活 | 學 | 巧 | 練
1.基因工程操作的核心步驟是目的基因的獲取。( × )
2．啟動子位于mRNA的上游。( × )
3．基因表達載體中的標記基因可用于目的基因的檢測與篩選。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
分析基因表達載體模式圖，回答下面問題：
1．構(gòu)建基因表達載體時，目的基因應(yīng)在哪個位置？為什么？
提示：由圖可知，目的基因要插入啟動子和終止子之間。因為啟動子使轉(zhuǎn)錄開始，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位；終止子位于基因的尾端，使轉(zhuǎn)錄終止；只有順序正確目的基因才能正常轉(zhuǎn)錄。
2．為什么一般不能將目的基因插入載體的標記基因中？
提示：標記基因用于鑒定受體細胞是否成功導(dǎo)入目的基因，以便將含目的基因的細胞篩選出來，若有目的基因插入，則標記基因被破壞，無法進一步篩選。
課內(nèi)探究·名師點睛
1．基因表達載體構(gòu)建的目的
(1)使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。
(2)使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。
2．地位：基因工程的核心步驟。
3．基因表達載體的組成
4．過程
典例2　下列有關(guān)基因表達載體的構(gòu)建的說法，錯誤的是( B )
①一個基因表達載體的組成只包括目的基因、啟動子、終止子
②有了啟動子才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA
③終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止
④所有基因表達載體的構(gòu)建是完全相同的
⑤必須在細胞內(nèi)進行
A．②③⑤ B．①④⑤
C．①②⑤ D．③④
解析：基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心步驟，基因表達載體是載體的一種，除了目的基因外，它還必須有啟動子、終止子和標記基因等，①錯誤；啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，②正確；終止子控制著轉(zhuǎn)錄的結(jié)束，③正確；由于受體細胞有植物、動物以及微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細胞的方法不同，因此基因表達載體的構(gòu)建是不完全相同的，④錯誤；基因表達載體的構(gòu)建必須在細胞外進行，⑤錯誤。
啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子
(1)啟動子位于基因的上游，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，與終止子一樣都位于DNA片段上，分別控制轉(zhuǎn)錄過程的啟動和終止。
(2)起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。
變式訓(xùn)練 如圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性內(nèi)切核酸酶。下列說法錯誤的是( B )
A．圖示過程是基因工程的核心步驟
B．表達載體構(gòu)建時需要用到限制酶SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來
D．除圖示組成外，表達載體中還應(yīng)該含有啟動子和終止子等結(jié)構(gòu)
解析：圖示過程為基因表達載體的構(gòu)建過程，是基因工程中的核心步驟；構(gòu)建過程中需要將目的基因完整切割下來，此時要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ；抗卡那霉素基因是標記基因，目的是便于鑒定和篩選含有目的基因的細胞；基因表達載體包括復(fù)制原點、啟動子、目的基因、終止子和標記基因等。
知識點三　將目的基因?qū)胧荏w細胞
基礎(chǔ)知識·雙基夯實
1．轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并在受體細胞內(nèi)_維持穩(wěn)定__和_表達__的過程。
2．目的基因?qū)胧荏w細胞的方法
(1)目的基因?qū)胫参锛毎?br/>①花粉管通道法
Ⅰ.用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入_子房__中。
Ⅱ.在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借_花粉管通道__進入_胚囊__。
②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
Ⅰ.農(nóng)桿菌的特點：農(nóng)桿菌自然條件下侵染_雙子葉__植物和_裸子__植物；農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上的_T－DNA__能夠整合到所侵染細胞的_染色體DNA__上。
Ⅱ.轉(zhuǎn)化方法：將目的基因插入農(nóng)桿菌_Ti質(zhì)粒的T－DNA__中，讓農(nóng)桿菌侵染植物細胞。
(2)目的基因?qū)雱游锛毎?br/>①常用方法：_顯微注射__法。
②常用受體細胞：_受精卵__。
(3)目的基因?qū)胛⑸锛毎?br/>①方法：用_Ca2＋__處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后將重組表達載體導(dǎo)入其中。
②常用受體細胞：原核細胞(使用最廣泛的是大腸桿菌)。
活 | 學 | 巧 | 練
1.將重組表達載體導(dǎo)入動物受精卵常用顯微注射法。( √ )
2．農(nóng)桿菌感染植物的機理：Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移到植物受體細胞內(nèi)，并且與其染色體DNA整合在一起。( √ )
3．常用Ca2＋處理植物細胞，使細胞可以吸收周圍環(huán)境中DNA。( × )
合 | 作 | 探 | 究
1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)腚p子葉植物和裸子植物的一種方法，原因是雙子葉植物和裸子植物能夠產(chǎn)生一種吸引農(nóng)桿菌的化學物質(zhì)，而單子葉植物不能產(chǎn)生這種物質(zhì)，能不能利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)雴巫尤~植物？說明原因。
提示：能，可從雙子葉植物中提取該化合物，再用該化合物處理單子葉植物細胞，然后就可用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)雴巫尤~植物細胞。
2．將目的基因?qū)雱游锏氖荏w細胞除了受精卵外，還可以選擇什么細胞？
提示：還可以將目的基因?qū)肱咛ジ杉毎?，因為胚胎干細胞也能發(fā)育成動物體。
課內(nèi)探究·名師點睛
1．導(dǎo)入的方法
受體細胞類型 方法 說明 特點
植物細胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細胞→插入植物細胞中的染色體DNA上→目的基因表達 經(jīng)濟、有效，適合于雙子葉植物和裸子植物
花粉管通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞→目的基因表達 簡便、經(jīng)濟，我國科學家獨創(chuàng)
動物細胞 顯微注射法 含目的基因片段的表達載體受精卵的核內(nèi)→將受精卵移植到雌性動物的輸卵管或子宮內(nèi)→使受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物 將目的基因?qū)雱游锛毎淖钣行У姆椒?br/>微生物細胞 Ca2＋處理法(感受態(tài)細胞法) Ca2＋處理微生物細胞→感受態(tài)細胞→將基因表達載體與感受態(tài)細胞混合在緩沖液中→在一定溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程 簡便、經(jīng)濟、有效
2.目的基因在受體細胞中的位置不同會引起遺傳上的差別
(1)圖中a細胞減數(shù)分裂時，細胞質(zhì)是不均分的，子細胞不一定含有目的基因。
(2)圖中b在進行細胞減數(shù)分裂時，細胞核中的DNA經(jīng)復(fù)制后平均分配到兩個子細胞中，保證了親子代遺傳性狀的穩(wěn)定性，細胞中目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達。
典例3　下列關(guān)于目的基因?qū)胧荏w細胞的敘述，不正確的是( D )
A．花粉管通道法的操作之一是用微量注射器將含有目的基因的溶液直接注入子房中
B．顯微注射技術(shù)是轉(zhuǎn)基因動物中采用最多的方法
C．大腸桿菌最常用的轉(zhuǎn)化方法是使細胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變
D．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是我國科學家獨創(chuàng)的一種方法
解析：花粉管通道法的操作之一是用微量注射器將含有目的基因的溶液直接注入子房中，A正確；目的基因?qū)雱游锛毎Ｓ玫姆椒ㄊ秋@微注射技術(shù)，B正確；大腸桿菌最常用的轉(zhuǎn)化方法是用Ca2＋處理細胞，使細胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變，從而完成轉(zhuǎn)化過程，C正確；我國科學家獨創(chuàng)的方法是花粉管通道法，D錯誤。
在將目的基因?qū)胧荏w細胞之前，都必須進行基因表達載體的構(gòu)建，也就是說導(dǎo)入受體細胞的必須是重組DNA分子，而不是直接導(dǎo)入目的基因。
變式訓(xùn)練 農(nóng)桿菌侵染植物細胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T—DNA插入植物基因組中。圖示為利用農(nóng)桿菌培育轉(zhuǎn)基因植物的基本流程，請據(jù)圖回答：
(1)剪除Ti質(zhì)粒的某些片段、替換復(fù)制原點O與添加抗生素的抗性基因T的過程①中，需用多種限制酶處理，原因是_不同的限制酶識別并切割不同的堿基序列__，需用_T4_DNA連接酶__“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。
(2)目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的基因__。由過程②形成的基因表達載體中，目的基因的上游具有_啟動子__，它是_RNA聚合酶__識別和結(jié)合的部位。
(3)過程③常用_Ca2＋(CaCl2溶液)__處理使農(nóng)桿菌成為感受態(tài)細胞?？股乜剐曰騎的作用是_用于鑒定和篩選導(dǎo)入了基因表達載體的農(nóng)桿菌__。
解析：(1)Ti質(zhì)粒具多種限制酶切割位點，是因為不同的限制酶識別并切割不同的堿基序列。連接平末端應(yīng)選用T4 DNA連接酶。(2)目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。目的基因的上游具有啟動子，以便于RNA聚合酶識別和結(jié)合。(3)過程③常采用Ca2＋(CaCl2溶液)處理農(nóng)桿菌，以增大農(nóng)桿菌細胞壁的通透性。抗生素抗性基因T用于檢測受體細胞中是否含有基因表達載體。
知識點四　目的基因的檢測與鑒定
基礎(chǔ)知識·雙基夯實
1．分子水平檢測
(1)通過_PCR__等技術(shù)檢測受體細胞染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。
(2)從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)用相應(yīng)的抗體進行_抗原—抗體__雜交，檢測目的基因是否翻譯成了蛋白質(zhì)。
2．個體水平鑒定
包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性及抗性程度。基因工程產(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品活性進行比較等。
活 | 學 | 巧 | 練
1.從大腸桿菌細胞中獲得人胰島素基因的mRNA，說明目的基因完成了表達。( × )
2．通過PCR技術(shù)可以檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
鑒定導(dǎo)入的抗蟲基因是否表達的最簡便的方法是什么？
提示：用葉片飼養(yǎng)棉鈴蟲，觀察棉鈴蟲是否死亡。
課內(nèi)探究·名師點睛
1．目的基因的檢測與鑒定
2．不同分子檢測原理的異同
(1)檢測目的基因是否插入受體DNA中、目的基因是否轉(zhuǎn)錄時，用的探針都是放射性同位素等標記的含有目的基因的DNA片段。檢測原理都是堿基互補配對原則，只是被檢測的物質(zhì)不同，一個是轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA，一個是轉(zhuǎn)基因生物細胞內(nèi)的mRNA。
(2)進行翻譯水平的檢測，通常以目的基因表達產(chǎn)物(蛋白質(zhì))作抗原，制備相應(yīng)抗體，檢測轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì)，利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理。
(3)不論是復(fù)制水平、轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平的檢測，都是在體外進行的。
基因工程操作過程中堿基互補配對現(xiàn)象
基因工程操作過程中只有第三步“將目的基因?qū)胧荏w細胞”沒有堿基互補配對現(xiàn)象；第一步篩選與獲取目的基因，用人工合成、PCR獲取或基因文庫獲取，三種常用方法都涉及堿基互補配對；第二步基因表達載體的構(gòu)建中DNA連接酶連接目的基因與質(zhì)粒載體，第四步利用分子雜交的方法檢測(DNA、mRNA)，也都存在堿基互補配對現(xiàn)象。
典例4　在檢測抗蟲棉培育是否成功的方法中，不屬于分子水平檢測的是( A )
A．觀察害蟲吃棉葉后是否死亡
B．通過PCR技術(shù)檢測棉花的染色體上是否插入了目的基因
C．檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄形成mRNA
D．從轉(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進行抗原—抗體雜交
解析：A項屬于個體水平的鑒定，不是分子水平的檢測。
變式訓(xùn)練 運用現(xiàn)代生物技術(shù)，將蘇云金桿菌的抗蟲基因整合到棉花細胞中，為了檢測實驗是否成功，最簡便的方法是檢測棉花植株是否有( D )
A．抗蟲基因　　　　 B．抗蟲基因產(chǎn)物
C．新的細胞核 D．相應(yīng)的性狀
解析：將蘇云金桿菌中的抗蟲基因轉(zhuǎn)移到棉花的細胞中，若此棉花抗蟲效果明顯的話，說明其體內(nèi)就具有細菌的抗蟲基因，因為生物的性狀是由基因控制的。
知識點五　DNA片段的擴增及電泳鑒定
基礎(chǔ)知識·雙基夯實
1．實驗基礎(chǔ)
(1)PCR原理：利用了_DNA的熱變性__原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。
(2)電泳：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
(3)PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的_大小和構(gòu)象__等有關(guān)。
2．實驗步驟
活 | 學 | 巧 | 練
1.微量移液器在使用前要先消毒。( × )
2．PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
1.判斷是否成功擴增出DNA片段的依據(jù)是什么？如果沒有成功應(yīng)該從哪些方面分析？
提示：可以通過在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及粗細程度來判斷。沒有成功的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當，PCR程序設(shè)置不當?shù)取?br/>2．如果沒有出現(xiàn)擴增條帶，可能的原因有哪些？
提示：模板DNA含有蛋白或含有TaqDNA聚合酶的抑制劑(如蛋白酶K、苯酚、EDTA)；TaqDNA聚合酶失活；引物出現(xiàn)質(zhì)量問題，濃度不合適；Mg2＋濃度過低；變性溫度低，變性時間短；目的序列變異等。
課內(nèi)探究·名師點睛
1．操作步驟
(1)加樣：按照PCR反應(yīng)體系的配方將所有組分加入微量離心管中，將微量離心管放入離心機里，離心約10 s，使反應(yīng)液集中在離心管底部。
(2)反應(yīng)：將微量離心管放入PCR儀中，設(shè)置程序進行反應(yīng)(可參照下表內(nèi)容進行設(shè)置)。
循環(huán)程序 變性 復(fù)性 延伸
預(yù)變性 94 ℃，5 min / /
30次 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
(3)制膠：根據(jù)待分離DNA片段的大小，制備瓊脂糖凝膠。一般配制質(zhì)量體積比為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。制好的凝膠放入電泳槽中，加電泳緩沖液，以沒過凝膠1 mm為宜。
(4)點樣：將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。
(5)電泳：待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。
(6)觀察：取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
2．注意事項
(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
(2)PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20 ℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
(3)在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
(4)在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
典例5　某實驗利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實驗結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是( D )
A．增加模板DNA的量
B．延長熱變性的時間
C．延長延伸的時間
D．提高復(fù)性的溫度
解析：增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度，但不能有效減少反應(yīng)非特異性條帶，A錯誤；延長熱變性的時間和延長延伸的時間會影響變性、延伸過程，但對于延伸中的配對影響不大，故不能有效減少反應(yīng)非特異性條帶，B、C錯誤；非特異性產(chǎn)物增加的原因可能是復(fù)性溫度過低會造成引物與模板的結(jié)合位點增加，故可通過提高復(fù)性的溫度來減少反應(yīng)非特異性條帶的產(chǎn)生，D正確。
變式訓(xùn)練 利用PCR檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號泳道為DNA分子量標準樣液，10號泳道為蒸餾水。PCR時加入的模板DNA如圖所示。下列分析錯誤的是( B )
A．PCR產(chǎn)物的分子大小在250 bp至500 bp之間
B．3號樣品為不含目的基因的載體DNA
C．9號樣品對應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株
D．10號泳道的電泳結(jié)果能確定反應(yīng)體系等因素對實驗結(jié)果沒有干擾
解析：PCR過程中，可以通過設(shè)計特定的引物來擴增特定的DNA片段。4～9號是轉(zhuǎn)基因植株，理論上應(yīng)包含目的基因，結(jié)合2號野生型和10號蒸餾水的結(jié)果，推測包含目的基因的片段大小應(yīng)為250～500 bp；3號PCR結(jié)果包含250～500 bp的片段，說明含有目的基因；9號PCR結(jié)果不包含250～500 bp的片段，所以不是所需的轉(zhuǎn)基因植株；10號放入蒸餾水，是為了排除反應(yīng)體系等因素對結(jié)果的干擾，由圖可知，10號泳道的電泳結(jié)果能確定反應(yīng)體系等因素對實驗結(jié)果沒有干擾。
細胞內(nèi)DNA復(fù)制與PCR反應(yīng)的比較
項目 體內(nèi)DNA復(fù)制 PCR反應(yīng)
不同點 時期 細胞有絲分裂間期和減數(shù)第一次分裂前的間期 體外隨時進行
場所 活細胞內(nèi) 微量離心管內(nèi)
酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
解旋 在解旋酶的作用下，細胞提供能量，部分解開 加熱至90 ℃以上時，雙鏈全部解開，不需解旋酶
引物 一小段RNA 可以是RNA或單鏈DNA分子片段
合成子鏈 在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合成，另一條鏈不連續(xù)合成 分別從兩條鏈的引物端開始，都是連續(xù)合成，控制溫度在72 ℃左右
特點 邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制 體外迅速擴增
循環(huán)次數(shù) 受生物體自身控制 30多次
產(chǎn)物 完整DNA DNA片段
相同點 原料 4種脫氧核苷酸(A、G、C、T)
復(fù)制原理 嚴格遵循堿基互補配對原則，半保留復(fù)制
模板 以DNA母鏈為模板
引物 都需要分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物
典例6　PCR過程與細胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相比，主要有兩點不同，它們是( C )
①PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA
②PCR過程不需要DNA聚合酶
③PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實現(xiàn)的
④PCR過程中，DNA不需要解旋，直接以雙鏈DNA為模板進行復(fù)制
A．③④　 B．①②　
C．①③　 D．②④
解析：PCR過程與細胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相比較，主要有兩點不同：一是PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA，長度通常為20～30個核苷酸；二是PCR過程中，DNA解旋不依賴解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實現(xiàn)的。
學 | 霸 | 記 | 憶
1.基因工程的基本操作程序有：(1)目的基因的篩選與獲??；(2)基因表達載體的構(gòu)建；(3)將目的基因?qū)胧荏w細胞；(4)目的基因的檢測與鑒定。
2．PCR反應(yīng)液中需要提供DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。
3．PCR反應(yīng)中每次循環(huán)一般可分為變性、復(fù)性、延伸三步。
4．基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心，基因表達載體是載體的一種，除了目的基因外，它還必須有啟動子、終止子以及標記基因等。
5．將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄓ修r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法。
6．將目的基因?qū)雱游锛毎Ｓ蔑@微注射技術(shù)，導(dǎo)入微生物細胞常用感受態(tài)細胞法(Ca2＋處理法)。
7．分子水平的檢測：檢測目的基因是否插入受體細胞的DNA中；檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA；檢測目的基因是否翻譯出相應(yīng)蛋白質(zhì)。
8．目的基因的檢測與鑒定還需要在個體生物學水平進行鑒定。
1．下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關(guān)敘述，正確的是( A )
A．⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異
B．③侵染植物細胞后，重組Ti質(zhì)粒整合到④的染色體上
C．④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲性狀
D．②的構(gòu)建需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶參與
解析： ⑤為轉(zhuǎn)基因植物，只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就說明轉(zhuǎn)入的目的基因成功表達了，基因工程的原理是基因重組，屬于可遺傳變異，A項正確；③侵染植物細胞后，重組Ti質(zhì)粒上的T－DNA整合到棉花細胞的染色體上，B項錯誤；受體細胞的染色體上可能含抗蟲基因，但不代表該基因就一定成功表達，因此不能確定⑤是否表現(xiàn)出抗蟲性狀，C項錯誤；基因表達載體的構(gòu)建需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶參與，D項錯誤。
2．如圖為某質(zhì)粒限制酶酶切圖譜。某基因不含圖中限制酶識別序列。為使PCR擴增的該基因重組進該質(zhì)粒，則擴增的該基因兩端需分別引入哪兩種限制酶的識別序列( A )
A．NdeⅠ和BamHⅠ　　 B．NdeⅠ和XbaⅠ
C．XbaⅠ和BamHⅠ D．EcoRⅠ和KpnⅠ
解析：構(gòu)建基因表達載體時應(yīng)將目的基因插入啟動子和終止子之間。由題圖可知，啟動子與終止子之間存在三種限制酶切點，但XbaⅠ在質(zhì)粒上有兩個切割位點，因此為使PCR擴增的該基因能準確插入啟動子與終止子之間，擴增時該基因兩端需分別引入NdeⅠ和BamHⅠ兩種限制酶的識別序列。
3．圖1為胰島素基因結(jié)構(gòu)與引物位置示意圖，圖2為pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖，圖中EcoRⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ和HindⅢ為限制酶，箭頭或線段所指位點為對應(yīng)酶切位點。研究人員欲用此質(zhì)粒構(gòu)建胰島素基因的表達載體，培養(yǎng)能產(chǎn)生人胰島素的大腸桿菌。請回答下列相關(guān)問題：
(1)若要進行胰島素基因的擴增常采用_PCR__技術(shù)。已知DNA新鏈的合成方向是5′→3′，若利用圖2中質(zhì)粒構(gòu)建基因表達載體，應(yīng)該選擇的引物為_引物4、引物5__。
(2)在構(gòu)建基因表達載體時，選擇_BamHⅠ和HindⅢ__作為分別切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶，可提高目的基因和載體的正確連接效率，其原因是_這兩種酶能切割質(zhì)粒和目的基因，且能得到不同的黏性末端，避免質(zhì)粒和目的基因自連及反接__。
(3)成功構(gòu)建的基因表達載體含有人胰島素基因及其啟動子等，其中啟動子的作用是_提供RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的位點，驅(qū)動基因的轉(zhuǎn)錄__，若利用酵母菌作受體細胞生產(chǎn)胰島素，與大腸桿菌相比，利用酵母菌生產(chǎn)胰島素的優(yōu)勢有_酵母菌為真核細胞，含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，可對核糖體合成的蛋白質(zhì)進行加工__。若要檢測導(dǎo)入酵母菌的胰島素基因是否成功轉(zhuǎn)錄，常用_PCR__技術(shù)。
解析：(1)PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù)可以利用少量的DNA在短時間內(nèi)獲得大量的相同DNA。引物1～4的模板方向是5′→3′(從左到右)，由于DNA新鏈的合成方向是5′→3′，所以合成胰島素基因只能選擇引物3和引物4。同樣，對于引物5～8，只能選擇引物5和引物6才能合成胰島素基因。只有引物4和引物5擴增出來的胰島素基因含有和題圖2相同的兩種限制酶的識別位點，而引物3和引物6擴增出來的基因片段不含有，因此應(yīng)選擇的引物為4和5。(2)結(jié)合題圖1和題圖2，要提高目的基因和載體的正確連接效率，在構(gòu)建基因表達載體時，應(yīng)選擇BamHⅠ和HindⅢ，因為這兩種酶能同時切割質(zhì)粒和目的基因，且能得到不同的黏性末端，這樣就避免了質(zhì)粒和目的基因自連及反接。(3)啟動子的作用是提供RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的位點，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。大腸桿菌屬于原核生物，酵母菌屬于真核生物，因此與大腸桿菌相比，酵母細胞含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。利用酵母菌生產(chǎn)胰島素，可對核糖體合成的蛋白質(zhì)進行加工。為了檢測目的基因是否成功轉(zhuǎn)錄，即檢測是否存在胰島素基因?qū)?yīng)的mRNA，需用PCR技術(shù)。第3節(jié)　基因工程的應(yīng)用
課標要求
1．舉例說出基因工程在農(nóng)牧業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和食品工業(yè)等方面的應(yīng)用。
2．認同基因工程的應(yīng)用價值。
3．關(guān)注基因工程的進展。
核心素養(yǎng)
1．生命觀念——舉例說出植物基因工程、動物基因工程的成果及其給人類帶來的影響。
2．社會責任——用基因工程培育優(yōu)良品種或細胞產(chǎn)品，造福人類。
　　　　　　　知識點一　基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用
基礎(chǔ)知識·雙基夯實
1．轉(zhuǎn)基因抗蟲植物
(1)技術(shù)方法：從某些生物中分離出具有_抗蟲功能__的基因，將它導(dǎo)入作物中，培育出具有抗蟲性的作物。
(2)實例：抗蟲棉花、玉米、大豆、水稻和馬鈴薯等。
2．轉(zhuǎn)基因抗病植物
(1)技術(shù)方法：將來源于_病毒、真菌等__的抗病基因?qū)胫参镏校嘤鲛D(zhuǎn)基因抗病植物。
(2)實例：轉(zhuǎn)基因抗病毒甜椒、番木瓜和煙草等。
3．轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物
(1)技術(shù)方法：將_降解或抵抗某種除草劑__的基因?qū)胱魑铮膳嘤钩輨┑淖魑锲贩N。
(2)實例：轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米、大豆、油菜和甜菜等。
4．改良植物的品質(zhì)
(1)技術(shù)方法：將_必需氨基酸含量多的蛋白質(zhì)__編碼基因?qū)胫参镏校梢蕴岣哌@種氨基酸的含量。
(2)實例：轉(zhuǎn)基因玉米中賴氨酸的含量比對照高30%。
5．提高動物的生長速率
(1)技術(shù)方法：將_外源生長激素__基因?qū)雱游矬w內(nèi)，提高動物的生長速率。
(2)實例：轉(zhuǎn)基因鯉魚。
6．改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)
(1)技術(shù)方法：將_腸乳糖酶__基因?qū)肽膛；蚪M。
(2)實例：乳汁中乳糖含量大大降低的轉(zhuǎn)基因奶牛。
活 | 學 | 巧 | 練
1.農(nóng)業(yè)害蟲不會對轉(zhuǎn)基因抗蟲作物產(chǎn)生抗性。( × )
2．培育轉(zhuǎn)基因抗病植物的目的基因主要來源于病毒、真菌。( √ )
3．基因工程中，要培育轉(zhuǎn)基因植物和動物，選用的受體細胞都是受精卵。( × )
合 | 作 | 探 | 究
如圖為通過基因工程培育抗蟲棉的過程，請回答：
(1)抗蟲棉能抗病毒、細菌和真菌嗎？為什么？
提示：不能?？瓜x基因具有專一性。
(2)對于基因工程生產(chǎn)的抗蟲棉是否取得最后的成功，最簡單的檢測方法是什么？
提示：讓害蟲去吃轉(zhuǎn)基因棉花的植株，觀察害蟲的生存狀況。
(3)從環(huán)境保護角度出發(fā)，分析轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與普通棉相比在害蟲防治方面的優(yōu)越性有哪些？
提示：減少了化學農(nóng)藥的使用量，降低了環(huán)境污染。
(4)種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉若干年后，害蟲會不會對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉產(chǎn)生抗性？為什么？
提示：會。害蟲會因遺傳物質(zhì)發(fā)生改變產(chǎn)生對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗性。
課內(nèi)探究·名師點睛
1．植物基因工程的應(yīng)用
項目 外源基因類型 成果舉例
抗蟲轉(zhuǎn)基因植物 抗蟲基因：Bt抗蟲蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、植物凝集素基因 抗蟲的棉花、水稻、玉米
抗病轉(zhuǎn)基因植物 ①抗病毒基因：病毒外殼蛋白基因、病毒復(fù)制酶基因②抗真菌基因：幾丁質(zhì)酶基因、抗毒素合成基因 抗病毒的煙草、小麥、番茄、甜椒
抗逆轉(zhuǎn)基因植物 抗逆基因：調(diào)節(jié)細胞滲透壓基因、抗凍蛋白基因、抗除草劑基因 抗鹽堿和抗干旱的煙草、抗寒番茄、抗除草劑的大豆
改良品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物 優(yōu)良性狀基因：提高必需氨基酸含量的蛋白質(zhì)編碼基因、控制番茄成熟的基因、與花青素代謝有關(guān)的基因 高賴氨酸玉米、耐儲存番茄、新花色矮牽牛
2.轉(zhuǎn)基因植物中的目的基因
(1)目的基因都是來自其他生物的能表現(xiàn)出優(yōu)良性狀的外源基因，并不都是來自細菌、病毒等微生物，如抗凍蛋白基因來自魚類。
(2)有的目的基因通過控制蛋白質(zhì)的合成，直接控制生物的某些性狀，這反映了基因與性狀的直接關(guān)系；有的目的基因通過控制酶的合成來控制代謝，進而控制生物的性狀，這體現(xiàn)的是基因和性狀的間接關(guān)系。
(3)注意“抗蟲”和“抗病”的區(qū)別，二者可以分別通過害蟲接種和病毒(或真菌等)接種來進行個體水平的檢測。
3．動物基因工程的應(yīng)用
項目 外源基因類型 成果舉例
提高生長速率的轉(zhuǎn)基因動物 外源生長激素基因 轉(zhuǎn)基因綿羊、鯉魚
改善畜產(chǎn)品品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物 腸乳糖酶基因 乳汁中含乳糖較少的轉(zhuǎn)基因牛
生產(chǎn)藥物的轉(zhuǎn)基因動物 藥用蛋白基因＋乳腺中特異表達的基因的啟動子等調(diào)控元件 乳腺生物反應(yīng)器
作器官移植供體的轉(zhuǎn)基因動物 外源的抑制抗原決定基因表達的調(diào)節(jié)因子或除去供體的抗原決定基因 無免疫排斥的轉(zhuǎn)基因豬
典例1　下列關(guān)于培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的敘述，正確的是( B )
A．DNA連接酶能把Bt抗蟲蛋白基因與噬菌體相連接
B．Bt抗蟲蛋白基因可借助花粉管通道進入受體細胞
C．Bt抗蟲蛋白對害蟲和人都有不同程度的毒害作用
D．需制備好相應(yīng)抗原來檢測Bt抗蟲蛋白
解析： 培育轉(zhuǎn)基因植物常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，可用DNA連接酶將編碼Bt抗蟲蛋白的基因與農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒相連接，構(gòu)建基因表達載體，A項錯誤；在植物細胞基因工程中，可利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胧荏w細胞，也可以利用花粉管通道法將目的基因?qū)胧芫阎校珺項正確；Bt抗蟲蛋白對哺乳動物無毒害作用，C項錯誤；要檢測目的基因是否成功翻譯，可用抗原—抗體雜交技術(shù)進行檢測，目的基因翻譯的蛋白質(zhì)作為抗原，故需制備好相應(yīng)抗體來檢測Bt抗蟲蛋白，D項錯誤。
變式訓(xùn)練 如圖是培育抗除草劑玉米的技術(shù)路線圖，含有內(nèi)含子的報告基因只能在真核生物中正確表達，其產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍色。轉(zhuǎn)化過程中愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，會導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長。下列相關(guān)敘述錯誤的是( A )
A．過程①用兩種限制酶就可防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化
B．過程②用Ca2＋處理可提高轉(zhuǎn)化成功率
C．過程③應(yīng)在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)K
D．篩選得到的A是轉(zhuǎn)化愈傷組織
解析：過程①要用兩種限制酶切割出兩種不同的黏性末端序列，這樣才可防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，A錯誤；過程②用Ca2＋處理農(nóng)桿菌可使其成為吸收周圍環(huán)境DNA分子的生理狀態(tài)細胞，這樣可提高轉(zhuǎn)化成功率，B正確；報告基因的產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍色，而愈傷組織表面殘留的農(nóng)桿菌會導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長，因此過程③應(yīng)在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)K，C正確；篩選得到的A是轉(zhuǎn)化愈傷組織，即能在抗除草劑的培養(yǎng)基上生長且呈現(xiàn)藍色的組織，D正確。
知識點二　基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域和食品工業(yè)方面的應(yīng)用
基礎(chǔ)知識·雙基夯實
一、基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用
1．技術(shù)方法
(1)對微生物或動植物的細胞進行_基因改造__，使它們能夠生產(chǎn)藥物。
(2)利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物：將_藥用蛋白__基因與乳腺中特異表達的基因的_啟動子__等調(diào)控元件重組在一起，通過_顯微注射__導(dǎo)入哺乳動物的受精卵中，培育出的轉(zhuǎn)基因動物通過_分泌乳汁__生產(chǎn)所需要的藥物。
(3)培育移植器官：在器官供體的基因組中導(dǎo)入某種_調(diào)節(jié)因子__抑制_抗原決定__基因的表達或設(shè)法除去_抗原決定__基因，然后再結(jié)合_克隆__技術(shù)，培育出不會引起_免疫排斥__反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆器官。
2．實例：重組人干擾素、促紅細胞生成素、抗凝血酶、血清白蛋白等。
二、基因工程在食品工業(yè)方面的應(yīng)用
1．技術(shù)方法：利用基因工程菌生產(chǎn)食品工業(yè)用_酶__、_氨基酸__和_維生素__等。例如將編碼牛凝乳酶的基因?qū)氪竽c桿菌、黑曲霉或酵母菌的基因組中，再通過_工業(yè)發(fā)酵__生產(chǎn)凝乳酶。
2．實例：淀粉酶、脂酶、天冬氨酸和苯丙氨酸。
活 | 學 | 巧 | 練
1.利用工程菌可生產(chǎn)人的胰島素等某些激素。( √ )
2．乳腺反應(yīng)器就是把藥用蛋白基因?qū)雱游锏娜橄偌毎小? × )
合 | 作 | 探 | 究
1.為了生產(chǎn)藥物，常把藥用蛋白基因構(gòu)建的表達載體導(dǎo)入大腸桿菌或酵母菌細胞中構(gòu)建工程菌，選用細菌或酵母菌作為受體細胞的優(yōu)點有哪些？
提示：細菌和酵母菌繁殖快，多為單細胞，遺傳物質(zhì)相對少，生產(chǎn)能力大等。
2．在研制膀胱生物反應(yīng)器時，應(yīng)使藥用蛋白基因在什么細胞中特異表達？它與乳腺生物反應(yīng)器有什么相同和不同點？
提示：應(yīng)使藥用蛋白基因在膀胱上皮細胞中特異表達。相同點是收集藥用蛋白較容易，且不會對動物造成傷害。不同點是乳腺生物反應(yīng)器必須是處于生殖期的雌性動物才可生產(chǎn)藥用蛋白，而膀胱生物反應(yīng)器則是任何生長期的雌雄動物均可生產(chǎn)。
課內(nèi)探究·名師點睛
1．乳腺生物反應(yīng)器的操作過程
2．乳腺生物反應(yīng)器與基因工程菌生產(chǎn)藥物的區(qū)別
比較內(nèi)容 乳腺生物反應(yīng)器 基因工程菌
含義 指讓外源基因在哺乳動物的乳腺中特異表達，利用動物的乳腺組織生產(chǎn)藥物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類
受體基因結(jié)構(gòu)與人類基因結(jié)構(gòu)差異 動物基因結(jié)構(gòu)與人類的基因結(jié)構(gòu)基本相同 細菌和酵母菌的基因結(jié)構(gòu)與人類有較大差異
基因表達 合成的藥物蛋白與天然蛋白質(zhì)相同 細菌合成的藥物蛋白可能沒有活性
受體細胞 動物受精卵 微生物細胞
目的基因?qū)敕绞?顯微注射法 Ca2＋處理法
生產(chǎn)條件 不需嚴格滅菌；溫度等外界條件對其影響不大 需嚴格滅菌，嚴格控制工程菌所需的溫度、pH、營養(yǎng)物質(zhì)濃度等外界條件
藥物提取 從動物乳汁中提取 從微生物細胞或其培養(yǎng)液中提取
生產(chǎn)設(shè)備 畜牧業(yè)生產(chǎn)、提取設(shè)備 發(fā)酵生產(chǎn)、提取設(shè)備
典例2　采用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因羊作為乳腺生物反應(yīng)器，使其能合成人凝血因子且只存在于乳汁中。下列有關(guān)敘述，不正確的是( A )
A．將含有人凝血因子基因的表達載體導(dǎo)入羊乳腺細胞中即可獲得乳腺生物反應(yīng)器
B．將人凝血因子基因與乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控元件重組在一起構(gòu)建成基因表達載體
C．該轉(zhuǎn)基因羊產(chǎn)生的生殖細胞中可能會含有人凝血因子基因
D．與乳腺生物反應(yīng)器相比，膀胱生物反應(yīng)器不受性別等限制，受體來源更廣泛
解析：將含有人凝血因子基因的表達載體導(dǎo)入羊受精卵中，由這個受精卵發(fā)育成的轉(zhuǎn)基因羊中，人凝血因子基因在羊乳腺細胞中表達，獲得乳腺生物反應(yīng)器，A錯誤；構(gòu)建基因表達載體時需將人凝血因子基因與乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控元件重組在一起，B正確；用基因工程技術(shù)將人凝血因子基因?qū)胙蚴芫阎?，由這個受精卵發(fā)育成的轉(zhuǎn)基因羊中，人凝血因子基因存在于所有的體細胞中，在減數(shù)分裂形成生殖細胞時，該轉(zhuǎn)基因羊產(chǎn)生的生殖細胞中可能會含有人凝血因子基因，C正確；在乳腺生物反應(yīng)器中，只能從雌性動物進入泌乳期后分泌的乳汁中獲取產(chǎn)物，與乳腺生物反應(yīng)器相比，膀胱生物反應(yīng)器的優(yōu)點是雌性和雄性動物的尿液中都可提取到產(chǎn)物，不受性別等限制，受體來源更廣泛，D正確。
變式訓(xùn)練 下列關(guān)于利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白的敘述，錯誤的是( B )
A．需要將編碼藥用蛋白的基因與能在乳腺中特異性表達的基因的啟動子等調(diào)控元件重組在一起
B．可以使用感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化法將基因表達載體導(dǎo)入受體
C．需要借助于早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植技術(shù)培育出轉(zhuǎn)基因動物
D．藥物的生產(chǎn)會受到轉(zhuǎn)基因動物性別和年齡的限制
解析：培育轉(zhuǎn)基因動物，通常采用顯微注射法將目的基因?qū)雱游锸芫选?br/>乳腺生物反應(yīng)器與工程菌生產(chǎn)藥物的比較
名稱 乳腺生物反應(yīng)器 工程菌
含義 是指使外源基因在哺乳動物的乳腺中特異表達，利用動物的乳腺組織生產(chǎn)藥物蛋白 是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類細胞株系
基因結(jié)構(gòu) 動物基因的結(jié)構(gòu)與人類基因的結(jié)構(gòu)基本相同 細菌和酵母菌等生物基因的結(jié)構(gòu)與人類基因的結(jié)構(gòu)有較大差異
基因表達 合成的藥物蛋白與天然蛋白質(zhì)相同 細菌細胞內(nèi)沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器，產(chǎn)生的藥物蛋白可能沒有活性
受體細胞 動物的受精卵 微生物細胞
導(dǎo)入目的基因的方式 顯微注射法 感受態(tài)細胞法(Ca2＋處理法)
生產(chǎn)條件 不需嚴格滅菌，溫度等外界條件對其影響不大 需嚴格滅菌，嚴格控制工程菌所需的溫度、pH、營養(yǎng)物質(zhì)濃度等外界條件
藥物提取 從動物乳汁中提取 從微生物細胞中提取
典例3　下列有關(guān)利用乳腺生物反應(yīng)器與微生物生產(chǎn)藥物的敘述，錯誤的是( D )
A．前者在乳汁中提取藥物，后者在細胞中提取
B．兩者都是基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用
C．前者合成的蛋白質(zhì)可加工成熟，后者合成的蛋白質(zhì)一般不能加工成熟
D．動物和微生物的基因結(jié)構(gòu)與人體的基因結(jié)構(gòu)均相同
解析： 前者在乳汁中提取藥物，后者在細胞中提取；乳腺生物反應(yīng)器和微生物生產(chǎn)藥物都是基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用；前者合成的蛋白質(zhì)可加工成熟，工程菌一般是原核生物，合成的蛋白質(zhì)一般不能加工成熟；真核生物基因的編碼區(qū)有內(nèi)含子和外顯子之分，原核生物基因的編碼區(qū)無內(nèi)含子與外顯子之分。
學 | 霸 | 記 | 憶
1.將來源于某些病毒、真菌的抗病基因?qū)胫参镏校嘤D(zhuǎn)基因抗病植物。
2．將外源生長激素基因?qū)膈庺~，可提高鯉魚的生長速度。
3．將藥用蛋白基因?qū)氪竽c桿菌或酵母菌構(gòu)建工程菌可生產(chǎn)藥物。
4．將藥用蛋白基因與乳腺中特異表達的基因的啟動子等調(diào)控元件重組成表達載體導(dǎo)入哺乳動物的受精卵中可構(gòu)建乳腺生物反應(yīng)器。
5．在器官供體的基因組中導(dǎo)入某種調(diào)節(jié)因子，以抑制抗原決定基因的表達，或設(shè)法除去抗原決定基因，然后結(jié)合克隆技術(shù)，可培育出不會引起免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆器官。
1．下列關(guān)于基因工程的成果及應(yīng)用的說法，正確的是( C )
A．用基因工程方法培育的抗蟲植物也能抗病毒
B．利用基因工程菌只能生產(chǎn)藥物
C．基因工程使人們更容易培育出優(yōu)良性狀的動植物品種，獲得很多過去難以得到的生物制品
D．利用基因工程生產(chǎn)乙肝疫苗時，目的基因存在于人體B淋巴細胞的DNA中
解析：抗蟲基因的表達產(chǎn)物是毒蛋白，只能對害蟲起作用；利用基因工程菌除了可以生產(chǎn)藥物，還能生產(chǎn)食品工業(yè)用酶、氨基酸和維生素等；利用基因工程生產(chǎn)乙肝疫苗是通過構(gòu)建含有乙肝病毒表面抗原基因的重組質(zhì)粒，然后導(dǎo)入相應(yīng)的宿主細胞，如酵母菌細胞，生產(chǎn)乙肝病毒表面抗原蛋白，人體B淋巴細胞DNA中不含該基因。
2．下列表示抗凝血酶乳腺生物反應(yīng)器的制備過程，下列說法正確的是( D )
―→
A．該轉(zhuǎn)基因牛中的抗凝血酶基因只存在于乳腺細胞中
B．②表示性別為雄性的胚胎
C．常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胧荏w細胞
D．①表示受精卵
解析：該轉(zhuǎn)基因牛中的抗凝血酶基因存在于所有體細胞中，只是在乳腺細胞中表達，A錯誤；②表示性別為雌性的胚胎，B錯誤；常用顯微注射法將目的基因?qū)雱游锸芫?，C錯誤；培育轉(zhuǎn)基因動物時常以受精卵作為受體細胞，因此①表示受精卵，D正確。
3．科學家將含有人體α－抗胰蛋白酶基因的表達載體注射到羊的受精卵中，該受精卵發(fā)育的雌羊乳汁中含有α－抗胰蛋白酶。上述過程一般不會發(fā)生( B )
A．α－抗胰蛋白酶基因與載體間基因重組
B．α－抗胰蛋白酶基因在乳腺細胞中大量擴增
C．RNA聚合酶識別乳腺特異表達基因的啟動子
D．乳腺細胞中高爾基體的數(shù)量相對較多
解析：該過程中需要構(gòu)建基因表達載體，因此會發(fā)生α－抗胰蛋白酶基因與載體間基因重組；乳腺細胞已經(jīng)高度分化，不再分裂，因此α－抗胰蛋白酶基因不能在乳腺細胞中大量擴增，只能在乳腺細胞中大量表達；RNA聚合酶識別乳腺特異表達基因的啟動子，并與之結(jié)合進而啟動轉(zhuǎn)錄過程；α－抗胰蛋白酶是一種分泌蛋白，動物細胞中高爾基體與分泌蛋白的形成有關(guān)，因此乳腺細胞中高爾基體數(shù)量較多。第1節(jié)　重組DNA技術(shù)的基本工具
課標要求
1．簡述重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具及其作用。
2．認同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。
3．進行DNA的粗提取與鑒定。
核心素養(yǎng)
1．科學思維——模擬重組DNA分子的操作過程，說出合成新DNA分子的基本原理。
2．社會責任——關(guān)注基因工程的社會議題，參與討論基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展如何催生了基因工程。
　　知識點一　基因工程的概念與限制性內(nèi)切核酸酶
基礎(chǔ)知識·雙基夯實
一、基因工程的概念
1．操作場所：_生物體外__。
2．操作技術(shù)：_轉(zhuǎn)基因__等技術(shù)。
3．操作結(jié)果：賦予生物新的_遺傳特性__，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的_生物類型__和生物產(chǎn)品。
4．操作水平：_DNA分子__水平。
二、重組DNA技術(shù)的基本工具
限制性內(nèi)切核酸酶(又稱限制酶)——“分子手術(shù)刀”
1．來源：主要來自_原核生物__。
2．功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定_核苷酸序列__，并使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的_磷酸二酯鍵__斷開。
3．結(jié)果：產(chǎn)生_黏性末端__或_平末端__。
活 | 學 | 巧 | 練
1.基因工程的原理是基因重組，不過在這里這種變異是定向的。( √ )
2．限制酶在原來的原核細胞內(nèi)對細胞自身有害。( × )
3．不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端相同。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
為什么限制酶主要從原核生物中分離純化而來？推測它在原核生物中的作用是什么？它會不會切割自己的DNA分子？
提示：原核細胞容易受到外源DNA的入侵，原核細胞中的限制酶能夠切割入侵的外源DNA而保護自身。原核細胞中的限制酶不會切割自己的DNA分子，因為酶具有專一性或自己的DNA分子已被修飾而不被識別。
課內(nèi)探究·名師點睛
1．限制酶作用特點
(1)切割外源DNA，對自身的DNA不起作用，從而達到保護自身的目的。
(2)專一性：能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。
2．限制酶作用結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式——黏性末端和平末端。
(1)黏性末端：錯位切，在識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開，產(chǎn)生的是黏性末端，如下圖。
(2)平末端：平切，沿著識別序列的中心軸線切開，產(chǎn)生的是平末端，如下圖。
3．限制酶的識別序列和切割末端的判斷
(1)識別序列的特點：呈現(xiàn)堿基互補對稱，無論是奇數(shù)個堿基還是偶數(shù)個堿基，都可以找到一條中心軸線，如右圖，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。如以中心線為軸，兩側(cè)堿基互補對稱；以為軸，兩側(cè)堿基互補對稱。
(2)同一種限制酶一定能切出相同的黏性末端，相同的黏性末端不一定來自同一種限制酶的切割，但同樣能相互連接。
典例1　如圖表示限制酶切割某DNA分子的過程，從圖中可知，該限制酶能識別的堿基序列及切割位點是( C )
A．5′－CTTAAG－3′，切點在C和T之間
B．5′－CTTAAG－3′，切點在G和A之間
C．5′－GAATTC－3′，切點在G和A之間
D．5′－CTTAAC－3′，切點在C和T之間
解析：兩條鏈均按照5′→3′方向分析，由題圖可知該限制酶識別的堿基序列為5′－GAATTC－3′，并在G與A之間斷開磷酸二酯鍵，故選C。
變式訓(xùn)練 對下圖所示黏性末端的說法，正確的是( C )
A．甲、乙、丙黏性末端是由兩種限制性內(nèi)切核酸酶作用產(chǎn)生的
B．圖乙中的酶切位點在A與G之間
C．如果甲中的G突變?yōu)锳，則原限制性內(nèi)切核酸酶不能識別該切割位點
D．構(gòu)建基因表達載體所用的限制酶和DNA連接酶分別作用于a處和b處
解析： 根據(jù)題圖結(jié)果可知，切割甲的限制酶的識別序列是—GAATTC—，切割乙的限制酶的識別序列是—CAATTG—，切割丙的限制酶的識別序列是—CTTAAG—，故甲、乙、丙三個黏性末端是由三種限制酶作用產(chǎn)生的，A項錯誤；圖乙中的酶切位點在A與C之間，而不是A與G之間，B項錯誤；限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，如果甲中的G發(fā)生突變，則限制酶不能識別該切割位點，C項正確；構(gòu)建基因表達載體所用的限制酶和DNA連接酶的作用位點均是磷酸二酯鍵即a處，b處為氫鍵，D項錯誤。
知識點二　DNA連接酶及與DNA分子相關(guān)的幾種酶的分析
基礎(chǔ)知識·雙基夯實
(1)作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的_磷酸二酯鍵__。
(2)種類[填表]
　　種類比較　　 E.coli DNA連接酶 T4 DNA連接酶
來源 _大腸桿菌__ _T4噬菌體__
特點 只能連接_黏性末端__ 既可以連接黏性末端，又可以連接_平末端__
活 | 學 | 巧 | 練
1.E.coli DNA連接酶既能連接黏性末端，又能連接平末端。( × )
2．DNA連接酶可以連接目的基因與載體的氫鍵形成重組DNA。( × )
3．DNA連接酶能連接所有相同或互補的黏性末端，故該酶沒有專一性。( × )
合 | 作 | 探 | 究
限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶的作用是否都體現(xiàn)了酶的專一性？
提示：限制性內(nèi)切核酸酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開，體現(xiàn)了酶的專一性。E.coli DNA連接酶能將具有互補黏性末端的DNA片段連接起來，對末端的堿基序列沒有要求；T4 DNA連接酶既可以連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA分子的平末端，都對末端的堿基序列沒有要求，因此DNA連接酶的作用沒有體現(xiàn)酶的專一性。
課內(nèi)探究·名師點睛
1．限制酶與DNA連接酶的比較
項目 限制酶 DNA連接酶
不同點 作用 使特定部位的磷酸二酯鍵斷裂 在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵
應(yīng)用 用于提取目的基因和切割載體 用于基因表達載體的構(gòu)建
關(guān)系
　　2.DNA連接酶與DNA聚合酶的比較
種類 DNA連接酶 DNA聚合酶
相同點 催化形成磷酸二酯鍵
不同點 模板 不需要模板 需要以DNA的一條鏈為模板
作用過程 在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵 將單個核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羥基上，形成磷酸二酯鍵
作用結(jié)果 形成完整的DNA分子 形成DNA的一條鏈
用途 基因工程等 DNA復(fù)制
3.限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、DNA水解酶、解旋酶的作用部位圖解
(1)作用于磷酸二酯鍵的酶：限制酶(a斷開)、DNA連接酶(a形成)和DNA聚合酶(a形成)、DNA水解酶(a斷開)。
(2)作用于b(氫鍵)的酶：解旋酶。
氫鍵的形成是由于分子間的作用力，其斷裂與重新形成均與限制酶、DNA連接酶無關(guān)。
典例2　下列有關(guān)DNA連接酶的敘述，正確的是( C )
A．T4 DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間連接起來
B．E.coli DNA連接酶能將雙鏈DNA片段平末端之間進行連接
C．DNA連接酶能恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵
D．DNA連接酶可連接DNA雙鏈的氫鍵，使雙鏈延伸
解析：T4 DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，A錯誤；E.coli DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間連接起來，不能將雙鏈DNA片段平末端之間進行連接，B錯誤；DNA連接酶能使兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，從而將它們連接起來，C正確，D錯誤。
變式訓(xùn)練 在基因工程操作過程中，DNA連接酶的作用是( C )
A．將任意兩個DNA片段連接起來
B．將具有相同黏性末端的DNA片段連接起來，包括DNA片段和堿基對之間的氫鍵
C．連接具有互補黏性末端或平末端的DNA片段，即形成磷酸二酯鍵
D．只連接具有相同黏性末端的DNA片段堿基對之間的氫鍵
解析：DNA連接酶將具有互補的黏性末端或平末端的DNA片段連接起來，恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵。
知識點三　基因進入受體細胞的載體
基礎(chǔ)知識·雙基夯實
1．質(zhì)粒
(1)質(zhì)粒的本質(zhì)：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單，獨立于_真核細胞的細胞核__或_原核細胞擬核DNA__之外，并具有_自我復(fù)制__能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。
(2)質(zhì)粒適于作基因運載體的特點
①質(zhì)粒分子上有一個至多個_限制酶切割__位點，供外源DNA片段插入其中。
②攜帶外源DNA片段的質(zhì)粒進入受體細胞后，能在細胞中_進行自我復(fù)制__，或_整合到受體DNA上__，隨_受體細胞DNA__同步復(fù)制。
③人工改造的質(zhì)粒常帶有_標記基因__，便于_重組DNA分子的篩選__。
2．噬菌體、動植物病毒等。
活 | 學 | 巧 | 練
1.載體的種類有質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒等，其中動植物病毒必須是DNA病毒。( √ )
2．所有的質(zhì)粒都可以作為載體。( × )
3．基因工程中的載體與細胞膜上的載體成分一樣。( × )
合 | 作 | 探 | 究
1.所有載體都是質(zhì)粒嗎？為什么？
提示：不是；除了質(zhì)粒外，載體還有動植物病毒和噬菌體。
2．將外源基因直接導(dǎo)入受體細胞可行嗎？為什么？
提示：不可行；因為如果沒有載體，導(dǎo)入受體細胞后，目的基因無法進行自我復(fù)制和穩(wěn)定存在以及表達。
3．質(zhì)粒上的一些抗生素抗性基因有什么作用？
提示：作為標記基因，對重組DNA進行篩選，檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞。
課內(nèi)探究·名師點睛
1．載體的功能
(1)作為運載工具將目的基因轉(zhuǎn)運到宿主細胞內(nèi)。
(2)利用它在受體細胞內(nèi)對目的基因進行大量復(fù)制。
2．常用的載體——質(zhì)粒
(1)存在場所：細菌、真菌等生物的細胞質(zhì)。
(2)本質(zhì)：環(huán)狀DNA分子。
(3)特點：含有標記基因。
(4)載體必須具備的條件
①能在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制。
②有一至多個限制酶切割位點，以便與外源基因連接。
③具有某些標記基因，以便進行篩選。
④載體應(yīng)對受體細胞無毒害作用，否則受體細胞將受到損傷甚至死亡。
基因工程中的載體與載體蛋白的區(qū)別
基因工程中的載體 載體蛋白
來源 質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒 細胞膜上的蛋白質(zhì)
作用 將目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細胞中，并能在宿主細胞中對目的基因進行大量復(fù)制 運載要進出細胞的某些物質(zhì)
典例3　質(zhì)粒是基因工程中最常用的目的基因運載工具。下列有關(guān)敘述正確的是( D )
A．質(zhì)粒是只存在于原核細胞的細胞質(zhì)中能自主復(fù)制的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子
B．在所有的質(zhì)粒上總能找到一個或多個限制酶切割位點
C．攜帶目的基因的重組質(zhì)粒只有整合到宿主細胞的染色體DNA上才會隨后者的復(fù)制而復(fù)制
D．質(zhì)粒上的抗性基因常作為標記基因供重組DNA的鑒定和選擇
解析：質(zhì)粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌細胞內(nèi)也有分布，A項錯誤；并不是所有的質(zhì)粒都能找到限制酶的切割位點而成為合適的運載目的基因的工具，B項錯誤；重組質(zhì)粒進入受體細胞后，可以在細胞內(nèi)自我復(fù)制，也可以整合后復(fù)制，C項錯誤；質(zhì)粒上的抗性基因常作為標記基因供重組DNA的鑒定和選擇，D項正確。
變式訓(xùn)練 某研究所的研究人員擬將生長激素基因通過質(zhì)粒介導(dǎo)進入大腸桿菌細胞內(nèi)，已知質(zhì)粒中存在兩個抗性基因：A是抗鏈霉素基因，B是抗氨芐青霉素基因，目的基因要插入到基因B中，且大腸桿菌本身不帶有任何抗性基因。下列敘述正確的是( D )
A．導(dǎo)入大腸桿菌的質(zhì)粒一定為重組質(zhì)粒
B．抗生素抗性基因是目的基因表達的必要條件
C．成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長
D．能在含鏈霉素的培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌不一定符合生產(chǎn)要求
解析：導(dǎo)入大腸桿菌的質(zhì)?？赡転橹亟M質(zhì)粒，也可能為普通質(zhì)粒，A錯誤；抗生素抗性基因是標記基因，是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，與目的基因表達無關(guān)，B錯誤；由于目的基因要插入到基因B中，即抗氨芐青霉素基因被破壞，工程菌不能抗氨芐青霉素，因此成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌不能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，C錯誤；能在含鏈霉素的培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌可能含有重組質(zhì)粒或普通質(zhì)粒，因此不一定符合生產(chǎn)要求，D正確。
知識點四　DNA的粗提取與鑒定
基礎(chǔ)知識·雙基夯實
1．實驗原理
(1)_DNA__不溶于酒精，_蛋白質(zhì)__溶于酒精。
(2)DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于_2_mol/L的NaCl__溶液。
(3)在一定溫度下，DNA遇_二苯胺__試劑會呈現(xiàn)藍色。
2．實驗步驟
(1)稱取30 g洋蔥，切碎，加入10 mL研磨液，充分研磨。
↓
(2)漏斗中墊_紗布__，將研磨液過濾到燒杯中，_4__ ℃處理，取上清液。
↓
(3)在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的_酒精__溶液，靜置2～3 min，用玻璃棒沿同一方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去水分。
↓
(4)取兩支20 mL的試管編號A、B，各加入2 mol/L的_NaCl__溶液5 mL，將絲狀物溶于B試管的NaCl溶液中。然后向兩支試管中各加入4 mL的_二苯胺試劑__?；靹蚝?，將試管置于_沸水__中加熱5 min。
↓
(5)結(jié)果觀察：A試管_不變藍__，B試管_變藍色__。
活 | 學 | 巧 | 練
1.DNA與蛋白質(zhì)都溶于酒精。( × )
2．在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺試劑即呈藍色。( × )
3．DNA能溶于2 mol/L的NaCl溶液。( √ )
合 | 作 | 探 | 究
1.鳥類和哺乳動物的紅細胞都適合用來提取DNA嗎？請說明理由。
提示：鳥類適合而哺乳動物成熟的紅細胞沒有細胞核，不適合作材料提取DNA。
2．實驗過程要充分地攪拌和研磨，如果研磨不充分，會對實驗結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？
提示：研磨不充分會使細胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，導(dǎo)致看不到絲狀物或沉淀物，用二苯胺鑒定不顯示藍色。
3．實驗過程中應(yīng)如何使用玻璃棒攪拌？為什么？
提示：攪拌時玻璃棒不能直插燒杯底部，攪拌要輕緩，并向一個方向攪拌以便獲得較完整的DNA分子。
課內(nèi)探究·名師點睛
1．實驗材料的選取
原則上，凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。選取的材料不同，提取DNA的方法可能稍有不同。
2．方法步驟
(1)粗提取DNA
(2)鑒定DNA
試管編號 A(對照組) B(實驗組)
步驟1 2 mol·L－1的NaCl溶液5 mL 2 mol·L－1的NaCl溶液5 mL
步驟2 不進行任何處理 加絲狀物或沉淀物
步驟3 加4 mL二苯胺試劑，混勻 加4 mL二苯胺試劑，混勻
步驟4 沸水浴5 min 沸水浴5 min
實驗現(xiàn)象 溶液不變藍色 溶液逐漸變?yōu)樗{色
實驗結(jié)論 DNA在沸水浴的情況下遇二苯胺會被染成藍色
特別提醒：(1)粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。
(2)不用哺乳動物的血液作為實驗材料，這是因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和細胞器，不含DNA。
(3)加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
(4)沉淀DNA時必須用冷酒精。預(yù)冷的酒精溶液具有以下優(yōu)點：一是可抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子運動，使DNA易形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少斷裂。
(5)二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會影響鑒定的效果。
典例4　下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的敘述，錯誤的是( A )
A．用同樣方法從等體積豬血和雞血中提取的DNA量相近
B．DNA析出過程中，用玻璃棒沿同一方向輕輕攪拌
C．預(yù)冷的乙醇可用來溶解蛋白質(zhì)
D．用二苯胺試劑鑒定DNA需要進行水浴加熱
解析： 豬屬于哺乳動物，其紅細胞沒有細胞核及各種細胞器，提取不到DNA，而雞屬于鳥類，其紅細胞內(nèi)含有細胞核與各種細胞器，DNA含量較多，A項錯誤；在除去相關(guān)蛋白后，DNA是非常容易斷裂的，如果太過劇烈地攪拌，DNA鏈可能會被破壞，因此輕柔攪拌的目的是為了獲得較完整的DNA分子，B項正確；在冷的95%酒精溶液中DNA的溶解度低，DNA的沉淀量大，C項正確；將析出的DNA溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后需要水浴加熱才會呈現(xiàn)藍色，D項正確。
變式訓(xùn)練 如圖是“DNA的粗提取與鑒定”實驗中的兩個操作步驟示意圖，下列有關(guān)敘述錯誤的是( B )
A．圖1中的絲狀物含有DNA
B．圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不溶
C．圖2所示實驗操作完成后，最好待試管中溶液冷卻后觀察顏色變化
D．圖2中的溶液b能夠溶解DNA
解析：圖1中的絲狀物含有DNA，A正確；圖1所示操作的原理是DNA不溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)溶于酒精，B錯誤；圖2所示實驗操作完成后，最好待試管中溶液冷卻后觀察顏色變化，C正確；圖2中的溶液b是NaCl溶液，能夠溶解DNA，D正確。
選擇限制酶的方法
根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點、質(zhì)粒上的限制酶切割位點以及是否破壞目的基因和標記基因來確定限制酶的種類。
(1)應(yīng)選擇酶切位點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ；不能選擇酶切位點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。
(2)為避免目的基因及質(zhì)粒的自身環(huán)化、正向連接、反向連接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和質(zhì)粒(雙酶切)，如圖甲可選擇用PstⅠ和EcoR Ⅰ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點)。
(3)切割質(zhì)粒的限制酶不能同時切開質(zhì)粒上的所有標記基因，即至少要保留一個標記基因，以用于重組DNA的鑒定和選擇，如圖乙中的質(zhì)粒不能使用SmaⅠ切割。
不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一個DNA分子用不同限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同。
典例5　利用某目的基因(圖甲)和P1噬菌體載體(圖乙)構(gòu)建重組DNA。限制性內(nèi)切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位點分別如下圖所示(已知這三種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同)。下列分析錯誤的是( D )
A．構(gòu)建重組DNA時，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體
B．構(gòu)建重組DNA時，可用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體
C．圖乙中的P1噬菌體載體只用EcoRⅠ切割后，含有兩個游離的磷酸基團
D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，再用DNA連接酶連接，只能產(chǎn)生一種重組 DNA
解析： 構(gòu)建重組DNA時，如果用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，目的基因兩端將形成不同的黏性末端，同樣P1噬菌體載體也形成這兩種黏性末端，因此它們可構(gòu)成重組DNA，A項正確；分析圖甲，HindⅢ的酶切位點在第二個EcoRⅠ的酶切位點的左側(cè)，因此用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段，目的基因兩端將形成不同的黏性末端，同樣用EcoRⅠ和HindⅢ切割P1噬菌體載體也形成這兩種黏性末端，因此它們可構(gòu)成重組DNA，B項正確；P1噬菌體載體為環(huán)狀DNA，其上只含有一個EcoRⅠ的酶切位點，因此用EcoRⅠ切割后，該環(huán)狀DNA分子變?yōu)殒湢頓NA分子，因每條DNA單鏈各含有一個游離的磷酸基團，故切割后含有兩個游離的磷酸基團，C項正確；用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體后形成的黏性末端相同，可正向連接或反向連接，不止能產(chǎn)生一種重組DNA，D項錯誤。
學 | 霸 | 記 | 憶
1.基因工程的基本原理是基因重組，外源DNA能在受體細胞表達的理論基礎(chǔ)是密碼子的通用性。
2．DNA重組技術(shù)的基本工具有限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和使目的基因進入受體細胞的載體。
3．限制性內(nèi)切核酸酶可識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并在特定位點上切割。
4．E.coli DNA連接酶只能連接黏性末端，而T4 DNA連接酶既能連接黏性末端，也能連接平末端。
5．質(zhì)粒作為基因工程的載體需具備的條件有：能在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定保存并自我復(fù)制；具有一個或多個限制酶切割位點；具有標記基因。
6．在基因工程中使用的載體除質(zhì)粒外，還有噬菌體、動植物病毒等。
7．DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。
8．DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同。
9．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色。
1．下列關(guān)于E.coli DNA連接酶的敘述，正確的是( A )
①催化具有相同黏性末端的DNA片段之間的連接
②催化具有互補黏性末端的DNA片段之間的連接
③催化具有平末端的DNA片段之間的連接
④催化單個脫氧核苷酸之間磷酸二酯鍵的形成
A．①②　 B．②④　
C．②③　 D．①④
解析：E.coli DNA連接酶來源于大腸桿菌，可用于連接相同或互補的黏性末端，不能連接平末端；T4 DNA連接酶來源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接平末端的效率相對較低。DNA連接酶不能連接單個的脫氧核苷酸，在DNA復(fù)制時，靠DNA聚合酶將單個的脫氧核苷酸聚合在一起。
2．用X酶切割DNA分子后，得到黏性末端①，用Y酶切割DNA分子后，得到黏性末端②，如圖所示，以下說法不正確的是( D )
A．X與Y通常是不同的限制酶
B．限制酶與DNA水解酶破壞的化學鍵相同
C．限制酶將一個DNA分子片段切成兩個片段需消耗兩個水分子
D．具有①②的兩個DNA片段可連接成重組分子，重組后還可以被X或Y切割
解析：由題圖可知，X與Y識別的核苷酸序列不同，因此X與Y是不同的限制酶，A正確；限制酶與DNA水解酶破壞的化學鍵相同，都是磷酸二酯鍵，B正確；限制性內(nèi)切核酸酶將一個DNA分子片段切成兩個片段，即斷裂兩個磷酸二酯鍵，因此需消耗兩個水分子，C正確；具有①②的兩個DNA片段可連接成重組分子，核苷酸序列發(fā)生了改變，所以重組后不能被X或Y切割，D錯誤。
3．下圖中甲、乙分別表示質(zhì)粒和含目的基因的DNA片段。幾種可供選擇使用的限制酶識別序列及其切割位點為
注：tetR表示四環(huán)素抗性基因；AmpR表示氨芐青霉素抗性基因。
回答下列問題：
(1)限制酶的作用是識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的_磷酸二酯鍵__斷開。題中可供使用的限制酶，切割相應(yīng)DNA片段后能產(chǎn)生黏性末端的有_EcoRⅠ、BamHⅠ、BclⅠ、Sam3AⅠ__。
(2)經(jīng)限制酶Sau3AⅠ切割后得到的DNA片段可以與上述其余限制酶中的_BamHⅠ、BclⅠ__(填限制酶名稱)切割后得到的DNA片段連接，理由是_它們切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端__。圖中甲質(zhì)粒經(jīng)Sau3AⅠ完全切割后可得到_3__種DNA片段。
(3)圖甲中的tetR和AmpR在運載體上可作為_標記基因__，用于重組DNA的鑒定和選擇。
解析：(1)限制酶的作用是識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。題中可供使用的限制酶切割相應(yīng)片段后都會產(chǎn)生黏性末端。(2)經(jīng)限制酶Sau3AⅠ切割后得到的DNA片段可以與其余限制酶中的BamHⅠ、BclⅠ切割后得到的DNA片段連接，理由是它們切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端。圖中甲質(zhì)粒有3個Sau3AⅠ的酶切位點(terR上有1個，而AmpR上有2個)，所以經(jīng)Sau3AⅠ完全切割后可得到3種DNA片段。(3)圖中甲的tetR和AmpR都是抗性基因，在運載體上可以作為標記基因，用于重組DNA的鑒定和選擇。

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