資源簡介

【備考2024】一輪新人教版生物學學案
第十單元　生物技術與工程
第2講　微生物的培養技術及應用
考點1　微生物的基本培養技術
一、培養基的配制
1．概念：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。
2．營養組成
(1)一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽等。
(2)需要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及O2的需求。
微生物 對培養基的需求
乳酸桿菌 添加維生素
霉菌 一般將培養基調至酸性
細菌 一般將培養基調至中性或弱堿性
厭氧微生物 提供無氧的條件
3．種類
(1)按物理狀態可分為液體培養基和固體培養基。
(2)按功能可分為選擇培養基和鑒別培養基。
二、無菌技術
1．概念：在培養微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。
2．關鍵：防止雜菌污染。
3．目的：獲得純凈的微生物培養物。
4．消毒與滅菌的比較
比較項目 條件 結果 常用方法 應用范圍
消毒 較為溫和的物理、化學或生物等方法 僅殺死物體表面或內部一部分微生物　　 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高溫的液體
化學藥物消毒法 操作空間、操作者的衣物和手等
紫外線消毒法 接種室、接種箱或超凈工作臺
滅菌 強烈的理化方法　　 殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子　　 濕熱滅菌法 培養基、容器等
干熱滅菌法 玻璃器皿、金屬用具等
灼燒滅菌法 接種工具等
5．其他操作
(1)做好消毒和滅菌工作后，要注意避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。
(2)為了避免周圍環境中微生物的污染，接下來的許多操作都應在超凈工作臺并在酒精燈火焰附近進行。
6．實例——酵母菌的純培養
1．無菌技術除用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么作用？(選擇性必修3　P10“旁欄思考”)
提示：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。
2．操作時，接種環通過滅菌，在第二次及以后劃線時，總是從上一次的末端開始劃線。這樣做的目的是什么？(選擇性必修3　P13“文字信息”)
提示：將聚集的菌體逐步稀釋以便獲得不連續的單個菌落。
3．在接種酵母菌的培養基上，若觀察到了不同形態的菌落，則分析可能是由哪些原因引起的？(選擇性必修3　P13“探究·實踐”)
提示：若觀察到了不同形態的菌落，可能是接種的菌種不純或無菌操作不規范等原因引起的。
4．日常生活中保存食品的方法有哪些？這些方法是如何阻止或抑制微生物生長的？(選擇性必修3　P14“概念檢測”)
提示：日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低溫儲存等。干制可以降低食品的含水量；腌制可以通過食鹽、糖等制造高滲環境，從而抑制微生物的生長和繁殖；低溫儲存通過降低微生物的代謝速率來抑制微生物的生長和繁殖。
1．在培養細菌時，要將培養基調至中性或弱酸性。 (×)
提示：在培養細菌時，一般需要將培養基調至中性或弱堿性。
2．蛋白胨中含有糖、維生素和有機氮等營養物質。 (√)
3．玻璃器皿、金屬用具等可以采用干熱滅菌。 (√)
4．微生物的純培養步驟為配制培養基→接種→滅菌→分離和培養等。 (×)
提示：微生物的純培養步驟為配制培養基→滅菌→接種→分離和培養等。
5．待滅菌后的培養基冷卻至50 ℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。 (√)
6．微生物的純培養物指的是未被雜菌污染的微生物。 (√)
7．酵母菌純培養的馬鈴薯葡萄糖培養基上的葡萄糖也可用蔗糖代替。 (√)
1．倒平板操作中，平板冷凝后，要將平板倒置，其主要原因是______________
_____________________________________________________________________。
提示：防止冷凝后形成的水珠滴落在培養基上(污染培養基和破壞菌落)和防止培養基水分過快蒸發
2．純培養時，須使用固體培養基，原因是________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：固體培養基上細菌分裂產生的子代個體不易分散，從而形成菌落
1．培養物、純培養物、純培養辨析
培養物 接種于培養基內，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體
純培養物 由單一個體繁殖所獲得的微生物群體
純培養 獲得純培養物的過程
2．平板劃線操作的注意事項
(1)灼燒接種環，待其冷卻后才能蘸取菌液，以免溫度太高殺死菌種。
(2)第二次及其以后的劃線操作總是從上一次劃線末端開始，能使微生物的數目隨著劃線次數的增加而逐漸減少，最終得到由單個微生物繁殖而來的菌落。
(3)劃線時最后一次的劃線不要與第一次的劃線相連。
(4)劃線用力大小要適當，防止用力過大將培養基劃破。
(5)操作第一步即取菌種之前及每次劃線之前都需要將接種環進行火焰灼燒滅菌，劃線操作結束時，仍需灼燒接種環，每次灼燒的目的如表：
第一次操作 每次劃線之前 劃線結束
目的 殺死接種環上原有的微生物 殺死上次劃線后接種環上殘留的菌種，使下次劃線的菌種直接來源于上次劃線的末端，使每次劃線菌種數目減少 殺死接種環上殘存的菌種，避免微生物污染環境和感染操作者
1．某同學為探究已純化的菌株能否分解纖維素，他將此菌株接種在纖維素分解菌選擇培養基上，一段時間后，培養基上出現了菌落，該同學認為此菌株能分解纖維素，但其他的同學并不認同他的觀點，你認為他們的理由是什么？
提示：實驗缺少空白對照；操作不規范。
2．某同學在利用稀釋涂布平板法純化土壤中的細菌時，發現培養基上的菌落連成一片，最可能的原因是什么？為了防止雜菌污染，有同學建議加入抗生素，你覺得可以嗎？并說明理由。
提示：最可能的原因是菌液濃度過高(土壤溶液稀釋不夠)。不可以，因為抗生素不但能殺滅雜菌，而且也可以殺滅目的菌，因此在培養基上不可以加入抗生素。
考查無菌技術
1．(2022·湖北選擇性考試)滅菌、消毒、無菌操作是生物學實驗中常見的操作。下列敘述正確的是(　　)
A．動、植物細胞DNA的提取必須在無菌條件下進行
B．微生物、動物細胞培養基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C．為防止蛋白質變性，不能用濕熱滅菌法對牛肉膏蛋白胨培養基進行滅菌
D．可用濕熱滅菌法對實驗中所使用的微量離心管、細胞培養瓶等進行滅菌
D　[動、植物細胞DNA的提取不需要在無菌條件下進行，A錯誤；動物細胞培養基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保證無菌環境，而微生物的培養不能加入抗生素，B錯誤；一般用濕熱滅菌法對牛肉膏蛋白胨培養基進行滅菌，以防止雜菌污染，C錯誤；可用濕熱滅菌法對實驗中所使用的微量離心管、細胞培養瓶等進行滅菌，以防止雜菌污染，D正確。]
2．(2022·江蘇揚州模擬)根據相關規定，每毫升合格的牛奶中細菌總數不超過50 000個。某興趣小組利用恒溫水浴鍋對新鮮牛奶進行消毒后，進行細菌總數測定，主要步驟如圖所示。相關敘述不正確的是(　　)
A．步驟①中用巴氏消毒法對新鮮牛奶進行消毒，可以減少營養物質的損失
B．步驟②對牛奶進行梯度稀釋可以使聚集的微生物分散，便于在培養基表面形成單菌落
C．步驟③中牛肉膏蛋白胨培養基要先高壓蒸汽滅菌再調pH，以防止高溫影響pH的穩定
D．實驗結束時培養基上的菌落可能不止一種，若平均菌落總數少于50個則表明消毒合格
C　[80 ℃、30 s～1 min處理新鮮牛奶屬于巴氏消毒法，采用短時高溫處理的目的是盡量減少牛奶中營養物質的損失，A正確；步驟②將牛奶進行梯度稀釋的目的是使聚集在一起的微生物分散，便于能在培養基表面形成單個菌落，B正確；牛肉膏蛋白胨培養基配制時應先調pH再滅菌，C錯誤；由于生牛奶中的微生物可能不止一種，而牛肉膏蛋白胨培養基屬于天然培養基，細菌、真菌等均可生長，因此，在實驗中，培養基上可能不止出現一種菌落，依據樣品液稀釋了1 000倍，接種液體積為1 mL，計算推測若平均菌落總數少于50個，則表明消毒后每毫升牛奶中細菌總數不超過50 000個，消毒合格，D正確。]
考查微生物的純培養技術
3．(2022·山東菏澤二模)野生型大腸桿菌菌株能在基本培養基上生長，氨基酸營養缺陷型突變株無法合成某種氨基酸，只能在完全培養基上生長，如圖為純化某氨基酸營養缺陷型大腸桿菌突變株的部分流程圖，①②③④代表培養基，A、B、C表示操作步驟，D、E為菌落。下列敘述正確的是(　　)
A．圖中①②④為基本培養基，③為完全培養基
B．A操作可提高基因突變和染色體變異的突變率，增加突變株的數量
C．B操作可用涂布器蘸取菌液均勻地涂布在②表面
D．經C過程原位影印及培養后，可從④中挑取D進行純化培養
D　[野生型大腸桿菌菌株能在基本培養基上生長，氨基酸營養缺陷型突變株無法合成某種氨基酸，只能在完全培養基上生長，讀圖可知，圖中①②④為完全培養基，③為基本培養基，A錯誤；大腸桿菌沒有染色體，紫外線可以提高基因突變的頻率，B錯誤；B操作是將菌液滴加到培養基表面，再用涂布器將菌液均勻的涂布在②表面，C錯誤；從圖中可看出，D在基本培養基中無法生長，在完全培養基中可生長，說明D是氨基酸缺陷型菌落，故經C過程影印及培養后，可從④培養基中挑取D菌落進行純化培養，D正確。]
4．(2022·廣東佛山二模)廣東特產陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰之功，其所含黃酮類物質起重要作用，而黑曲霉(一種無害霉菌)可以引起其含量的變化。為了研究黑曲霉對不同年份陳皮黃酮類成分的影響，某研究小組從江門市新會區收集一批陳皮樣品進行實驗?；卮鹣铝袉栴}：
(1)對于前期培養的黑曲霉，可利用__________________法得到單菌落，并通過顯微鏡檢測鑒定，獲得純的目標菌種，收集它的孢子制備懸浮液。
(2)分別稱取8克陳化2年、6年、10年的陳皮樣品粉末平鋪于培養皿，用紫外線對樣品進行正反面照射各30 min。用紫外線照射樣本的目的是____________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)將經紫外線照射過的每種年份的陳皮樣品都分為兩組，一組各加入1 mL無菌水，分別標記為XH2 0、XH6 0、XH10 0，另一組各加入__________________，不同年份的樣品分別標記為XH2、XH6、XH10，陳皮為黑曲霉的生長提供____________________等營養成分。置于恒溫恒濕條件下培養一段時間后，取不同接種天數的樣品檢測黃酮類成分的含量，實驗結果如表所示。據表分析，實驗結果表明：____________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________(答出兩點即可)。
編號 第5天 第7天 第9天 第11天 第13天
XH2 8.32 8.77 9.74 13.11 14.33
XH2 0 7.42 7.39 7.36 7.68 7.98
XH6 8.72 9.73 9.91 10.93 10.82
XH6 0 8.33 8.82 8.63 8.82 9.15
XH10 9.24 10.95 12.48 14.26 12.61
XH10 0 10.27 9.84 9.35 9.51 9.54
[解析]　(1)稀釋涂布平板法和平板劃線法均可獲得單菌落，據此，對于前期培養的黑曲霉，為獲得單菌落，可利用稀釋涂布平板法或平板劃線法獲得，并通過顯微鏡檢測鑒定菌落特征，獲得純的目標菌種，收集它的孢子制備懸浮液。(2)用紫外線照射樣本的目的是消毒，殺滅陳皮樣品中的細菌(微生物)進而保證實驗用的材料上的菌種均來自我們的接種物。(3)為保證等量原則，另一組各加入1 mL黑曲霉孢子懸浮液，不同年份的樣品分別標記為XH2、XH6、XH10。陳皮中含有有機物，能為黑曲霉的生長提供碳源、氮源(無機鹽)等營養成分。表中數據顯示，黑曲霉對不同年份陳皮的黃酮類成分含量均有促進作用；且黑曲霉對陳化2年的陳皮黃酮類成分含量促進作用最大；而且表現出隨著接種天數延長，黑曲霉對黃酮類成分含量的促進作用先增強后有所減弱。
[答案]　(1)平板劃線(或稀釋涂布平板)　(2)消毒，殺滅陳皮樣品中的細菌(微生物)　(3)1 mL黑曲霉孢子懸浮液　碳源、氮源(無機鹽)　黑曲霉對不同年份陳皮的黃酮類成分含量均有促進作用；黑曲霉對陳化2年的陳皮黃酮類成分含量促進作用最大；隨著接種天數延長，黑曲霉對黃酮類成分含量的促進作用先增強后放緩
考點2　微生物的選擇培養和計數
一、選擇培養基
二、微生物的選擇培養
1．土壤取樣
鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中
2．等比稀釋
將10 g土樣加入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1 mL上清液加入盛有9 mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。
3．涂布平板
4．培養觀察
(1)待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入30～37 ℃的恒溫培養箱中培養1～2 d。
(2)在涂布有合適濃度菌液的平板上可以觀察到分離的單菌落。
三、微生物的數量測定
1．稀釋涂布平板法
(1)計數原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。
(2)計數標準：為了保證結果準確，一般選擇菌落數為30～300的平板進行計數。
(3)計數方法：通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養，以保證獲得菌落數為30～300、適于計數的平板。在同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數，然后求出平均值。
(4)當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，統計結果一般用菌落數表示。
2．顯微鏡直接計數法
(1)計數原理：利用特定的細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量。
(2)優點：是一種常用的、快速直觀的測定微生物數量的方法。
四、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
1．該實驗中的選擇培養基對分解尿素的細菌具有選擇作用。若要判斷選擇培養基是否起到了篩選的作用，對照組應如何設置？(選擇性必修3　P19“探究·實踐”)
提示：用完全培養基接種后在相同條件下同時培養。
2．統計菌落種類和數目時要每隔24 h觀察統計一次，直到各類菌落數目穩定。若培養時間不足或培養時間太長，分別會導致什么結果？(選擇性必修3　P19“探究·實踐”)
提示：遺漏菌落的種類和數目。菌落粘連影響計數、培養基表面干燥脫水、微生物衰敗，菌落特征不易觀察。
3．為從富含纖維素的土壤中分離出有分解纖維素能力的高產菌株，將樣品稀釋涂布到鑒別培養基之前，可通過選擇培養增加纖維素分解菌的濃度。選擇培養基應以纖維素作為唯一的碳源。選擇培養能夠“濃縮”目的菌，分析其原因。(選擇性必修3　P20“拓展應用”)
提示：目的菌能夠以纖維素為碳源大量繁殖，而其他細菌不能以纖維素為碳源，無法正常生活。
1．選擇培養基可以鑒定某種微生物的種類。 (×)
提示：選擇培養基可以篩選分離出某種微生物。
2．脲酶催化尿素分解產生NH3。 (√)
3．對細菌進行計數時，可以用平板劃線法。 (×)
提示：對細菌計數可以采用稀釋涂布平板法或顯微鏡直接計數法。
4．篩選能分解尿素的細菌所利用的培養基中，尿素是唯一的氮源。 (√)
5．剛果紅與纖維素形成紅色復合物，可以通過是否產生透明圈來分離纖維素分解菌。 (√)
6．用細菌計數板可對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。 (√)
1．利用稀釋涂布平板法進行微生物數量測定時，統計的菌落數往往比活菌的實際數目要少，這是因為________________________________________________
_____________________________________________________________________。
提示：當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落
2．在進行土壤中分解尿素的細菌的分離與計數的相關實驗時，甲同學從對應1×106倍稀釋的培養基中篩選出大約200個菌落，但是其他同學在同樣稀釋度下只篩選出大約90個菌落，若甲同學的結果有問題，則可能的原因是_______
_____________________________________________________________________。
提示：培養基被雜菌污染或培養基中混入了其他含氮物質或土壤樣品不同
3．將純化后的纖維素分解菌接種在含有剛果紅的培養基上，然后將平板置于恒溫培養箱中培養適宜時間，這些平板上透明圈最大的單菌落中的纖維素分解菌分解纖維素的能力不一定是最強的，原因是_______________________________
_____________________________________________________________________。
提示：判斷纖維素分解菌分解能力的強弱，最準確的是透明圈直徑與菌落直徑的比值
1．兩種純化細菌的方法的比較
項目 平板劃線法 稀釋涂布平板法
純化原理 通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面 將菌液進行一系列的梯度稀釋，稀釋度足夠高時，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞
主要步驟 平板劃線操作 系列稀釋操作和涂布平板操作
接種工具 接種環 涂布器
平板示意圖
能否用于計數 不能計數 可以計數，但操作復雜，需涂布多個平板
共同點 都能將微生物分散到固體培養基表面，以獲得單細胞菌落，達到分離純化微生物的目的，也可用于觀察菌落特征
2．統計菌落時所用兩種計數方法的比較
比較項目 活菌計數法(稀釋涂布平板法) 顯微鏡直接計數法
原理 當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌 利用特定細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定體積的樣品中微生物的數量
公式 每克樣品中的菌落數＝(C÷V)×M C：某稀釋度下平板上生長的平均菌落數； V：涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)； M：稀釋倍數 每毫升原液所含細菌數＝每小格平均細菌數×400×104×稀釋倍數
缺點 當兩個或多個菌體連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落 不能區分細胞的死活
結果 比實際值小 比實際值大
3．選擇培養基四種常見制備方法或實例
(1)加入某些特定的物質(前提是培養基具備全部營養成分)
(2)改變培養基的營養成分
(3)利用培養基“特定化學成分”分離
(4)通過某些“特殊環境”分離
1．鑒定菌株間遺傳關系時，常將待測菌株的菌絲體接種于同一培養基內，若兩菌絲體間長出“拮抗線”，說明二者的遺傳關系較遠(圖1)。借助此原理，快速篩選出一株與平菇、杏鮑菇菌株遺傳關系較遠的融合菌株X，請在圖2中繪制模式圖，標注接種菌絲體位置，注明菌株類型，并大致畫出拮抗線的位置。
圖1　菌株間的拮抗現象(右圖為左圖的模式圖)
圖2
提示：
2．釀酒皮渣堆積過程中會積累醋酸菌和某些兼性厭氧型乳酸菌，向培養基中加入無菌碳酸鈣粉末，使培養基不透明，菌落生長時其周圍會出現透明圈?，F用篩選平板(培養基)初篩醋酸菌時，發現醋酸菌和乳酸菌在平板上形成的菌落形態很相似，很難區分。請設計一個實驗方案，區分篩選平板上的醋酸菌和乳酸菌。即簡要寫出實驗思路和預期結果及結論。
實驗思路：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
預期結果及結論：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
提示：將平板置于無氧環境下培養，觀察菌落和透明圈大小?！∪艟淅^續生長且透明圈增大，則為乳酸菌；若菌落不能繼續生長且透明圈不再增大，則為醋酸菌。
微生物的選擇培養
1．(2021·山東等級考)解脂菌能利用分泌的脂肪酶將脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸會使醇溶青瓊脂平板變為深藍色。將不能直接吸收脂肪的甲、乙兩種菌分別等量接種在醇溶青瓊脂平板上培養。甲菌菌落周圍呈現深藍色，乙菌菌落周圍不變色，下列說法錯誤的是(　　)
A．甲菌屬于解脂菌
B．實驗中所用培養基以脂肪為唯一碳源
C．可將兩種菌分別接種在同一平板的不同區域進行對比
D．該平板可用來比較解脂菌分泌脂肪酶的能力
B　[根據題干信息“甲菌菌落周圍呈現深藍色”，說明甲菌可以分泌脂肪酶將脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸會使醇溶青瓊脂平板變為深藍色，因此甲菌屬于解脂菌，A正確；乙菌菌落周圍沒有出現深藍色，說明乙菌不能產生脂肪酶，不能利用脂肪為其供能，但乙菌也可以在培養基上生存，說明該培養基不是以脂肪為唯一碳源，B錯誤；可將兩種菌分別接種在同一平板的不同區域進行對比，更加直觀，C正確；可以利用該平板來比較解脂菌分泌脂肪酶的能力，觀察指標可以是菌落周圍深藍色圈的大小，D正確。]
2．(2022·全國乙卷)化合物S被廣泛應用于醫藥、食品和化工工業。用菌株C可生產S，S的產量與菌株C培養所利用的碳源關系密切。為此，某小組通過實驗比較不同碳源對菌體生長和S產量的影響，結果見表。
碳源 細胞干重(g/L) S產量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖廢液 2.30 0.18
回答下列問題。
(1)通常在實驗室培養微生物時，需要對所需的玻璃器皿進行滅菌，滅菌的方法有__________________________(答出兩點即可)。
(2)由實驗結果可知，菌株C生長的最適碳源是________；用菌株C生產S的最適碳源是___________________。
菌株C的生長除需要碳源外，還需要______________________(答出兩點即可)等營養物質。
(3)由實驗結果可知，碳源為淀粉時菌株C不能生長，其原因是_____________
_____________________________________________________________________。
(4)若以制糖廢液作為碳源，為進一步確定生產S的最適碳源濃度，某同學進行了相關實驗。請簡要寫出實驗思路：____________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(5)利用制糖廢液生產S可以實現廢物利用，其意義是___________(答出一點即可)。
[解析]　(1)對所需的玻璃器皿進行滅菌，玻璃器皿常用的滅菌方法有干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌等。(2)由實驗結果可知，與以制糖廢液為碳源相比，以葡萄糖為碳源時菌株C的細胞干重最大，說明最適于菌株C生長的碳源是葡萄糖；而以制糖廢液為碳源時，用菌株C生產S的產量高于以葡萄糖為碳源時的產量，說明最適于生產S的碳源是制糖廢液。微生物的生長一般都需要水、碳源、氮源和無機鹽，還需要滿足微生物生長對pH、氧氣以及特殊營養物質的要求，故菌株C的生長除需要碳源外，還需要氮源、無機鹽、水等營養物質。(3)分析題中表格可以看出在以淀粉為碳源的培養基中，菌株C不能生長，原因可能是菌株C中缺少分解淀粉的酶，不能利用淀粉。(4)要測定生產S的最適制糖廢液的濃度，實驗自變量為制糖廢液的濃度，可分別配制一系列不同濃度梯度的以制糖廢液為唯一碳源的培養基，培養菌株C，其他條件相同且適宜，一段時間后，測定并比較不同濃度制糖廢液中的S的產量，S產量最高時對應的制糖廢液濃度，即為生產S的最適碳源濃度。(5)利用制糖廢液生產S可以實現廢物利用，既有利于減少污染、節省原料，又能降低生產成本。
[答案]　(1)高壓蒸汽滅菌、干熱滅菌　(2)葡萄糖　制糖廢液　氮源、無機鹽、水　(3)缺少淀粉酶　(4)分別配制一系列不同濃度梯度的以制糖廢液為唯一碳源的培養基，培養菌株C，其他條件相同且適宜，一段時間后，測定并比較不同濃度制糖廢液中的S的產量，S產量最高時對應的制糖廢液濃度即為生產S的最適碳源濃度　(5)減少污染、節省原料、降低生產成本
微生物的計數
3．(2022·山東濟寧模擬)嗜冷細菌在－15～20 ℃下能夠正常生長，其產生的大量胞外耐高溫的脂肪酶和蛋白酶會分解脂肪和蛋白質，從而造成牛奶腐敗變質。為測定某牛奶樣品中嗜冷細菌的數目，某生物小組做了如圖所示實驗，下列有關說法錯誤的是(　　)
注：培養皿旁的數字代表菌落數目。
A．牛奶樣品中不一定含有嗜冷細菌生長繁殖所需的所有營養成分
B．估算1 mL牛奶樣品中嗜冷細菌的活菌數為3.9×105個
C．剛擠出的鮮牛奶冷藏一段時間后進行高溫殺菌處理，牛奶就不會腐敗變質了
D．可從嗜冷細菌中獲得抗凍基因用于抗凍作物品種的培育
C　[嗜冷細菌在－15～20 ℃下能夠正常生長，牛奶樣品中主要含有碳源、氮源等，但不一定含有嗜冷細菌生長繁殖所需的所有營養成分，如生長因子等，A正確；計數時應選擇30～300的菌落數進行計算，據圖可知，1 mL牛奶樣品中嗜冷細菌的活菌數為(36＋39＋42)÷3×103÷0.1＝3.9×105個，B正確；牛奶等液體制品的消毒常采用巴氏消毒法，采用高溫殺菌處理對牛奶進行消毒處理時會破壞牛奶的營養物質，C錯誤；可從嗜冷細菌中獲得抗凍基因，將其作為目的基因導入作物體內，用于抗凍作物品種的培育，D正確。]
(教師用書獨具)
(2022·河北衡水一模)反硝化細菌能在無氧環境中將硝酸鹽轉化為氮氣(2NO＋10e－＋12H＋→……→N2O→N2)，在處理工業污水、治理水體富營養化中具有重要作用?？蒲腥藛T想從一污水處理廠的活性污泥中篩選分離出耐高溫(42 ℃)的反硝化細菌(目的菌)，用于提升溫度較高的工業污水的脫氮效率，具體流程如圖所示(BTB培養基初始pH＝6.8，BTB是酸堿指示劑，酸性條件下為黃色，中性條件下為綠色，堿性條件下為藍色)：
(1)BTB培養基滅菌后待平板凝固，應倒置放在超凈臺上，目的是___________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)將污泥樣品梯度稀釋后，使用________(填工具)將樣液均勻涂布在BTB培養基上，放在________環境中培養2～3天后，挑選顯________色的單菌落在固體培養基上劃線分離，獲得純菌株。
(3)將純菌株接種在液體培養基上培養一段時間，若在培養瓶頂部檢測到N2O，即可鑒定為目的菌。不能依據培養液中硝酸鹽的濃度變低來鑒定目的菌，原因是
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)C/N(碳氮含量比)對反硝化效率有一定的影響。科研人員測得不同C/N條件下目的菌對硝酸鹽的去除率，結果如圖所示：
科研人員提出，在利用目的菌株處理工業污水時，需要適當向污水中投放少量淀粉，據圖分析這樣做的主要目的是_______________________________________
_____________________________________________________________________。
(5)為計數微生物的數量，一位同學在4個平板培養基上分別接種稀釋倍數為106的土壤樣液0.1 mL，培養后菌落數分別為155、160、176、149個，則每毫升原土壤樣液中上述微生物數量為________。
[解析]　(1)BTB培養基滅菌后待平板凝固，應倒置放在超凈臺上，這樣做的目的是防止皿蓋上的水珠落入培養基，同時也能避免培養基中的水分過快的揮發。(2)利用稀釋涂布平板法純化菌株時，接種工具是涂布器，根據反硝化過程的產物可知，反硝化細菌能在無氧環境中將硝酸鹽轉化為氮氣，為了篩選出耐高溫的反硝化細菌，需要將接種后的平板放在無氧、42 ℃環境中培養2～3天，反應過程中消耗培養基中的H＋，因此會導致菌落周圍呈弱堿性，菌落周圍培養基呈藍色。故需要挑選顯藍色的單菌落在固體培養基上劃線分離，獲得純菌株。(3)因為其他微生物也能利用硝酸鹽進行代謝，硝酸鹽濃度同樣會降低，因此不能用硝酸鹽降低作為檢測指標，而應該用反硝化作用的最終產物N2O作為檢測指標。(4)結合實驗數據可知，C/N影響目的菌對硝酸鹽的去除率且隨著該比值的增大，能提高對污水中硝酸鹽的去除率，實驗結果顯示在C/N＝7時效果最好，因此在利用目的菌株處理工業污水時，向污水中投放少量淀粉的目的是適當提高污水中的C/N，從而提高目的菌對污水中硝酸鹽的去除率。(5)由實驗數據推知每毫升原土壤樣液中上述微生物數量為(155＋160＋176＋149)÷4÷0.1×106＝1.6×109個。
[答案]　(1)防止皿蓋上的水珠落入培養基，避免培養基中的水分過快的揮發　(2)涂布器　無氧、42 ℃　藍　(3)其他微生物也能利用硝酸鹽進行代謝，硝酸鹽濃度同樣會降低　(4)適當提高污水中的C/N，從而提高目的菌對污水中硝酸鹽的去除率　(5)1.6×109
1．核心概念
(1)(選擇性必修3 P9)培養基：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。
(2)(選擇性必修3 P10)消毒：是指使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部一部分微生物。
(3)(選擇性必修3 P10)滅菌：是指使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
(4)(選擇性必修3 P12)菌落：分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體?！?5)(選擇性必修3 P16)選擇培養基：在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基。
2．結論語句
(1)(選擇性必修3 P16)土壤中的某些細菌能分解尿素，是因為它們能合成脲酶，脲酶催化尿素分解產生NH3，NH3可作為細菌生長的氮源。
(2)(選擇性必修3 P18)當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，統計的菌落數往往比活菌的實際數目少。
(3)(選擇性必修3 P18)同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數，然后求出平均值。
1．(2021·北京等級考)人體皮膚表面存在著多種微生物，某同學擬從中分離出葡萄球菌。下述操作不正確的是(　　)
A．對配制的培養基進行高壓蒸汽滅菌
B．使用無菌棉拭子從皮膚表面取樣
C．用取樣后的棉拭子在固體培養基上涂布
D．觀察菌落的形態和顏色等進行初步判斷
C　[為避免雜菌污染的干擾，需對配制的培養基進行高壓蒸汽滅菌，A正確；葡萄球菌需從人體皮膚的微生物中分離，為避免雜菌污染，故需要使用無菌棉拭子從皮膚表面取樣，B正確；棉拭子上的微生物需要用平板劃線法在培養基上進行接種，C錯誤；根據微生物在固體平板培養基表面形成菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等特征進行鑒別，D正確。]
2．(2021·山東等級考)含硫蛋白質在某些微生物的作用下產生硫化氫導致生活污水發臭。硫化氫可以與硫酸亞鐵銨結合形成黑色沉淀。為探究發臭水體中甲、乙菌是否產生硫化氫及兩種菌的運動能力，用穿刺接種的方法，分別將兩種菌接種在含有硫酸亞鐵銨的培養基上進行培養，如圖所示。若兩種菌繁殖速度相等，下列說法錯誤的是(　　)
A．乙菌的運動能力比甲菌強
B．為不影響菌的運動需選用液體培養基
C．該實驗不能比較出兩種菌產生硫化氫的量
D．穿刺接種等接種技術的核心是防止雜菌的污染
B　[從圖中可以看出甲菌在試管中分布范圍小于乙菌，說明了乙菌的運動能力比甲菌強，A正確；實驗所用培養基應為固體培養基，B錯誤；該實驗可以根據黑色沉淀的多少初步比較細菌產生硫化氫的能力，但不能測定產生硫化氫的量，C正確；微生物接種技術的核心是防止雜菌的污染，D正確。]
3．(2020·江蘇高考)為純化菌種，在鑒別培養基上劃線接種纖維素分解菌，培養結果如圖所示。下列敘述正確的是(　　)
A．倒平板后需間歇晃動，以保證表面平整
B．圖中Ⅰ、Ⅱ區的細菌數量均太多，應從Ⅲ區挑取單菌落
C．該實驗結果因單菌落太多，不能達到菌種純化的目的
D．菌落周圍的纖維素被降解后，可被剛果紅染成紅色
B　[倒平板后無須間歇晃動，A錯誤；圖中Ⅰ區、Ⅱ區的細菌數量太多，Ⅲ區的細菌數量較少，可從Ⅲ區挑取單菌落，B正確；Ⅲ區中存在單菌落，該實驗結果能達到菌種純化的目的，C錯誤；剛果紅能與纖維素形成紅色復合物，但不能和纖維素水解后的纖維二糖、葡萄糖等形成紅色復合物，因此菌落周圍的纖維素被降解后，不能被剛果紅染成紅色，D錯誤。]
4．(2022·全國甲卷)某同學從被石油污染的土壤中分離得到A和B兩株可以降解石油的細菌，在此基礎上采用平板培養法比較二者降解石油的能力，并分析兩個菌株的其他生理功能。
實驗所用的培養基成分如下。
培養基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。
培養基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。
操作步驟：
①將A、B菌株分別接種在兩瓶液體培養基Ⅰ中培養，得到A、B菌液；
②液體培養基Ⅰ、Ⅱ中添加瓊脂，分別制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按圖中所示在平板上打甲、乙兩孔。
回答下列問題。
(1)實驗所用培養基中作為碳源的成分是________。培養基中NH4NO3的作用是為菌株的生長提供氮源，氮源在菌體內可以參與合成__________________________(答出兩種即可)等生物大分子。
(2)步驟①中，在資源和空間不受限制的階段，若最初接種N0個A細菌，繁殖n代后細菌的數量是________。
(3)為了比較A、B降解石油的能力，某同學利用步驟②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ進行實驗，結果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示無透明圈)，推測該同學的實驗思路是________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)現有一貧氮且被石油污染的土壤，根據上表所示實驗結果，治理石油污染應選用的菌株是________，理由是________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)培養基的成分有碳源、氮源、無機鹽和水等，從組成培養基的物質所含化學元素可知，作為碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白質都含有N，故氮源在菌體內可以參與合成這些物質。(2)由題意“資源和空間不受限制”可知，細菌的增殖呈“J”形曲線增長，若最初接種N0個A細菌，繁殖n代后A細菌的數量是N0·2n。(3)分析表格數據可知，實驗的結果是在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根據實驗的單一變量和對照原則，推測該同學的思路是在無菌條件下，將等量等濃度的A菌液和B菌液分別接種到平板Ⅰ的甲和乙兩孔處，平板Ⅱ也進行同樣的操作，在相同且適宜條件下培養一段時間，比較兩個平板的兩孔處的透明圈大小并作記錄，根據透明圈大降解能力強，透明圈小降解能力弱，進而比較A、B降解石油的能力。(4)在平板Ⅱ(無氮源的培養基)上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理貧氮且被石油污染的土壤，應該選用A菌株，因為A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在沒有添加氮源的培養基中也能生長。
[答案]　(1)石油　DNA、RNA、蛋白質　(2)N0·2n　(3)在無菌條件下，將等量等濃度的A菌液和B菌液分別接種到平板Ⅰ的甲和乙兩孔處，平板Ⅱ也進行同樣的操作，在相同且適宜條件下培養一段時間，比較兩個平板的兩孔處的透明圈大小并作記錄，根據透明圈大降解能力強，透明圈小降解能力弱，進而比較A、B降解石油的能力　(4)A菌株　A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在沒有添加氮源的培養基中也能生長
(教師用書獨具)
(2020·全國卷Ⅰ)某種物質S(一種含有C、H、N的有機物)難以降解，會對環境造成污染，只有某些細菌能降解S。研究人員按照如圖所示流程從淤泥中分離得到能高效降解S的細菌菌株。實驗過程中需要甲、乙兩種培養基，甲的組分為無機鹽、水和S，乙的組分為無機鹽、水、S和Y。
無菌水　甲　 　乙　　　　甲
請回答下列問題：
(1)實驗時，盛有水或培養基的搖瓶通常采用____________的方法進行滅菌。乙培養基中的Y物質是________。甲、乙培養基均屬于________培養基。
(2)實驗中初步估測搖瓶M中細菌細胞數為2×107個/mL，若要在每個平板上涂布100 μL稀釋后的菌液，且保證每個平板上長出的菌落數不超過200個，則至少應將搖瓶M中的菌液稀釋________倍。
(3)在步驟⑤的篩選過程中，發現當培養基中的S超過某一濃度時，某菌株對S的降解量反而下降，其原因可能是_______________(答出一點即可)。
(4)若要測定淤泥中能降解S的細菌細胞數，請寫出主要實驗步驟：____________
_____________________________________________________________________。
(5)上述實驗中，甲、乙兩種培養基所含有的組分雖然不同，但都能為細菌的生長提供4類營養物質，即________________。
[解析]　(1)實驗過程中，對盛有水或培養基的搖瓶進行滅菌時，常采用高壓蒸汽滅菌法。據題圖分析可知，乙培養基為固體培養基，與甲培養基相比，其特有的組分Y物質應是凝固劑瓊脂。甲、乙培養基均只允許能利用物質S作為氮源和碳源的微生物生長，因此均為選擇培養基。(2)據題意，假設至少將搖瓶M中的菌液稀釋X倍，才能保證稀釋后的100 μL菌液中細菌細胞數不超過200個，初步估測搖瓶M中細菌細胞數為2×107個/mL，則稀釋之前100 μL菌液中有2×106個細菌，可得2×106×(1/X)＝200，則X＝104，因此至少應將搖瓶M中的菌液稀釋104倍。(3)在篩選過程中，若培養基中S濃度過高，可能會導致細胞失水，進而抑制菌株的生長。(4)將含有能降解S的細菌的淤泥加入無菌水中，進行適當稀釋后，取適量的菌液，利用稀釋涂布平板法涂布到乙培養基上，在適宜條件下進行培養，一段時間后，統計菌落數，即可估算出淤泥中能降解S的細菌細胞數。(5)本實驗中，甲、乙兩種培養基所含有的組分雖然不同，但都能為細菌的生長提供的營養物質是水、碳源、氮源和無機鹽。
[答案]　(1)高壓蒸汽滅菌　瓊脂　選擇　(2)104　(3)S的濃度超過某一值時會抑制菌株的生長　(4)取淤泥加入無菌水中，涂布(或稀釋涂布)到乙培養基上，培養后計數　(5)水、碳源、氮源和無機鹽
課時分層作業(三十五)　微生物的培養技術及應用
1．(2022·遼寧沈陽二模)下列關于無菌操作的敘述，錯誤的是(　　)
A．倒平板和接種操作都需在酒精燈火焰旁進行，以防雜菌污染
B．用劃線法接種時，如果有五個劃線區域，則接種環至少灼燒五次
C．適當噴灑石炭酸或煤酚皂溶液，再用紫外線照射可加強消毒效果
D．高壓蒸汽滅菌時，需要用棉塞塞住盛有培養基的錐形瓶口并包上牛皮紙
B　[酒精燈火焰旁存在無菌區，倒平板和接種操作都要在酒精燈火焰旁進行，以防雜菌污染，A正確；用劃線法接種時，接種及劃線前后都要灼燒接種環，因此接種環灼燒次數比劃線次數多1次，B錯誤；適當噴灑石炭酸或煤酚皂溶液，再用紫外線照射可加強消毒效果，C正確；培養基通常采用高壓蒸汽滅菌，滅菌前需要用棉塞塞住錐形瓶口，包上牛皮紙，用皮筋勒緊，D正確。]
2．(2022·山東淄博一模)下列有關培養基的敘述正確的是(　　)
A．篩選、培養硝化細菌的培養基中不能加入氮源
B．固體培養基中的瓊脂能為微生物生長提供碳源
C．在進行微生物的富集培養時常選用液體培養基
D．培養基中加入剛果紅可用于尿素分解菌的鑒定
C　[硝化細菌屬于化能合成型自養微生物，因此制備培養硝化細菌的培養基不需要添加碳源，但需要添加氮源，A錯誤；固體培養基中的瓊脂只是作為凝固劑，不能為微生物生長提供碳源，B錯誤；液體培養基可以增大菌體與培養基的接觸面積，為菌株的生長和繁殖提供更多的營養和空間，所以在進行微生物的富集培養時常選用液體培養基，C正確；培養基中加入剛果紅可用于纖維素分解菌的鑒定，D錯誤。]
3．(2022·海南等級考)為探究校內植物園土壤中的細菌種類，某興趣小組采集園內土壤樣本并開展相關實驗。下列有關敘述錯誤的是(　　)
A．采樣時應隨機采集植物園中多個不同地點的土壤樣本
B．培養細菌時，可選用牛肉膏蛋白胨固體培養基
C．土壤溶液稀釋倍數越低，越容易得到單菌落
D．鑒定細菌種類時，除形態學鑒定外，還可借助生物化學的方法
C　[采集植物園中土壤樣本的原則之一是要隨機采樣，A正確；牛肉膏蛋白胨固體培養基中含有細菌生長所需的碳源、氮源、水、無機鹽等，可用于細菌的培養，B 正確；土壤溶液稀釋倍數足夠高時，才能將聚集的細菌分散開，有助于在培養基表面形成單菌落，C錯誤；不同種類細菌的理化特性一般不同，鑒定細菌種類時，除根據菌落特征進行形態學鑒定外，還可以借助生物化學的方法進行鑒定，D正確。]
4．(2022·湖北襄陽三模)聚羥基脂肪酸酯(PHA)是由嗜鹽細菌合成的一種胞內聚酯，它具有類似于合成塑料的理化特性，且廢棄后易被生物降解，可用于制造無污染的“綠色塑料”?？茖W家從某咸水湖中獲得生產PHA含量高的菌種流程如下：①取湖水→②接種在培養基上→③培養→④挑取單菌落，分別擴大培養→⑤檢測菌體的數目和PHA的產量→⑥獲得目標菌株。下列敘述正確的是(　　)
A．②可用稀釋涂布平板法接種到含PHA較高的選擇培養基上
B．④挑取菌落時，應挑取多個菌落以便于篩選PHA產量高的嗜鹽細菌
C．擴大培養時，需要將接種后的培養基放入恒溫箱倒置培養，以防雜菌污染
D．⑤中用顯微鏡直接計數法檢測菌體的數目所得數值低于實際值
B　[嗜鹽細菌能生產PHA，從咸水湖中尋找生產PHA的菌種，步驟②可用稀釋涂布平板法接種到含鹽量較高的選擇培養基上，而不是接種到含PHA較高的選擇培養基上，A錯誤；④挑取菌落時，應挑取多個菌落并分別測定嗜鹽細菌的PHA含量，以便于篩選PHA產量高的嗜鹽細菌，B正確；擴大培養常采用液體培養基，不需要倒置培養，C錯誤；顯微鏡直接計數法不能區分死菌和活菌，因此⑤中用顯微鏡直接計數法檢測菌體的數目所得數值高于實際值，D錯誤。]
5．(2022·山東濰坊一模)金黃色葡萄球菌是一種常見的病原菌，在血平板(完全培養基中添加適量血液)上生長時，可破壞菌落周圍的紅細胞，使其褪色。某研究小組通過稀釋涂布平板法測定了某處土壤中金黃色葡萄球菌數量，相關說法不正確的是(　　)
A．從功能上分類，血平板屬于選擇培養基
B．在制作血平板時需要在平板冷卻后加入血液，防止高溫破壞血細胞
C．待涂布的菌液被培養基吸收后應倒置培養，防止水分過度蒸發
D．實驗統計的菌落數往往比活菌的實際數目低
A　[據題干信息“金黃色葡萄球菌是一種常見的病原菌，在血平板(完全培養基中添加適量血液)上生長時，可破壞菌落周圍的紅細胞，使其褪色”，因此血平板屬于鑒別培養基，A錯誤；為防止高溫破壞血細胞，在制作血平板時需要在平板冷卻后加入血液，B正確；涂布后的平板待菌液被培養基吸收后應倒置培養，防止水分過度蒸發，C正確；由于兩個或多個菌落連在一起形成一個菌落，所以統計的菌落數比活菌的實際數目低，D正確。]
6．(2022·江蘇蘇州模擬預測)新疆的“生命營養液”是以多種天然食材為原料發酵而成。為從中分離到紅曲菌(真菌)，現用無菌水將其稀釋成濃度為10-1 g/mL、10-2 g/mL、10-3 g/mL的懸液，分別取0.1 mL稀釋液涂布于含有氯霉素和四環素的PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)平板上，制備3個平行組。然后將PDA平板置于恒溫培養箱培養，并連續7天統計平板上的菌落數。下列敘述正確的是(　　)
A．制備PDA培養基時，先高壓蒸汽滅菌再調節pH
B．計數時平板上菌落過于密集，可多做幾組平行組進行實驗統計
C．恒溫培養前，需在培養皿底部標明組別、培養日期和稀釋度等
D．可大幅度提高“生命營養液”中氯霉素和四環素含量以抑制雜菌
C　[制備PDA培養基時，要先調節pH再高壓蒸汽滅菌，防止調節pH過程中受雜菌污染，A錯誤；計數時平板上菌落過于密集，可稀釋之后再進行計數，B錯誤；恒溫培養前，需在培養皿底部標明組別、培養日期和稀釋度等，便于進行實驗統計和對比觀察，C正確；氯霉素和四環素是針對細菌起作用的抗生素，且大幅度提高“生命營養液”中氯霉素和四環素含量會導致培養液滲透壓升高，也會抑制紅曲菌生長，D錯誤。]
7．(2023·廣東東莞檢測)我國科學家發現了一種來自密閉油藏的新型產甲烷古菌，其可直接將液態原油降解成氣態甲烷。下列敘述錯誤的是(　　)
A．密閉油藏中的新型產甲烷古菌屬于厭氧型微生物
B．用液態原油配制成的培養基可分離新型產甲烷古菌
C．宜選用液體培養基對新型產甲烷古菌進行擴大培養
D．平板劃線法和稀釋涂布平板法均可用于該菌的計數
D　[結合題意可知，新型產甲烷古菌來自密閉油藏，故推測其屬于厭氧型微生物，A正確；由于新型產甲烷古菌是在油藏中發現的，說明其能夠利用液態原油，故用液態原油配制成的培養基可分離新型產甲烷古菌，且為保證其純度，宜選用液體培養基對新型產甲烷古菌進行擴大培養，B、C正確；平板劃線法不能用于菌種的計數，D錯誤。]
8．(2023·廣東佛山調研)下圖為微生物的實驗室培養的有關操作，相關敘述錯誤的是(　　)
　　　?、劢臃N
A．步驟①中，需將接種工具灼燒至變紅，以殺滅雜菌
B 步驟②中，將接種工具冷卻時不宜距酒精燈火焰太遠
C．圖中接種方法的目的是使菌種逐漸稀釋，經培養后獲得單個菌落
D．接種后應將培養皿倒置培養，培養后可以根據結果進行微生物計數
D　[圖1步驟①中，接種前灼燒接種環至變紅，目的是殺滅接種環上可能引起污染的微生物，A正確；步驟②中，將接種工具冷卻時不宜距酒精燈火焰太遠，防止受到雜菌污染，B正確；所示的接種方法是平板劃線法，目的是使接種的菌種逐漸稀釋，經培養后獲得由單個細菌繁殖而來的菌落，C正確；圖示的平板劃線法不能用于微生物的計數，D錯誤。]
9．(2022·廣東廣州模擬)在我們的日常生活中會產生大量的廚余垃圾，廚余垃圾極容易腐爛形成臭味和滋生大量的病菌，還會污染環境。研究人員設想將垃圾轉變成良好的肥料，需要從廚余垃圾中分離純化出高效分解垃圾的微生物?；卮鹣铝袉栴}：
(1)分離純化高效分解垃圾的微生物需要配制培養基，培養基的營養成分主要包括____________________等，對配制好的培養基常采用__________________法進行滅菌。滅菌是指使用強烈的理化方法殺死______________________，包括芽孢和孢子。
(2)純化分解垃圾的微生物的技術流程為樣品采集→梯度稀釋→分離純化→鑒別培養→菌種鑒定，該過程利用了________________法進行菌株的分離純化。接種后進行培養時，培養皿皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的濕度也比較高，因此，需要將培養皿倒置，原因是_____________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
若整個實驗過程中沒有受到雜菌污染，但培養基上卻出現了多種特征的菌落，這說明____________________________________。
(3)為估算樣液中的細菌數目，通過菌落計數后發現，稀釋倍數高的一組估算結果往往________(填“大于”“小于”或“等于”)稀釋倍數低的一組。將分離純化出的高效分解垃圾的3種微生物制成菌劑，為測定這3種菌劑對廚余垃圾的實際降解能力，實驗思路是：①將纖維素、淀粉、脂肪、蛋白質和水等，按照廚余垃圾的組分比例配制培養基；②將等量的3種菌劑分別與等量的培養基置于適宜的環境中進行混合培養；③________________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)培養基的營養成分主要包括碳源、氮源、水和無機鹽。對培養基需要采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌。滅菌是指使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。(2)純化分解垃圾的微生物的技術流程為樣品采集→梯度稀釋→分離純化→鑒別培養→菌種鑒定，該過程需要將培養液稀釋后再接種，因此采用的是稀釋涂布平板法接種。將培養皿倒置既可以防止皿蓋上的水珠落入培養基上造成污染，又可以避免培養基表面的水分過快地揮發。不同菌體形成的菌落特征不同，若整個實驗過程中沒有受到雜菌污染，但培養基上卻出現了多種特征的菌落，這說明有多種微生物都能分解廚余垃圾。(3)因為稀釋倍數低的樣液中菌體的數量太多而使得在涂布時更容易出現兩個或多個細胞連在一起形成一個菌落的情況，從而導致菌落計數偏低，而稀釋倍數高的菌液中由于菌體數目少，在涂布時，出現兩個或多個細胞連在一起形成一個菌落的情況的機會更少，因此，稀釋倍數低的組計算結果往往比稀釋倍數高的組計算結果略低。實驗目的是測定這3種菌劑對廚余垃圾的實際降解能力，因此因變量為培養基中各種成分的減少量，故實驗的最后一步應為：培養相同時間后，測定各組培養基中各種成分的減少量(或各組培養基中各種成分的剩余量)。
[答案]　(1)碳源、氮源、水和無機鹽　高壓蒸汽滅菌　物體內外所有的微生物　(2)稀釋涂布平板　將培養皿倒置既可以防止皿蓋上的水珠落入培養基上造成污染，又可以避免培養基表面的水分過快地揮發　多種微生物都能分解廚余垃圾　(3)大于　培養相同時間后，測定各組培養基中各種成分的減少量(或各組培養基中各種成分的剩余量)
10．(2023·廣東惠州檢測)處理生活垃圾的有效方法之一是用微生物對其進行降解。下圖表示篩選高效降解淀粉菌種的過程。相關分析正確的是(　　)
A．篩選所用培養基中的碳源應為牛肉膏和蛋白胨
B．將菌液接種到培養皿的方法是平板劃線法
C．菌落①與菌落②透明圈大小不同的原因是其對碘的分解能力不同
D．擴大培養時用不加瓊脂的液體培養基效果更好
D　[篩選所用培養基應以淀粉作為唯一的碳源，這樣才能將降解淀粉的菌種篩選出來，A錯誤；由培養皿上的單個菌落可知，將菌液接種到培養皿的方法是稀釋涂布平板法，B錯誤；由于培養基中的唯一碳源是淀粉，而淀粉遇碘液會變藍，故菌落①與②周圍透明圈的大小不同的原因可能是兩個菌群對淀粉的分解能力不同，C錯誤；液體培養基可增大溶氧量，也能增加菌種與營養物質的接觸面積，故擴大培養時用不加瓊脂的液體培養基效果更好，D正確。]
11．(2022·江蘇連云港模擬預測)利用黃粉蟲腸道微生物對白色污染物進行生物降解，是一種綠色環保的處理工藝。圖示是從黃粉蟲腸道中分離、純化微生物的過程，下列說法正確的是(　　)
A．配制固體培養基時，不需要在無菌的環境中進行
B．平板劃線用的菌濃度應控制在300～3 000個/mL
C．平板上長出的菌落一定是分解PVC塑料的微生物形成的
D．在富集培養的培養基中含有牛肉膏和瓊脂等成分
A　[配制固體培養基時，不需要在無菌的環境中進行，因為培養基配制好之后要進行高壓蒸汽滅菌，A正確；在涂布時吸取的菌液不超過0.1 mL，平板上的菌落數應介于30～300個，涂布用的菌濃度應控制在300～3 000個/mL，平板劃線法不能計數，對于平板劃線用的菌濃度沒有嚴格要求，B錯誤；在培養過程中如果某個環節操作不當，平板上就有可能會混有其他微生物生長出的菌落，C錯誤；富集培養時采用的是液體培養基，液體培養基中不含瓊脂，D錯誤。]
12．(2022·河北唐山三模)二氯喹啉酸(QNC)是一種高選擇性、激素類、低毒性除草劑，主要用于防治稻田稗草，持效期長，易于在土壤中積累而影響后茬作物的生長發育。某科研小組欲分離篩選出一株可降解除草劑QNC的菌株，鑒定并明確其降解特性，分離、培養流程如圖a所示，回答下列問題：
圖a
(1)在無機鹽液體培養基中篩選降解菌株，需要以___________為唯一碳源。在培養中需要振蕩處理，目的是
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)不同的微生物培養形成的菌落表現出不同的特征，可通過微生物的菌落特征來鑒定微生物，這些菌落特征包括______________________(答出兩點即可)等。通過分離篩選得到一株能有效降解QNC的菌株15#，對培養的菌株15#進行計數時，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養，其目的是____________________________________。統計獲得的菌落數比實際的活菌數少，原因是______________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)為確定菌株15#的最適培養條件，科研人員探究接種量和不同氮源等因素對菌株15#降解QNC的影響，實驗結果如圖b、圖c所示。
外源氮對QNC降解效率的影響(%)
圖b
接種量對QNC降解效率的影響(%)
圖c
①分析圖b可以得出的結論有__________________________________________
_____________________________________________________________________(答出兩點即可)。
②分析圖c可知，菌株15#降解QNC效果最好的接種量為7%，當超過該接種量時，降解率呈下降趨勢，原因可能是___________________________________
_____________________________________________________________________。
[解析]　(1)因為該科研小組欲分離篩選出一株可降解除草劑QNC的菌株，因此在無機鹽液體培養基中篩選降解菌株，需要以QNC為唯一碳源。在培養中需要振蕩處理，一方面使菌體與培養液充分接觸，利于菌體獲得更多的營養物質，另一方面使菌體與空氣充分接觸，有利于菌體的生長。(2)可根據菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等特征來鑒定微生物。對培養的菌株15#進行計數時，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養，可知采用的計數方法是稀釋涂布平板法，稀釋的目的是確保獲得菌落數在30～300之間、適于計數的平板。用稀釋涂布平板法計數時，當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，故統計獲得的菌落數比實際的活菌數少。(3)①圖b中，尿素、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨是不同的氮源，由圖可知，不同氮源對菌株15#降解QNC的影響不同；以蛋白胨為氮源時，菌株15#降解QNC的效果最好；不同氮源對菌株15#降解QNC的促進作用順序為：蛋白胨>硝酸銨>氯化銨>尿素>硫酸銨。②超過該接種量時，即種群中的個體數過多，則菌體間的種內競爭激烈，導致營養物質不足，影響QNC降解率。
[答案]　(1)除草劑QNC　使菌體與培養液、空氣充分接觸，利于菌體獲得更多的營養物質　(2)菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色　確保獲得菌落數在30～300之間、適于計數的平板　當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落　(3)①不同氮源對菌株15#降解QNC的影響不同；以蛋白胨為氮源時，菌株15#降解QNC 的效果最好；不同氮源對菌株15#降解QNC的促進作用順序為：蛋白胨>硝酸銨>氯化銨>尿素>硫酸銨　②菌體間的種內競爭導致營養物質不足，影響QNC降解率
(教師用書獨具)
1．(2022·山東濟南二模)腸道菌群與人體健康存在密切關系，實驗室常用硫乙醇酸鹽流體培養基培養腸道菌群。硫乙醇酸鹽流體培養基的主要成分包括胰酪蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、氯化鈉、L 胱氨酸、硫乙醇酸鈉、瓊脂、刃天青等，其中L 胱氨酸、硫乙醇酸鈉和葡萄糖均可防止因過氧化物的積累而對厭氧細菌產生毒害。培養基的上層、中層、下層部位可以分別提供有氧、弱氧至無氧的梯度環境。下列說法錯誤的是(　　)
A．厭氧細菌、兼性厭氧細菌和好氧細菌均可在硫乙醇酸鹽流體培養基中生長
B．瓊脂可以防止液體流動，減少二氧化碳和氧氣擴散，有利于厭氧環境的形成
C．胰酪蛋白胨可為厭氧細菌提供氮源以及合成蛋白質必需的各種氨基酸
D．硫乙醇酸鹽流體培養基需經高壓蒸汽滅菌后使用，接種工作應在超凈工作臺內完成
C　[培養基的上層、中層、下層部位可以分別提供有氧、弱氧至無氧的梯度環境，故厭氧細菌、兼性厭氧細菌和好氧細菌均可在硫乙醇酸鹽流體培養基中生長，A正確；培養基中加入瓊脂可以防止液體流動，從而減少二氧化碳和氧氣擴散，有利于厭氧環境的形成，B正確；胰酪蛋白胨可為厭氧細菌提供氮源，但不能提供合成蛋白質必需的各種氨基酸，C錯誤；培養基使用高壓蒸汽滅菌，接種操作應在超凈工作臺內完成，D正確。]
2．(2022·河北石家莊模擬)苧麻的蛋白質含量高，年生物產量大，是畜牧業植物蛋白質飼料的重要來源。但苧麻含有大量木質纖維素，動物消化吸收困難。黑曲霉為真菌，在發酵過程中能產生纖維素酶、木質素降解酶等多種酶。為探究黑曲霉菌液對青貯料(苧麻與麥麩)進行混合發酵后營養成分、木質纖維素降解效果的影響，并尋求黑曲霉菌液最佳添加量?？蒲腥藛T做了如下實驗并得到相關結果：
對照CK 處理Ⅰ 處理Ⅱ 處理Ⅲ 處理Ⅳ
可溶性碳水化合物含量% 3.14 3.38 3.38 3.25 3.21
中性洗滌纖維含量% 41.95 37.49 34.47 34.42 34.85
酸性洗滌纖維含量% 22.38 18.90 17.78 17.83 17.84
酸性洗滌木質素含量% 16.85 15.04 14.48 14.92 14.56
注：CK：每千克青貯料中添加200 mL無菌水；
處理Ⅰ：每千克青貯料中添加50 mL黑曲霉菌液＋150 mL無菌水；
處理Ⅱ：每千克青貯料中添加100 mL黑曲霉菌液＋100 mL無菌水；
處理Ⅲ：每千克青貯料中添加150 mL黑曲霉菌液＋50 mL無菌水；
處理Ⅳ：每千克青貯料中添加200 mL黑曲霉菌液。
回答下列問題：
(1)纖維素酶可以把植物細胞壁的纖維素分解為____________________，從而降低青貯料中纖維素的含量。
(2)黑曲霉的PDA液體產酶培養基組成為：麩皮，豆粉餅，(NH4)2SO4，KH2PO4，MgSO4·7H2O；培養時需要通氣振蕩，由此可知黑曲霉的代謝類型為__________；豆粉餅可提供黑曲霉生長所需的________；若要分離高產纖維素酶的黑曲霉菌落，上述培養基中還需要添加________，且在培養基滅菌前將pH調至________(填“酸性”“中性”或“弱堿性”)。
(3)研究結果表明添加黑曲霉菌液可以有效改良青貯料的品質，理由是______
_____________________________________________________________________；
其中黑曲霉菌液最佳添加量為每千克青貯料中添加________mL黑曲霉菌液。
(4)上述實驗中所用黑曲霉菌液濃度的計數方法為：用多層紗布過濾黑曲霉培養液得到孢子懸浮液，取1 mL用無菌水稀釋10倍，取0.1 mL稀釋液滴加至血細胞計數板計數，統計得到計數板中平均孢子數為56.8個，則黑曲霉培養液中孢子濃度為____________個·mL-1。
[解析]　(1)纖維素酶把纖維素分解成纖維二糖和葡萄糖。(2)由黑曲霉的PDA液體產酶培養基組成中含有麩皮和豆粉餅可知黑曲霉同化類型為異養型；由培養時需要通氣振蕩可知黑曲霉的異化作用為需氧型，因此代謝類型為異養需氧型。豆粉餅可提供黑曲霉生長所需的氮源和碳源。若要分離高產纖維素酶的黑曲霉菌落則需要固體培養基，需要在上述液體培養基中添加瓊脂。黑曲霉屬于霉菌，培養霉菌的培養基需要將pH調至酸性。(3)由表中信息可知，與對照組(不添加黑曲霉菌液)相比，添加黑曲霉菌液的處理組青貯料的可溶性碳水化合物含量均上升，纖維素和木質素的含量均下降，說明添加黑曲霉菌液可以分解纖維素和木質素，改良青貯料的品質。綜合考慮可溶性碳水化合物含量、中性洗滌纖維含量、酸性洗滌纖維含量、酸性洗滌木質素含量的變化，相比其他3組，處理Ⅱ組可溶性碳水化合物含量最高，該條件下中性洗滌纖維含量、酸性洗滌纖維含量、酸性洗滌木質素的總量最低(3種物質數量之和)，因此處理Ⅱ組為處理的最佳方案，由表中注解可知處理Ⅱ組的方案為每千克青貯料中添加100 mL黑曲霉菌液。(4)由題干信息中的計數方法可知：0.1 mL稀釋液滴加至血細胞計數板計數，統計得到計數板中平均孢子數為56.8個，因此黑曲霉培養液中孢子濃度為56.8×104×10個·mL-1，即5.68×106個·mL-1。
[答案]　(1)纖維二糖和葡萄糖　(2)異養需氧型　氮源和碳源　瓊脂　酸性　(3)與對照組相比，添加黑曲霉菌液的處理組青貯料的可溶性碳水化合物含量均上升，纖維素和木質素的含量均下降　100　(4)5.68×106
3．(2022·山東棗莊二模)自生固氮菌是土壤中能獨立進行固氮的細菌?？蒲腥藛T進行了土壤中自生固氮菌的分離和固氮能力測定的研究，部分實驗流程如圖。已知步驟④獲得的三個平板的菌落數分別為90、95、100，對照組平板為0。相關敘述正確的是(　　)
①　　 ②　 ?、邸　　?④　?、?br/>A．步驟②振蕩20 min的目的是擴大菌種數量，屬于選擇培養
B．步驟④使用接種環劃線接種，使用前需要灼燒滅菌
C．1 g土壤中平均自生固氮菌數約為9.5×106個
D．所用培養基應加入碳源、氮源、無機鹽、水和瓊脂
C　[步驟②需充分振蕩的主要目的是使土壤中的微生物充分釋放到無菌水中，A錯誤；由圖觀察可知，步驟④平板中的菌落分布均勻，故所用的接種工具是涂布器，接種方法是稀釋涂布平板法，B錯誤；菌落統計時應選擇菌落數為30～300之間的進行計數，故1 g土壤中平均自生固氮菌數約為(90＋95＋100)/3÷0.1×104＝9.5×106個，C正確；本實驗需要分離自生固氮菌，自生固氮菌可以利用空氣中的氮氣作為氮源，故所用培養基中不能加入氮源，D錯誤。]
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