資源簡介

第2節　基因工程的基本操作程序
新課程標準 核心素養
1．闡明基因工程的原理和基本操作程序。2．針對人類生產或生活中的某一需求，選取適當的基因工程的技術和方法，嘗試設計獲得某一轉基因產品的方案。3．嘗試進行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產物。 1．科學思維——結合生產實例，舉例說出基因工程的基本操作程序。2．科學探究——針對人類生產和生活的某一需求，嘗試提出初步的基因工程構想，完成初步設計。
知識導圖
必備知識·夯實雙基
一、目的基因的篩選與獲取
1．目的基因
(1)概念：用于改變__受體細胞性狀__或獲得__預期表達產物__等的基因。
(2)實例：培養轉基因抗蟲棉用到的目的基因是__Bt抗蟲蛋白基因__。
2．獲取方法
特別提醒：引物是依據目的基因的已知序列設計而成的，其提供3′端，以便DNA聚合酶催化單個脫氧核苷酸連接。
二、基因表達載體的構建
1．構建基因表達載體的目的
(1)使目的基因在受體細胞中__穩定存在__，并且可以__遺傳__給下一代。
(2)使目的基因能夠__表達__和發揮作用。
2．基因表達載體的組成[填圖]
3．基因表達載體的構建
首先用一定的__限制酶__切割載體，使它出現一個切口，然后用__同種__限制酶或__能產生相同末端__的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用__DNA連接酶__將目的基因片段拼接到載體的切口處。
三、將目的基因導入受體細胞
1．轉化：目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內__維持穩定__和__表達__的過程。
2．目的基因導入受體細胞的方法
(1)目的基因導入植物細胞
①花粉管通道法
Ⅰ．用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入__子房__中。
Ⅱ．在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借__花粉管通道__進入__胚囊__。
②農桿菌轉化法
Ⅰ．農桿菌的特點：農桿菌自然條件下侵染__雙子葉__植物和__裸子__植物；農桿菌的Ti質粒上的__T－DNA__能夠整合到所侵染細胞的__染色體DNA__上。
Ⅱ．轉化方法：將目的基因插入農桿菌__Ti質粒的T－DNA__中，讓農桿菌侵染植物細胞。
(2)目的基因導入動物細胞
①常用方法：__顯微注射__法。
②常用受體細胞：__受精卵__。
(3)目的基因導入微生物細胞
①方法：用__Ca2＋__處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，然后將重組表達載體導入其中。
②常用受體細胞：原核細胞(使用最廣泛的是大腸桿菌)。
四、目的基因的檢測與鑒定
1．分子水平檢測
(1)通過__PCR__等技術檢測受體細胞染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測目的基因是否轉錄出mRNA。
(2)從轉基因生物中提取蛋白質用相應的抗體進行__抗原—抗體__雜交，檢測目的基因是否翻譯成了蛋白質。
2．個體水平鑒定
包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性及抗性程度?；蚬こ坍a品需要與天然產品活性進行比較等。
五、DNA片段的擴增及電泳鑒定
1．實驗基礎
(1)PCR原理：利用了__DNA的熱變性__原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。
(2)電泳：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
(3)PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的__大小和構象__等有關。
2．實驗步驟
→用__微量移液器__在微量離心管內依次加入PCR反應體系配方中的各組分，并離心
↓
→設置好相關參數，將微量離心管放入__PCR儀__中進行反應
↓
→根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，并加入適量__核酸染料__混勻
↓
→將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，插入合適大小的梳子，以形成__加樣孔__，待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內
↓
→將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液(內含指示劑)的混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物)
↓
→接通電源，進行電泳。待指示劑前沿遷移接近__凝膠邊緣__時，停止電泳
↓
→
┃┃學霸記憶__■
1．基因工程的基本操作程序有：(1)目的基因的篩選與獲取；(2)基因表達載體的構建；(3)將目的基因導入受體細胞；(4)目的基因的檢測與鑒定。
2．PCR反應液中需要提供DNA模板、分別與兩條模板鏈結合的2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。
3．PCR反應中每次循環一般可分為變性、復性、延伸三步。
4．基因表達載體的構建是基因工程的核心，基因表達載體是載體的一種，除了目的基因外，它還必須有啟動子、終止子以及標記基因等。
5．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法和花粉管通道法。
6．將目的基因導入動物細胞常用顯微注射技術，導入微生物細胞常用感受態細胞法(Ca2＋處理法)。
7．分子水平的檢測：檢測目的基因是否插入受體細胞的DNA中；檢測目的基因是否轉錄出了mRNA；檢測目的基因是否翻譯出相應蛋白質。
8．目的基因的檢測與鑒定也可以在個體生物學水平進行鑒定。
┃┃活學巧練__■
1．從已知結構和功能清晰的基因中篩選目的基因是獲取目的基因的一種有效方法。(√)
2．Taq酶是用PCR儀對DNA分子擴增過程中常用的一種耐高溫的DNA連接酶。(×)
3．基因表達載體中啟動子是DNA聚合酶識別和結合的部位。(×)
4．將重組表達載體導入動物受精卵常用顯微注射法。(√)
5．轉基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定必須通過分子檢測才能達到目的。(×)
6．可通過PCR等技術檢測棉花的染色體上是否插入了Bt基因。(√)
思考：
1．PCR擴增目的基因時，復性溫度的設定是成敗的關鍵。復性溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對，復性溫度過低又會造成引物不能與DNA模板鏈的特定部位結合。復性溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，假設引物的長度相同，在GC含量高時，對復性溫度的設定有什么要求？說明理由。
提示：在引物的GC含量高時，設定的復性溫度要高一些。因為DNA分子中G—C之間有三個氫鍵，A—T之間有兩個氫鍵。
2．在利用PCR獲取和擴增目的基因時，從第幾輪循環才會產生完整的目的基因？
提示：第3輪
3．農桿菌轉化法是將目的基因導入雙子葉植物和裸子植物的一種方法，原因是雙子葉植物和裸子植物能夠產生一種吸引農桿菌的化學物質，而單子葉植物不能產生這種物質，能不能利用農桿菌轉化法將目的基因導入單子葉植物？說明原因。
提示：能，可從雙子葉植物中提取該化合物，再用該化合物處理單子葉植物細胞，然后就可用農桿菌轉化法將目的基因導入單子葉植物細胞。
4．將目的基因導入動物的受體細胞除了受精卵外，還可以選擇什么細胞？
提示：還可以將目的基因導入胚胎干細胞，因為胚胎干細胞也能發育成動物體。
課內探究·名師點睛
知識點?
目的基因的獲取
1．目的基因
用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因，主要是指編碼蛋白質的基因。
2．獲取方法
(1)從基因文庫中獲取。
(2)利用PCR技術擴增。
(3)通過化學方法人工合成。
3．PCR反應
(1)條件
①模板：DNA母鏈(目的基因所在的DNA片段)。
②酶：耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。
③兩種引物：分別與兩條模板鏈相結合。
④原料：四種脫氧核苷酸。
(2)過程
過程 說明 圖解
變性 溫度上升到90℃左右，雙鏈DNA解聚為單鏈
復性 溫度下降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合
延伸 溫度上升到72℃左右，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下從引物起始合成互補鏈，可使新鏈由5′端向3′端延伸
　　(3)結果
上述三步反應完成后，一個DNA分子就變成了兩個DNA分子，隨著重復次數的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反應過程都是在PCR擴增儀中完成的。
知識貼士
關于引物
①概念：引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物長度一般為20～30個核苷酸。
②作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，見下圖：
③
┃┃典例剖析__■
典例1　下列有關PCR技術的敘述，錯誤的是(　B　)
A．PCR技術的原理是DNA半保留復制
B．變性過程中破壞的是磷酸二酯鍵
C．復性過程中引物與DNA模板鏈的結合是依靠堿基互補配對原則完成的
D．延伸過程中需要耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸等，無需添加ATP
解析：PCR是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術，A正確；變性過程是目的基因DNA受熱變性后解聚為單鏈，破壞的是氫鍵，B錯誤；引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，復性過程中引物與DNA模板鏈的結合是依靠堿基互補配對原則完成的，C正確；延伸過程中需要模板DNA、四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶等，無需添加ATP，D正確。
┃┃變式訓練__■
1．用PCR擴增下面的DNA片段：
5′－GACCTGTGAATC……CATACGGGATTG－3′
3′－CTGGACACTTCG……GTATGCCCTAAC－5′
供選擇的引物有：①5′－GACCTGTGGAAGC－3′、②5′－CATACGGGATTG－3′、③5′－GTATGCCCTAAC－3′、④5′－CAATCCCGTATG－3′共四種，應選擇(　D　)
A．①②　 B．②③
C．③④　 D．①④
解析：用PCR擴增DNA片段的過程中，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3′端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5′端→3′端延伸的，故引物的堿基序列應與每條模板鏈5′端的一段核苷酸鏈的堿基序列相同，即應以模板鏈5′端的一段脫氧核苷酸單鏈片段作為引物；由題干信息分析可知，5′端的堿基序列是5′－GACCTGTGAATC和5′－CAATCCCGTATG，故對應的引物為①5′－GACCTGTGGAAGC－3′和④5′－CAATCCCGTATG－3′，故選D。
知識點?
基因表達載體的構建
1．目的
(1)使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代。
(2)使目的基因能夠表達和發揮作用。
2．地位：基因工程的核心步驟。
3．基因表達載體的組成
4．過程
知識貼士
啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子
(1)啟動子位于基因的上游，是RNA聚合酶識別和結合的部位，與終止子一樣都位于DNA片段上，分別控制轉錄過程的啟動和終止。
(2)起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。
┃┃典例剖析__■
典例2　在基因表達載體的構建中，下列說法不正確的是(　B　)
①一個基因表達載體的組成只包括目的基因、啟動子、終止子
②有了啟動子才能驅動基因轉錄出mRNA
③終止子的作用是使轉錄在所需要的地方停止
④所有基因表達載體的構建是完全相同的
⑤必須在細胞內進行
A．②③⑤ B．①④⑤
C．①②⑤ D．③④
解析：基因表達載體的構建是基因工程的核心內容，一個表達載體的組成，除了目的基因外，還有啟動子、終止子和標記基因等，①錯誤；啟動子是RNA聚合酶的結合位點，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，②正確；終止子控制著轉錄的結束，③正確；由于受體細胞有植物、動物以及微生物之分，以及目的基因導入受體細胞的方法不同，因此基因表達載體的構建是不完全相同的，④錯誤；基因表達載體的構建必須在細胞外進行，⑤錯誤。②③正確，①④⑤錯誤。故選B。
┃┃變式訓練__■
2．下圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內切核酸酶的酶切位點，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述正確的是(　D　)
A．圖甲中的質粒用BamHⅠ切割后，含有4個游離的磷酸基團
B．在構建重組質粒時，可用PstⅠ和BamHⅠ切割質粒和外源DNA
C．導入目的基因的大腸桿菌可在含氨芐青霉素的培養基中生長
D．用PstⅠ和HindⅢ酶切，可以保證重組DNA序列的唯一性
解析：圖甲中的質粒用BamHⅠ切割后，會打開一個切口，故有2個游離的磷酸基團，A錯誤；在構建重組質粒時，不能用BamHⅠ切割外源DNA，因為BamHⅠ會破壞目的基因，B錯誤；操作中獲取目的基因時會用到PstⅠ，但甲中該酶會破壞氨芐青霉素抗性基因，因此導入目的基因的大腸桿菌不能在含氨芐青霉素的培養基中生長，C錯誤；用PstⅠ和HindⅢ酶切，可以避免自身環化，保證重組DNA序列的唯一性，D正確。
知識點?
目的基因導入受體細胞
1．導入的方法
受體細胞類型 方法 說明 特點
植物細胞 農桿菌轉化法 將目的基因插入Ti質粒的T－DNA上→轉入農桿菌→導入植物細胞→插入植物細胞中的染色體DNA上→目的基因表達 經濟、有效，適合于雙子葉植物和裸子植物
花粉管通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞→目的基因表達 簡便、經濟，我國科學家獨創
動物細胞 顯微注射法 目的基因片段受精卵的核內→將受精卵移植到雌性動物的輸卵管或子宮內→使受精卵發育成轉基因動物 將目的基因導入動物細胞的最有效的方法
微生物細胞 Ca2＋處理法(感受態細胞法) Ca2＋處理微生物細胞→感受態細胞→將基因表達載體與感受態細胞混合在緩沖液中→在一定溫度下促進感受態細胞吸收DNA分子，完成轉化過程 簡便、經濟、有效
2．目的基因在受體細胞中的位置不同會引起遺傳上的差別
(1)圖中a細胞減數分裂時，細胞質是不均分的，子細胞不一定含有目的基因。
(2)圖中b在進行細胞減數分裂時，細胞核中的DNA經復制后平均分配到兩個子細胞中，保證了親子代遺傳性狀的穩定性，細胞中目的基因的遺傳特性得以穩定維持和表達。
知識貼士
在將目的基因導入受體細胞之前，都必須進行基因表達載體的構建，也就是說導入受體細胞的必須是重組DNA分子，而不是直接導入目的基因。
┃┃典例剖析__■
典例3　農桿菌轉化法轉移目的基因進入受體細胞后，目的基因插入的位置是(　B　)
A．Ti質粒上 B．受體細胞染色體DNA上
C．T－DNA D．農桿菌的擬核
解析：目的基因進入受體細胞后，要能正常表達，就必須插入受體細胞染色體DNA上。
┃┃變式訓練__■
3．下列有關將目的基因導入受體細胞的敘述，正確的是(　A　)
A．將目的基因導入植物細胞采用最多的方法是農桿菌轉化法
B．原核生物有繁殖快、遺傳物質少等特點，可用于生產各種有生物活性的蛋白質
C．基因槍法是將目的基因導入動物細胞中最為有效的方法
D．可將含有目的基因的植物病毒作為載體導入Ca2＋處理后的大腸桿菌細胞
解析：原核生物的細胞中沒有內質網和高爾基體，不能對蛋白質進行加工，故生產的蛋白質可能沒有生物活性；將目的基因導入動物細胞最常用的方法是顯微注射技術；植物病毒只侵染植物細胞。
知識點?
目的基因的檢測與鑒定
1．目的基因的檢測與鑒定
2．不同分子檢測原理的異同
(1)檢測目的基因是否插入受體DNA中、目的基因是否轉錄時，用的探針都是放射性同位素等標記的含有目的基因的DNA片段。檢測原理都是堿基互補配對原則，只是被檢測的物質不同，一個是轉基因生物的基因組DNA，一個是轉基因生物細胞內的mRNA。
(2)進行翻譯水平的檢測，通常以目的基因表達產物(蛋白質)作抗原，制備相應抗體，檢測轉基因生物的蛋白質，利用抗原與抗體特異性結合的原理。
(3)不論是復制水平、轉錄水平還是翻譯水平的檢測，都是在體外進行的。
知識貼士
基因工程操作過程中堿基互補配對現象
基因工程操作過程中只有第三步“將目的基因導入受體細胞”沒有堿基互補配對現象；第一步篩選與獲取目的基因，用人工合成、PCR獲取或基因文庫獲取，三種常用方法都涉及堿基互補配對；第二步基因表達載體的構建中DNA連接酶連接目的基因與質粒載體，第四步利用分子雜交的方法檢測(DNA、mRNA)，也都存在堿基互補配對現象。
┃┃典例剖析__■
典例4　轉基因抗蟲棉培育過程中，下列有關目的基因檢測與鑒定方法的敘述，錯誤的是(　A　)
A．檢測抗蟲基因是否導入——農桿菌轉化法
B．檢測抗蟲基因是否轉錄——PCR技術
C．檢測抗蟲基因是否翻譯——抗原—抗體雜交
D．檢測抗蟲蛋白生物功能——抗蟲接種實驗
解析：農桿菌轉化法是將抗蟲基因導入植物細胞的方法，不能用于檢測目的基因是否導入受體細胞，A錯誤；可用PCR技術檢測抗蟲基因是否轉錄出mRNA，B正確；檢測目的基因是否翻譯成蛋白質，常用抗原—抗體雜交，C正確；檢測抗蟲蛋白生物功能，可在個體水平上進行抗蟲接種實驗，D正確。
┃┃變式訓練__■
4．在判斷抗蟲基因是否成功轉入棉花基因組的方法中，不屬于分子檢測的是(　A　)
A．通過觀察害蟲吃棉葉是否死亡
B．檢測目的基因片段與DNA探針能否形成雜交帶
C．檢測目的基因轉錄形成的mRNA與DNA探針能否形成雜交帶
D．檢測目的基因表達產物蛋白質能否與特定抗體形成雜交帶
解析：A項屬于個體生物學水平的鑒定，不是分子檢測。B、C兩項為分子檢測，利用分子雜交技術，觀察目的基因及目的基因轉錄形成的mRNA能否與DNA探針進行雜交形成雜交帶；D項也為分子檢測內容，利用抗原—抗體雜交的原理，檢測基因表達產物能否與特定抗體形成雜交帶。
知識點?
DNA片段的擴增及電泳鑒定
1．實驗原理
(1)DNA片段的擴增：利用PCR可以在體外進行DNA片段的擴增。
(2)電泳：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
(3)電泳鑒定：PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。
2．操作步驟
(1)加樣：按照PCR反應體系的配方將所有組分加入微量離心管中，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管底部。
(2)反應：將微量離心管放入PCR儀中，設置程序進行反應(可參照下表內容進行設置)。
循環程序 變性 復性 延伸
預變性 94℃，5min / /
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
　　(3)制膠：根據待分離DNA片段的大小，制備瓊脂糖凝膠。一般配制質量體積比為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。制好的凝膠放入電泳槽中，加電泳緩沖液，以沒過凝膠1mm為宜。
(4)點樣：將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液(內含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。
(5)電泳：待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。
(6)觀察：取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
3．注意事項
(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
(2)PCR所用的緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
(3)在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
(4)在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
┃┃典例剖析__■
典例5　在基因工程操作中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理基因表達載體，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結果如圖所示。以下相關敘述錯誤的是(　D　)
A．該載體最可能為環形DNA分子
B．兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點
C．限制酶R1與R2的酶切位點最短相距約200bp
D．限制酶切割時會導致作用位點的氫鍵和肽鍵斷裂
解析：當僅用一種限制酶切割載體時，僅產生一種長度約為800bp的DNA片段，因此該載體最有可能為環狀DNA分子，A正確；兩種限制酶同時切割時則產生兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點，B正確；兩種限制酶同時切割時則產生長度約為600bp和200bp的兩種DNA片段，所以兩種限制酶的酶切位點最短相距約200bp，C正確；限制酶切割DNA分子，破壞的是作用位點的磷酸二酯鍵，D錯誤。
┃┃變式訓練__■
5．對禽流感的確診，先用PCR技術將標本基因大量擴增，然后利用基因探針，測知待測標本與探針核酸的堿基異同。如圖P表示禽流感病毒探針基因在凝膠的電泳標記位置，甲、乙、丙、丁是四份送檢樣品在測定后的電泳標記位置，哪份標本最有可能被確診為禽流感(　C　)
A．甲 B．乙
C．丙 D．丁
解析：據圖分析，圖中P表示禽流感病毒探針基因在凝膠的電泳標記位置，甲、乙、丙、丁是四份送檢樣品在測定后的電泳標記位置，其中丙的電泳位置與P最接近，因此最有可能被確診為禽流感。
指點迷津·撥云見日
一、細胞內DNA復制與PCR反應的比較
項目 體內DNA復制 PCR反應
不同點 時期 細胞有絲分裂間期和減數第一次分裂前的間期 體外隨時進行
場所 活細胞內 微量離心管內
酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
解旋 在解旋酶的作用下，細胞提供能量，部分解開 加熱至90℃以上時，雙鏈全部解開，不需解旋酶
引物 一小段RNA 可以是RNA或單鏈DNA分子片段
合成子鏈 在引物基礎上，一條鏈連續合成，另一條鏈不連續合成 分別從兩條鏈的引物端開始，都是連續合成，控制溫度在72℃左右
特點 邊解旋邊復制，半保留復制 體外迅速擴增
循環次數 受生物體自身控制 30多次
產物 完整DNA DNA片段
相同點 原料 4種脫氧核苷酸(A、G、C、T)
復制原理 嚴格遵循堿基互補配對原則，半保留復制
模板 以DNA母鏈為模板
引物 都需要分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物
┃┃典例剖析__■
典例6　PCR過程與細胞內的DNA復制過程相比，主要有兩點不同，它們是(　C　)
①PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA
②PCR過程不需要DNA聚合酶
③PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現的
④PCR過程中，DNA不需要解旋，直接以雙鏈DNA為模板進行復制
A．③④　 B．①②
C．①③　 D．②④
解析：PCR過程與細胞內的DNA復制過程相比較，主要有兩點不同：一是PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA，長度通常為20～30個核苷酸；二是PCR過程中，DNA解旋不依賴解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現的。
二、DNA分子雜交技術
(1)原理：堿基互補配對原則。
(2)基因探針：用放射性同位素或熒光物質標記的目的基因。
(3)檢測受體細胞是否含目的基因的具體過程：
┃┃典例剖析__■
典例7　下圖為DNA分子雜交技術的應用，請分析后判斷下圖中兩個物種親緣關系更近的是(　A　)
解析：雜合雙鏈區越長，說明兩物種DNA中堿基序列相似度越高，而物種間堿基序列相似度越高，則其親緣關系越近。通過分析比較可以看出物種甲和物種乙形成的雜合雙鏈區最長，故兩者的親緣關系最近。
解疑答惑
?從社會中來 P76
提示：轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是抗蟲基因(Bt基因)來源于蘇云金桿菌，Bt基因表達的蛋白質具有殺蟲活性。當害蟲食用轉基因抗蟲棉花的時候，同時攝入Bt基因產生的抗蟲蛋白，當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。培育轉基因抗蟲棉的步驟有目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建，將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。
?旁欄思考1 P79
提示：用PCR不能直接擴增mRNA，DNA聚合酶識別的是雙鏈DNA，mRNA為單鏈結構。應首先逆轉錄獲得cDNA才能進行PCR。
?旁欄思考2 P80
提示：有人采用總DNA注射法進行遺傳轉化，即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導入受體植物，沒有進行表達載體的構建，這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定什么基因導入了受體植物。
?到社會中去 P83
1．提示：這是一個開放性的問題，需要查找資料來回答。隨著田間監測數據的更新及新的科研論文發表，每年獲得的證據是不一樣的。要注意搜集科學、可靠的證據，如科研論文、權威的官方報道等。
2．提示：科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。
(1)基因策略。該策略是在分子水平上提高轉基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性，包括在棉花中轉入多個殺蟲基因、構建組織特異性表達的啟動子、提高殺蟲基因的表達量等。例如，最早種植的抗蟲棉中只轉入了一種Bt基因，抗性比較單一；現在經常將兩種或兩種以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同時轉入棉花細胞，這樣既可以提高殺蟲活性，又可以延緩害蟲抗性的產生和發展，還可以通過不同基因間的互補作用擴大抗蟲范圍。
(2)田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護所、與其他作物輪作或套種等。
(3)國家宏觀調控策略。該策略包括實施分區種植管理、加強抗性監測、進行嚴格的安全性評價等。
?練習與應用 P83
一、概念檢測
1．(1)√
(2)×　提示：構建重組質粒要用到限制酶(用來在特定位點進行切割)和DNA連接酶(用來連接目的基因和載體)，不需要核酸酶。
(3)×　提示：目的基因成功導入受體細胞后不一定會表達，還需要進行檢測和鑒定。
2．D　提示：延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種脫氧核苷酸。
二、拓展應用
1．提示：可能在自交繁殖過程中存在轉基因的沉默或丟失現象。
2．提示：(1)psy和crlⅠ基因、pmi基因將目的基因送入受體細胞。
(2)不能，限制酶會將目的基因切斷，破壞目的基因。
(3)維生素A在人體內具有非常重要的生理功能，對視力、骨骼生長、免疫功能等都有調節作用。但是，人體不能合成維生素A，需要從食物中攝取。維生素A缺乏癥是南亞地區常見的由營養不良導致的疾病，該地區的居民一般以秈稻作為主食。β－胡蘿卜素是維生素A的前體，在人體內它可以轉化為維生素A。因此，科學家將兩個參與β－胡蘿卜素合成的酶的基因轉入了秈稻中，使其胚乳中富含β－胡蘿卜素，期望讓人們通過日常食用主食就能補充足夠量的維生素A，從而降低維生素A缺乏癥的患病率。關于“是否要推廣‘黃金大米’”的爭論主要圍繞其安全性、有效性等方面展開。
?探究·實踐 P84
結果分析與評價
1．提示：觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。
2．提示：如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當等。如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質量不好等。
訓練鞏固·課堂達標
1．將目的基因導入大豆莖尖分生區細胞和小鼠受精卵，常用的方法分別是(　C　)
A．顯微注射法、農桿菌轉化法 B．顯微注射法、花粉管通道法
C．農桿菌轉化法、顯微注射法 D．花粉管通道法、顯微注射法
解析：大豆是雙子葉植物，農桿菌轉化法是將目的基因導入雙子葉植物細胞常用的方法；顯微注射法是將目的基因導入動物受精卵最常用的方法。
2．如圖為形成cDNA的過程和PCR擴增過程示意圖。據圖分析，下列說法正確的是(　D　)
A．催化①過程的酶是RNA聚合酶
B．催化②⑤過程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高溫
C．③過程需要解旋酶的作用
D．④過程需要冷卻至50℃左右
解析：圖中①過程為逆(反)轉錄，該過程需要逆轉錄酶(反轉錄酶)的催化，A錯誤；圖中②⑤過程為DNA復制，這兩個過程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤過程進行的溫度是70～75℃，因此催化該過程的DNA聚合酶能耐高溫，但催化②過程的酶可以不耐高溫，B錯誤；③過程為高溫解鏈，該過程不需要解旋酶，C錯誤；④為復性過程，需要冷卻至50℃左右，D正確。
3．基因表達載體的構建所需要的條件是(　B　)
①同一種限制酶　②具有某些標記基因的質?！、跼NA聚合酶　④目的基因?、軩NA連接酶　⑥啟動子?、呓K止子
A．①②③④⑤⑥⑦　　 B．①②④⑤⑥⑦
C．②④⑥⑦ D．①②④⑤
解析：構建基因表達載體是將目的基因與有關載體拼接起來，故所需要的條件除了目的基因和具有某些標記基因的質粒外，還需要同一種限制酶和DNA連接酶，啟動子和終止子。
4．(不定項)如圖為某種質粒的簡圖，小箭頭所指分別為限制性內切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點，P為轉錄的啟動部位。已知目的基因的兩端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點，受體細胞為無任何抗藥性的原核細胞。下列有關敘述，錯誤的是(　ABD　)
A．將含有目的基因的DNA與質粒分別用EcoRⅠ酶切，在DNA連接酶作用下，生成由兩個DNA片段連接形成的產物有兩種
B．DNA連接酶的作用是將酶切后得到的黏性末端連接起來，形成一個重組質粒時形成兩個磷酸二酯鍵
C．為了防止目的基因反向粘連和質粒自行環化，酶切時可選用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
D．能在含青霉素的培養基中生長的受體細胞表明該目的基因已成功導入該細胞
解析：根據題意，目的基因的兩端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點，將含有目的基因的DNA用EcoRⅠ酶切，會得到目的基因片段；根據質粒的簡圖可知，將質粒用EcoRⅠ酶切，會得到與質粒周長等長的鏈狀DNA；因此將含有目的基因的DNA與質粒分別用EcoRⅠ酶切，在DNA連接酶作用下，可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—質粒片段、質?！|粒片段三種產物，A錯誤；DNA連接酶的作用是將酶切后得到的黏性末端連接起來形成一個重組質粒，該過程形成四個磷酸二酯鍵，B錯誤；EcoRⅠ和BamHⅠ的識別序列不同，獲取目的基因和切割質粒時，同時選用EcoRⅠ和BamHⅠ切割，目的基因兩端形成的末端不同，切割開的質粒兩端形成的末端不同，再用DNA連接酶連接，可以防止目的基因反向連接和質粒自身環化，C正確；題圖顯示，在構建基因表達載體的過程中質粒中的青霉素抗性基因和四環素抗性基因都不會被破壞，因此能在含青霉素和四環素的培養基中生長的受體細胞不能表明目的基因已成功導入該細胞，D錯誤。第4節　蛋白質工程的原理和應用
新課程標準 核心素養
1．說出蛋白質工程崛起的緣由。2．概述蛋白質工程的基本原理。3．舉例說明依據人類需要對原有蛋白質結構進行基因改造、生產目標蛋白的過程。 1．科學思維——嘗試通過蛋白質工程技術，根據人類需要的蛋白質結構，設計或改造某一蛋白質的設計流程。2．社會責任——嘗試運用逆向思維分析和解決問題。
知識導圖
必備知識·夯實雙基
一、蛋白質工程
1．概念
(1)基礎：蛋白質分子的__結構規律__及其與__生物功能__的關系。
(2)手段：通過__基因改造__或__基因合成__，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質。
(3)目的：獲得滿足人類的生產和生活需求的__蛋白質__。
2．理論和技術條件：__分子生物學__、__晶體學__以及__計算機__技術的迅猛發展。
二、蛋白質工程崛起的緣由
1．基因工程的實質：將一種生物的__基因__轉移到另一種生物體內，后者可以產生它本不能產生的__蛋白質__，進而表現出__新的性狀__。
2．基因工程的不足：基因工程在原則上只能產生自然界中__已存在__的蛋白質。
3．天然蛋白質的不足：天然蛋白質的結構和功能符合__特定物種__生存的需要，卻不一定完全符合__人類生產和生活__的需要。
4．實例：玉米中賴氨酸的含量比較低，賴氨酸合成中兩種酶的__氨基酸__被替換，就可以使玉米葉片和種子中游離賴氨酸分別提高5倍和2倍。
三、蛋白質工程的基本原理
1．目標：根據人們對__蛋白質__功能的特定需求，對蛋白質的結構進行設計改造。
2．方法：__改造基因__或__合成基因__。
3．流程：預期蛋白質功能→設計預期的__蛋白質結構__→推測應有的__氨基酸__序列→找到相對應的__脫氧核苷酸__序列(基因)或合成新的__基因__→獲得所需要的蛋白質。
四、蛋白質工程的應用
1．在醫藥工業方面的應用
(1)研發速效胰島素類似物：科學家通過改造__胰島素基因__使B28位脯氨酸替換為天冬氨酸或者將它與29的賴氨酸交換位置，從而有效抑制了__胰島素的聚合__，研發出速效胰島素類似物。
(2)提高干擾素的保存期：將干擾素分子上的一個
__半胱氨酸__變成__絲氨酸__，提高了干擾素的保存時間。
(3)改造抗體：將小鼠單克隆抗體上__結合抗原的區域__“嫁接”到人的抗體上，降低了誘發人體免疫反應的強度。
2．在其他工業和農業方面的應用
(1)改進酶的性能或開發新的工業用酶：利用蛋白質工程獲得蛋白酶的多種__突變體__。
(2)改造某些重要的酶：利用蛋白質工程改造參與
__調控光合作用__的酶，以提高植物光合作用的效率。
┃┃學霸記憶__■
1．基因工程在原則上只能生產自然界中已存在的蛋白質。
2．蛋白質工程并不是直接改造蛋白質分子的結構，而是通過基因操作來實現對天然蛋白質的改造。
3．蛋白質工程的基本途徑：從預期的蛋白質功能出發→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列。
4．蛋白質工程是以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過基因改造或基因合成，來改造現有蛋白質，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活的需要。
┃┃活學巧練__■
1．蛋白質工程是在分子水平上對蛋白質分子直接進行操作，定向改變分子的結構。(×)
2．蛋白質工程能產生自然界中不存在的新型蛋白質分子。(√)
3．實施蛋白質工程的前提條件是了解蛋白質結構和功能的關系。(√)
4．基因工程遵循中心法則，而蛋白質工程不遵循。(×)
5．根據某多肽鏈的一段氨基酸序列，可以很容易地確定控制該肽鏈合成的基因的脫氧核苷酸序列。(×)
6．蛋白質工程是一項難度很大的工程，主要是因為人們對蛋白質復雜的高級結構沒有完全認識。(√)
思考：
1．為什么蛋白質工程不是直接改造蛋白質而是通過基因改造和基因合成來完成？
提示：①任何一種天然蛋白質都是由基因編碼的，改造了基因即對蛋白質進行了改造，而且改造過的蛋白質可以遺傳下去。如果對蛋白質直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白質也是無法遺傳下去的。②對基因進行改造比對蛋白質進行直接改造容易操作，難度小得多。
2．蛋白質工程的操作程序的基本思路與基因工程有什么不同？
提示：基因工程操作程序的基本思路遵循中心法則，從DNA→mRNA→多肽→折疊產生蛋白質，基本上是生產出自然界中已有的蛋白質。蛋白質工程是按照相反的思路進行的，確定蛋白質的功能→蛋白質應有的高級結構→蛋白質具備的折疊狀態→應有的氨基酸序列→基因中的堿基序列，可以創造自然界不存在的蛋白質。
課內探究·名師點睛
知識點?
蛋白質工程
1．對蛋白質工程的2點說明
(1)改造對象：通過改造控制蛋白質合成的基因的結構來改造某種蛋白質的結構。
①任何一種天然蛋白質都是由基因編碼的，改造了基因即對蛋白質進行了改造，而且可以遺傳下去。如果對蛋白質直接改造，即使改造成功，被改造過的蛋白質分子還是無法遺傳的。
②對基因進行改造比對蛋白質直接進行改造要容易操作，難度要小得多。
(2)蛋白質工程中經過處理得到的新基因與基因突變得到的新基因有較大差別：基因突變的新基因中含有不編碼蛋白質的序列，而蛋白質工程中的新基因則沒有。
2．蛋白質工程的基本流程
┃┃典例剖析__■
典例1　目前科學家通過蛋白質工程制造出了藍色熒光蛋白、黃色熒光蛋白等，采用蛋白質工程技術制造出藍色熒光蛋白過程的正確順序是(　B　)
①推測藍色熒光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
②藍色熒光蛋白的功能分析和結構設計序列
③藍色熒光蛋白基因的合成
④表達出藍色熒光蛋白
A．①②③④　　　　 B．②①③④
C．②③①④ D．④②①③
解析：蛋白質工程的基本流程是從預期的蛋白質功能出發→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→表達出相應的蛋白質，故正確順序應該是②①③④。
┃┃變式訓練__■
1．下圖表示蛋白質工程的操作過程，相關說法不正確的是(　C　)
A．a、b過程分別是轉錄、翻譯
B．蛋白質工程中對蛋白質分子結構的了解是非常關鍵的工作
C．蛋白質工程是完全擺脫基因工程技術的一項全新的生物工程技術
D．蛋白質工程中可能構建出一種全新的基因
解析：a過程是以DNA的一條鏈為模板合成mRNA的轉錄過程，b過程是以mRNA為模板合成具有一定氨基酸順序的多肽鏈的翻譯過程，A項正確；蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過改造或合成基因，來改造現有蛋白質，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活的需求，因此蛋白質工程中對蛋白質分子結構的了解是非常關鍵的工作，B、D項正確；蛋白質工程是在基因工程的基礎上，延伸出來的第二代基因工程，C項錯誤。
知識點?
蛋白質工程與基因工程的區別與聯系
比較項目 蛋白質工程 基因工程
區別 起點 預期的蛋白質功能 目的基因
過程 預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列→獲得需要的蛋白質 獲取目的基因→構建基因表達載體→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定
目標 定向改造或生產人類所需的蛋白質 定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產品
結果 生產非天然的蛋白質 生產自然界已有的蛋白質
聯系 ①都在生物體外對基因進行操作；②蛋白質工程是在基因工程基礎上延伸出來的第二代基因工程
知識貼士
“二看法”判斷基因工程和蛋白質工程
一看對基因的操作方法—
二看合成的蛋白質種類—
┃┃典例剖析__■
典例2　蛋白質工程是在基因工程的基礎上延伸出來的第二代基因工程，有廣闊的發展前景。下列關于蛋白質工程的描述，正確的是(　C　)
A．因為需要對蛋白質直接改造，所以操作更難
B．因為蛋白質不能遺傳，所以蛋白質工程的產物不能大量生產
C．蛋白質工程也需要設計出相應的基因
D．蛋白質工程在各個領域有廣泛應用
解析：蛋白質工程是在基因工程的基礎上延伸出來的第二代基因工程，是在分子水平上對基因分子直接進行操作，A項錯誤；分子水平上對基因分子直接進行操作使其遺傳物質發生改變，可以遺傳給下一代，B項錯誤；蛋白質工程對基因分子直接進行操作，需要推測出應有的氨基酸序列，設計出相應的基因，C項正確；蛋白質工程的發展并不成熟，仍需一段時間提升，其目前并不能在各個領域廣泛應用，D項錯誤。
┃┃變式訓練__■
2．下列關于蛋白質工程的敘述，正確的是(　A　)
A．通過對基因結構的定點改造實現對玉米中賴氨酸合成過程中的關鍵酶結構的改造屬于蛋白質工程
B．將人的胰島素基因導入大腸桿菌細胞內，使大腸桿菌生產人的胰島素的技術屬于蛋白質工程
C．蛋白質工程不需要構建基因表達載體
D．通過蛋白質工程改造后的蛋白質的特性不能遺傳給子代
解析：通過對基因結構的定點改造實現對玉米中賴氨酸合成過程中的關鍵酶結構的改造屬于蛋白質工程，A項正確；將人的胰島素基因導入大腸桿菌細胞內，使大腸桿菌生產人的胰島素的技術屬于基因工程，B項錯誤；在蛋白質工程中，改造后的基因需要導入受體細胞內才能表達出相應的蛋白質，故需要構建基因表達載體，C項錯誤；蛋白質工程的實質是對基因進行改造，從而實現對蛋白質的改造，改造后的蛋白質的特性可遺傳給子代，D項錯誤。
指點迷津·撥云見日
區分蛋白質組計劃、蛋白質工程與酶工程
人類蛋白質組計劃是繼人類基因組計劃之后，生命科學乃至自然科學領域另一項重大的科學命題，是研究細胞中基因編碼的全部蛋白質的組成、結構、修飾及其功能的國際合作計劃。
目前科學家對大多數蛋白質的高級結構的了解還很不夠，要設計出更加符合人類需要的蛋白質還需要經過艱辛的探索。人類蛋白質組計劃的深入研究將是對蛋白質工程的有力推動和理論支持。
酶工程就是指酶所具有的生物催化作用，借助工程學的手段，應用于生產、生活、醫療診斷和環境保護等方面的一門科學技術。概括地說，酶工程是由酶制劑的生產和應用兩方面組成的。酶工程的應用主要集中于食品工業、輕工業以及醫藥工業中。如固定化酶技術、加酶洗衣粉、嫩肉粉等。
通常所說的酶工程是用工程菌生產酶制劑，而沒有經過由酶的功能來設計酶的分子結構，然后由酶的分子結構來確定相應基因的堿基序列等步驟。因此，酶工程的重點在于對已存在酶的合理、充分利用，而蛋白質工程的重點則在于對已存在的蛋白質分子進行改造。當然，隨著蛋白質工程的發展，其成果也會應用到酶工程中，使酶工程成為蛋白質工程的一部分。
┃┃典例剖析__■
典例3　T4溶菌酶在高溫時易失去活性。研究人員對編碼T4溶菌酶的基因進行改造，使T4溶菌酶的第3位的異亮氨酸變成半胱氨酸，該半胱氨酸與第97位的半胱氨酸之間形成一個二硫鍵，提高了T4溶菌酶的耐熱性。下列相關敘述正確的是(　D　)
A．T4溶菌酶耐熱性提高的原因是組成該酶的氨基酸種類和數目發生了改變
B．T4溶菌酶的改造屬于蛋白質工程，自然界中的酶都可通過蛋白質工程進行改造
C．蛋白質工程與中心法則的流程方向一致，即DNA→mRNA→蛋白質
D．若高溫等使蛋白質的空間結構發生改變，則蛋白質的功能也會受影響
解析：由題意可知，T4溶菌酶耐熱性提高的原因是組成該酶的肽鏈的氨基酸序列發生了改變，氨基酸的數目沒有改變，A項錯誤；T4溶菌酶的化學本質是蛋白質，對其進行改造屬于蛋白質工程，在自然界中絕大多數酶的化學本質是蛋白質，但也有少數酶的化學本質是RNA，化學本質是RNA的酶不能通過蛋白質工程進行改造，B項錯誤；蛋白質工程與中心法則的流程方向相反，其流程是從預期蛋白質的功能出發→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質，C項錯誤；蛋白質的功能由蛋白質的結構決定，蛋白質的空間結構發生改變，蛋白質的功能也會受到影響，D項正確。
解疑答惑
?從社會中來 P93
提示：科學家解析了多管水母綠色熒光蛋白的晶體結構，并利用計算機進行輔助設計，在此基礎上再采用定點突變的技術將綠色熒光蛋白發光基團正下方的第203位的蘇氨酸替換為酪氨酸，從而獲得了一種新的綠色熒光蛋白的衍生物——黃色熒光蛋白。
?旁欄思考 P93
提示：人類蛋白質組計劃是繼人類基因組計劃之后，生命科學乃至自然科學領域重大的國際合作科研項目。2001年，國際人類蛋白質組組織宣布成立。2003年，該組織正式提出啟動兩項重大國際合作項目：一項是由中國科學家牽頭執行的“人類肝臟蛋白質組計劃”；另一項是由美國科學家牽頭執行的“人類血漿蛋白質組計劃”，由此拉開了人類蛋白質組計劃的帷幕?！叭祟惛闻K蛋白質組計劃”是國際上第一個人類組織器官的蛋白質組計劃，由我國賀福初院士牽頭，這是中國科學家第一次領銜重大國際科研協作計劃。它的目標是通過對肝臟蛋白質高通量、規?；难芯?，解析肝臟蛋白質在生理、病理過程中的功能意義，為重大肝病的預防、診斷、治療和新藥的研發提供重要的科學依據。2010年，該計劃“兩譜、兩圖、三庫”的目標初步實現。我國科學家完成了人類肝臟蛋白質組表達譜和修飾譜，繪制了蛋白質相互作用連鎖圖和定位圖?！叭龓臁眲t是建立符合國際標準的肝臟標本庫、發展規模化抗體制備技術并建立肝臟蛋白質抗體庫和建立完整的肝臟蛋白質組數據庫。人類蛋白質組計劃取得的成果有力推動了蛋白質工程的發展，為它提供了重要的理論支持。2014年6月，中國人類蛋白質組計劃啟動。
?思考·討論 P94
1．提示：每種氨基酸都有對應的密碼子，只要查一下遺傳密碼子表，就可以將教材中氨基酸序列的編碼序列查出來。但是由于上述氨基酸序列中有幾個氨基酸是由多種密碼子編碼的，因此相應的堿基排列組合起來就比較復雜，至少可以排列出32種，可以根據學過的排列組合知識自己排列一下。首先應該根據密碼子推出mRNA序列[GCU(或C或A或G)UGGAAA(或G)GAA(或G)UUU或(C)]，再根據堿基互補配對原則推出脫氧核苷酸序列[CGA(或G或T或C)ACCTTT(或C)CTT(或C)AAA(或G)]。
2．提示：確定目的基因的堿基序列后，可以人工合成目的基因或從基因文庫中獲取目的基因。對基因的改造經常會用到基因定點突變技術來進行堿基的替換、增添等。
?異想天開 P95
提示：理論上講可以，但目前還沒有真正成功的例子。利用改造后的動物細胞、微生物細胞等可以生產人類需要的蛋白質，但這些蛋白質往往都是自然界中已經存在的蛋白質，并非完全是人工設計出來的、自然界中不存在的蛋白質。主要原因是蛋白質的高級結構非常復雜，人類對大多數蛋白質的高級結構和蛋白質在生物體內如何行使功能了解得還不夠，很難設計出一個全新的而又具有功能的蛋白質。即使設計并獲得了一個全新的蛋白質，它的生理生化特性、用它生產的蛋白質食品的安全性等都需要長期深入的研究。
?到社會中去 P96
提示：酶用作工業催化劑，比無機催化劑具有更大的優越性，主要體現在以下幾個方面。由于酶促反應能在常溫、常壓和中性pH條件下進行，因此可以節省大量的能源和設備投資；生產過程中不會造成嚴重的污染，符合環境保護的要求；生產過程簡單、效率高，產品質量好，生產成本低。因此，酶制劑在工業領域得到了廣泛的應用。近年來，通過引進國外先進設備、優良菌種以及開發新型酶制劑，我國酶制劑產業保持了較快的增長態勢，品種越來越豐富，產品的市場競爭力也在不斷提升。2016年，我國工業酶制劑年產量達120萬噸，年增長率保持在10%左右。在全球范圍內，我國酶制劑的市場份額已占到了30%左右，我國進入酶制劑生產大國的行列。在酶制劑產業中，蛋白質工程被廣泛用于開發酶的新品種或改進酶的性能，如提高酶的熱穩定性，增加某些被用作去污劑的酶的去污效率等。
?練習與應用 P96
一、概念檢測
1．(1)×　提示：基因決定蛋白質，蛋白質工程也需要對基因進行操作。
(2)×
(3)√
2．D　提示：蛋白質工程的最終目的是改造現有的蛋白質，或者制造一種全新的蛋白質，以滿足人類的需求。
3．A　提示：蛋白質工程目前可操作的直接對象為基因。
二、拓展應用
提示：這項工作屬于蛋白質工程的范疇。引起T4溶菌酶空間結構發生改變的根本原因是基因的堿基序列發生了變化。如果要將改造后的T4溶菌酶應用于生產實踐，還有很多工作需要做。例如，由于改造后酶的空間結構發生了變化，因此它的一些基本特性需要重新明確，包括它能耐受的溫度范圍、催化反應的最適溫度、酶活力的大小等；需要建立規模化生產該酶的技術體系，評估生產成本等。
訓練鞏固·課堂達標
1．蛋白質工程崛起的緣由是(　C　)
A．天然蛋白質使生物適應環境
B．天然蛋白質均為自然界中存在的種類
C．天然蛋白質不能夠完全滿足人類生產和生活的需要
D．天然蛋白質的結構和種類是長期自然選擇的結果
解析：蛋白質工程崛起的緣由：基因工程原則上只能生產自然界中已存在的蛋白質，而這些天然蛋白質卻不一定能夠完全滿足人類生產和生活的需要。
2．從某海洋動物中獲得一基因，其表達產物為一種抗菌性和溶血性均較強的多肽P1。目前在P1的基礎上研發抗菌性強但溶血性弱的多肽藥物，首先要做的是(　C　)
A．合成編碼目的肽的DNA片段
B．構建含目的肽DNA片段的表達載體
C．依據P1氨基酸序列設計多條模擬肽
D．篩選出具有優良活性的模擬肽作為目的肽
解析：緊扣蛋白質工程的流程(基本途徑)進行分析。由題可知，多肽P1為抗菌性和溶血性均較強的多肽，要設計出抗菌性強但溶血性弱的多肽，即在P1的基礎上設計出自然界原本不存在的蛋白質，用蛋白質工程技術可以實現。蛋白質工程的基本途徑是：從預期的蛋白質功能出發→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列。故要想在P1的基礎上研發抗菌性強但溶血性弱的多肽藥物，首先要做的是依據P1的氨基酸序列設計出多條模擬肽，然后進行改造，從而確定抗菌性強但溶血性弱的多肽的氨基酸序列。
3．豬胰島素用于降低人體血糖濃度的效果并不明顯，原因是豬胰島素分子中有一個氨基酸與人的不同。為了使豬胰島素能夠用于臨床治療糖尿病，利用蛋白質工程對豬胰島素分子設計的最佳方案是(　A　)
A．對豬胰島素進行一個不同氨基酸的替換
B．將豬胰島素和人胰島素進行拼接組成新的胰島素
C．將豬和人的胰島素混合在一起治療糖尿病
D．根據人的胰島素設計制造一種全新的胰島素
解析：由于豬胰島素分子中只有一個氨基酸與人的胰島素不同，所以只需替換這一個不同的氨基酸即可。雖然根據人胰島素分子設計一種全新的胰島素也可以用于臨床治療，但是在分子設計和胰島素的生產方面都存在很多的困難，所以并不是最佳方案。
4．(不定項)下列屬于蛋白質工程成果的是(　ABC　)
A．改造酶的結構，提高酶的熱穩定性
B．生產出鼠—人嵌合抗體
C．將t－PA分子中的天冬酰胺替換為谷氨酰胺
D．將人的胰島素基因整合到大腸桿菌體內生產胰島素
解析：將人的胰島素基因整合到大腸桿菌體內生產胰島素，屬于基因工程的成果。本章整合
網絡構建·素養展示
章末解題·釋疑解惑
復習與提高 P98
1．提示：(1)①應選擇酶切位點位于目的基因兩端的限制酶。②為了避免目的基因及質粒的自身環化、反向連接，也可使用不同的限制酶(非同種酶)切割目的基因所在片段和質粒。③切割質粒的限制酶不能同時切開質粒上的所有標記基因，即至少要保留一個標記基因，以用于重組DNA的鑒定和選擇。
(2)加入DNA連接酶。
(3)該質粒便于進行雙重篩選。標記基因AmpR基因可用于檢測質粒是否導入了大腸桿菌，一般只有導入了質粒的大腸桿菌才能在添加了青霉素的培養基上生長。而由于LacZ基因的效應，這些生長的菌落可能出現兩種顏色：含有空質粒(沒有連接目的基因的質粒)的大腸桿菌菌落呈藍色；含有重組質粒的大腸桿菌菌落呈白色。
(4)白色。限制酶切割質粒時，使LacZ基因被破壞，含重組質粒的大腸桿菌不含LacZ基因，所以X－gal不會分解產生藍色物質，菌落呈現白色。
2．提示：(1)逆轉錄病毒是載體，能將外源基因Oct3/4、Sox2、c－Myc和Klf4送入小鼠成纖維細胞中。
(2)可以設置對照組。將轉入外源基因和沒有轉入外源基因的細胞分別培養在相同的培養基中，并確保其他培養條件相同。如果只有轉入外源基因的細胞轉化成了iPS細胞，就可以證明iPS細胞的產生不是由于培養基的作用。
(3)可以依次去掉1個基因，將其他3個基因轉入小鼠成纖維細胞中，然后通過與轉入4個基因的小鼠成纖維細胞的誘導情況進行比較，來推測缺失的那個基因對誘導iPS細胞的影響，進而判斷每個基因作用的相對大小。(其他合理答案均可)
(4)不會引起免疫排斥反應，因為在誘導轉化的過程中細胞的遺傳物質沒有發生變化，理論上產生的還是“自體”細胞。iPS細胞擁有分化為各種細胞的潛能，因此存在分化成腫瘤細胞的風險。
3．提示：(1)從親緣關系的遠近來看，固氮相關基因可能更容易在水稻根系微生物中穩定存在和表達，進而使其具有固氮的能力。(其他合理答案均可)
(2)此題不要求有唯一的答案，學生可從便捷性、安全性、經濟性等角度進行分析，言之成理即可。例如，從便捷性角度認為能固氮的水稻新品種更值得推廣；或從轉基因安全性角度認為能固氮的水稻根系微生物更值得推廣等。
直擊高考·真題體驗
1．(2022·山東卷，13)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是(　B　)
A．過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解
B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀
C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質
解析：低溫時DNA酶的活性較低，過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解，A正確；離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀，B錯誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色，C正確；細胞中的某些蛋白質可以溶解于酒精，可能有蛋白質不溶于酒精，在95%的冷酒精中與DNA一塊兒析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質，D正確。
2．(2019·北京卷)甲、乙是嚴重危害某二倍體觀賞植物的病害。研究者先分別獲得抗甲、乙的轉基因植株，再將二者雜交后得到F1，結合單倍體育種技術，培育出同時抗甲、乙的植物新品種。以下對相關操作及結果的敘述，錯誤的是(　D　)
A．將含有目的基因和標記基因的載體導入受體細胞
B．通過接種病原體對轉基因的植株進行抗病性鑒定
C．調整培養基中植物激素比例獲得F1花粉再生植株
D．經花粉離體培養獲得的若干再生植株均為二倍體
解析：基因工程中需在體外先將目的基因與帶有標記基因的載體結合，再將其導入受體細胞，A項正確。在個體生物學水平上，可通過接種病原體對轉基因的植株進行抗病性鑒定，B項正確。在花粉離體培養過程中，合理調整培養基中生長素和細胞分裂素的比例，可使愈傷組織再分化，獲得F1花粉再生植株，C項正確。經花粉離體培養獲得的若干再生植株一般為單倍體，D項錯誤。
3．(2019·江蘇卷)下列生物技術操作對遺傳物質的改造，不會遺傳給子代的是(　D　)
A．將胰島素基因表達質粒轉入大腸桿菌，篩選獲得基因工程菌
B．將花青素代謝基因導入植物體細胞，經組培獲得花色變異植株
C．將腸乳糖酶基因導入奶牛受精卵，培育出產低乳糖牛乳的奶牛
D．將腺苷酸脫氨酶基因轉入淋巴細胞后回輸患者，進行基因治療
解析：基因工程菌中含目的基因，能通過繁殖遺傳給子代，A項不符合題意。經組培獲得的轉基因植株的細胞中都含目的基因，能夠遺傳給子代，B項不符合題意。培育得到的轉基因奶牛的細胞中都含目的基因，故能遺傳給子代，C項不符合題意。由題干信息可知，進行題述基因治療時只有淋巴細胞含目的基因，生殖細胞不含目的基因，故不能遺傳給子代，D項符合題意。
4．(2022·廣東卷，22)“綠水逶迤去，青山相向開”大力發展低碳經濟已成為全社會的共識。基于某些梭菌的特殊代謝能力，有研究者以某些工業廢氣(含CO2等一碳溫室氣體，多來自高污染排放企業)為原料，通過厭氧發酵生產丙酮，構建一種生產高附加值化工產品的新技術。
回答下列問題：
(1)研究者針對每個需要擴增的酶基因(如圖)設計一對__引物__，利用PCR技術，在優化反應條件后擴增得到目標酶基因。
(2)研究者構建了一種表達載體pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因組合表達庫，經篩選后提高丙酮的合成量。該載體包括了啟動子、終止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是__作為標記基因，篩選含有基因表達載體的受體細胞__，終止子的作用是__終止轉錄，使轉錄在需要的地方停下來__。
(3)培養過程中發現重組梭菌大量表達上述酶蛋白時，出現了生長遲緩的現象，推測其原因可能是__二氧化碳等氣體用于大量合成丙酮，而不是用于重組梭菌的生長__，此外丙酮的積累會傷害細胞，需要進一步優化菌株和工藝才能擴大應用規模。
(4)這種生產高附加值化工產品的新技術，實現了__廢物的資源化__，體現了循環經濟特點。從“碳中和”的角度看，該技術的優勢在于__不僅不排放二氧化碳，而且還可以消耗工業廢氣中的二氧化碳__，具有廣泛的應用前景和良好的社會效益。
解析：(1)利用PCR技術擴增目標酶基因，首先需要根據目標酶基因兩端的堿基序列設計一對引物，引物與模板鏈結合后，Taq酶才能從引物的3′端延伸子鏈。(2)基因表達載體中，抗生素抗性基因作為標記基因，可用于篩選含有基因表達載體的受體細胞，終止子可終止轉錄，使轉錄在需要的地方停下來。(3)重組梭菌大量表達上述酶蛋白時，在這些酶蛋白的作用下，二氧化碳等氣體大量用于合成丙酮，而不是用于重組梭菌的生長，所以會導致生長遲緩。(4)根據題意可知，這種生產高附加值化工產品的新技術，以高污染企業排放的二氧化碳等一碳溫室氣體為原料，實現了廢物的資源化，體現了循環經濟特點。從“碳中和”的角度看，該技術生產丙酮的過程不僅不排放二氧化碳，而且還可以消耗工業廢氣中的二氧化碳，有利于減緩溫室效應，并實現較高的經濟效益，所以具有廣泛的應用前景和良好的社會效益。
5．(2022·湖南卷，22)水蛭是我國的傳統中藥材，主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。擬通過蛋白質工程改造水蛭素結構，提高其抗凝血活性?；卮鹣铝袉栴}：
(1)蛋白質工程流程如圖所示，物質a是__氨基酸序列多肽鏈__，物質b是__mRNA__。在生產過程中，物質b可能不同，合成的蛋白質空間構象卻相同，原因是__密碼子的簡并__。
(2)蛋白質工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有__從基因文庫中獲取目的基因__、__通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成__和利用PCR技術擴增。PCR技術遵循的基本原理是__DNA雙鏈復制__。
(3)將提取的水蛭蛋白經甲、乙兩種蛋白酶水解后，分析水解產物中的肽含量及其抗凝血活性，結果如圖所示。推測兩種處理后酶解產物的抗凝血活性差異主要與肽的__種類__(填“種類”或“含量”)有關，導致其活性不同的原因是__提取的水蛭蛋白的酶解時間和處理的酶的種類不同，導致水蛭蛋白空間結構有不同程度破壞__。
(4)若要比較蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，簡要寫出實驗設計思路：__取3支試管，分別加入等量的蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一種動物(如家兔)血液，立即將等量的血液加入1、2、3號三支試管中，靜置相同時間，統計三支試管中血液凝固時間__。
解析：(1)據分析可知，物質a是氨基酸序列多肽鏈，物質b是mRNA。在生產過程中，物質b可能不同，合成的蛋白質空間構象卻相同，原因是密碼子的簡并，即一種氨基酸可能有幾個密碼子。(2)蛋白質工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有從基因文庫中獲取目的基因、通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成和利用PCR技術擴增。PCR技術遵循的基本原理是DNA雙鏈復制。(3)將提取的水蛭蛋白經甲、乙兩種蛋白酶水解后，據圖可知，水解產物中的肽含量隨著酶解時間的延長均上升，且差別不大；而水解產物中抗凝血活性有差異，經酶甲處理后，隨著酶解時間的延長，抗凝血活性先上升后相對穩定，經酶乙處理后，隨著酶解時間的延長，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲處理后的酶解產物的抗凝血活性最終高于經酶乙處理后的酶解產物的抗凝血活性，差異明顯，據此推測兩種處理后酶解產物的抗凝血活性差異主要與肽的種類有關，導致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解時間和酶的種類不同，導致水蛭蛋白空間結構有不同程度破壞。(4)若要比較蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，實驗設計思路為：取3支試管，分別加入等量的蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一種動物(如家兔)血液，立即將等量的血液加入1、2、3號三支試管中，靜置相同時間，統計三支試管中血液凝固時間。
6．(2022·全國乙卷)新冠疫情出現后，病毒核酸檢測和疫苗接種在疫情防控中發揮了重要作用?；卮鹣铝袉栴}。
(1)新冠病毒是一種RNA病毒，檢測新冠病毒RNA(核酸檢測)可以采取RT－PCR法。這種方法的基本原理是先以病毒RNA為模板合成cDNA，這一過程需要的酶是__逆轉錄酶(反轉錄酶)__，再通過PCR技術擴增相應的DNA片段。根據檢測結果判斷被檢測者是否感染新冠病毒。
(2)為了確保新冠病毒核酸檢測的準確性，在設計PCR引物時必須依據新冠病毒RNA中的__特異性核苷酸序列__來進行。PCR過程每次循環分為3步，其中溫度最低的一步是__退火(復性)__。
(3)某人同時進行了新冠病毒核酸檢測和抗體檢測(檢測體內是否有新冠病毒抗體)，若核酸檢測結果為陰性而抗體檢測結果為陽性，說明__曾感染新冠病毒，已康復__(答出1種情況即可)；若核酸檢測和抗體檢測結果均為陽性，說明__已感染新冠病毒，是患者__。
(4)常見的病毒疫苗有滅活疫苗、蛋白疫苗和重組疫苗等。已知某種病毒的特異性蛋白S(具有抗原性)的編碼序列(目的基因)。為了制備蛋白疫苗，可以通過基因工程技術獲得大量蛋白S?；蚬こ痰幕静僮髁鞒淌莀_獲取S蛋白基因→構建S蛋白基因與運載體的表達載體→導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定(檢測受體能否產生S蛋白)__。
解析：(1)分析題意可知，新冠病毒的遺傳物質是RNA，而RT－PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的過程屬于逆轉錄過程，逆轉錄過程需要的酶是逆轉錄酶(反轉錄酶)。(2)PCR過程需要加入引物，設計引物時應有一段已知目的基因的核苷酸序列，在該過程中為了確保新冠病毒核酸檢測的準確性，在設計PCR引物時必須依據新冠病毒RNA中的特異性核苷酸序列來進行；PCR過程每次循環分為3步，分別為變性(90～95℃)、復性(55～60℃)、延伸(70～75℃)，故其中溫度最低的一步是復性。(3)某人同時進行了新冠病毒核酸檢測和抗體檢測，若核酸檢測結果為陰性而抗體檢測結果為陽性，說明該個體曾經感染過新冠病毒，機體發生特異性免疫反應，產生抗體，將病毒消滅已康復，則核酸檢測為陰性，但由于抗體有一定的時效性，能在體內存在一段時間，故抗體檢測為陽性；若核酸檢測和抗體檢測結果均為陽性，說明該個體體內仍含有病毒的核酸，機體仍進行特異性免疫過程，能產生抗體，則說明該人已經感染新冠病毒，為患者。(4)基因工程的基本操作流程是：獲取目的基因→基因表達載體的構建(基因工程的核心)→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定，結合題意，本基因工程的目的是獲得大量的S蛋白，故具體流程為：獲取S蛋白基因→構建S蛋白基因與運載體的表達載體→導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定(檢測受體能否產生S蛋白)。
7．(2021·全國甲卷)PCR技術可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，醫生進行了相關操作：①分析PCR擴增結果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴增DNA片段；④采集病人組織樣本。回答下列問題：
(1)若要得到正確的檢測結果，正確的操作順序應該是__④②③①__(用數字序號表示)。
(2)操作③中使用的酶是__Taq酶(熱穩定DNA聚合酶)__。PCR反應中的每次循環可分為變性、復性、__延伸__三步，其中復性的結果是__Taq酶從引物起始進行互補鏈的合成__(或：引物通過堿基互補配對和單鏈DNA結合)。
(3)為了做出正確的診斷，PCR反應所用的引物應該能與__兩條單鏈DNA__特異性結合。
(4)PCR(多聚酶鏈式反應)技術是指__一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術__。該技術目前被廣泛地應用于疾病診斷等方面。
解析：(1)PCR技術可用于臨床的病原菌檢測，若要得到正確的檢測結果，正確的操作順序應該是④采集病人組織樣本→②從病人組織樣本中提取DNA→③利用PCR擴增DNA片段→①分析PCR擴增結果。(2)在用PCR技術擴增DNA時，DNA的復制過程與細胞內DNA的復制類似，操作③中使用的酶是Taq酶(熱穩定DNA聚合酶)，PCR反應中的每次循環可分為變性、復性、延伸三步，其中復性的結果是Taq酶從引物起始進行互補鏈的合成(引物通過堿基互補配對和單鏈DNA結合)。(3)DNA復制需要引物，為了做出正確的診斷，PCR反應所用的引物應該能與兩條單鏈DNA特異性結合。(4)據分析可知，PCR(多聚酶鏈式反應)技術是指一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。該技術目前被廣泛地應用于疾病診斷等方面。
8．(2020·江蘇卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側的序列，具體流程如下圖(以EcoRⅠ酶切為例)：
請據圖回答問題：
(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種__限制性內切核酸(或限制)__酶，它通過識別特定的__核苷酸序列__切割特定位點。
(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′—羥基與5′—磷酸間形成__磷酸二酯鍵__；PCR循環中，升溫到95℃是為了獲得__DNA單鏈__；TaqDNA聚合酶的作用是催化__以DNA為模板的DNA子鏈的延伸__。
(3)若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是__②④__(從引物①②③④中選擇，填編號)。
DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′—AACTATGCGCTCATGA—3′②5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′③5′—AGAGGCTACGCATTGC—3′④5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′
(4)對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結果正確的是__B__。
A．5′—AACTATGCG－－－－－－－AGCCCTT—3′
B．5′—AATTCCATG－－－－－－－－CTGAATT—3′
C．5′—GCAATGCGT－－－－－－－TCGGGAA—3′
D．5′—TTGATACGC－－－－－－－－CGAGTAC—3′
解析：(1)EcoRI是一種限制性內切核酸酶，它通過識別特定的核苷酸序列切割特定的位點。(2)DNA連接酶可催化相鄰核苷酸之間的3′—羥基和5′—磷酸之間形成磷酸二酯鍵；PCR循環中，升溫到95℃時，DNA受熱變性后解旋為單鏈；TaqDNA聚合酶是一種耐高溫的依賴于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA鏈為模板的DNA子鏈的延伸。(3)引物是一小段單鏈DNA，引物5′端的堿基可以與DNA兩條鏈的3′端的堿基進行堿基互補配對，可作為DNA復制的起始點，子鏈的延伸方向從5′→3′，據題圖分析，結合已知序列可知，能與片段F左邊配對的引物為④，與右邊配對的引物為②，故步驟Ⅲ選用的PCR引物應當為②④。(4)對PCR產物測序，得到片段F的完整序列，因為片段F是被限制酶EcoRI剪切的兩端，它識別的序列是GAATTC，且在G與A之間切割，所以5′端應該是AATTC，3′端是GAATT，故選B。
9．(2021·廣東卷)非細胞合成技術是一種運用合成生物學方法，在細胞外構建多酶催化體系，獲得目標產物的新技術，其核心是各種酶基因的挖掘、表達等。中國科學家設計了4步酶促反應的非細胞合成路線(如圖)，可直接用淀粉生產肌醇(重要的醫藥食品原料)，以期解決高溫強酸水解方法造成的嚴重污染問題，并可以提高產率。
回答下列問題：
(1)研究人員采用PCR技術從土壤微生物基因組中擴增得到目標酶基因。此外，獲得酶基因的方法還有__從基因文庫中獲取、人工合成法__。(答出兩種即可)
(2)高質量的DNA模板是成功擴增出目的基因的前提條件之一。在制備高質量DNA模板時必須除去蛋白，方法有__鹽析法、酶解法或高溫變性__。(答出兩種即可)
(3)研究人員使用大腸桿菌BL21作為受體細胞、pET20b為表達載體分別進行4種酶的表達。表達載體轉化大腸桿菌時，首先應制備__感受態__細胞。為了檢測目的基因是否成功表達出酶蛋白，需要采用的方法有__抗原—抗體雜交技術__。
(4)依圖所示流程，在一定的溫度、pH等條件下，將4種酶與可溶性淀粉溶液混合組成一個反應體系。若這些酶最適反應條件不同，可能導致的結果是__有的酶失活而使反應中斷__。在分子水平上，可以通過改變__基因的堿基序列__，從而改變蛋白質的結構，實現對酶特性的改造和優化。
解析：(1)分析題意，研究人員從土壤微生物基因組中擴增得到目標酶基因采用了PCR技術，此外獲得酶基因的方法還有從基因文庫中獲取和人工合成法。(2)高質量的DNA模板是成功擴增出目的基因的前提條件之一。在制備高質量DNA模板時必須除去蛋白，可根據DNA和蛋白質的溶解性以及對酶、高溫和洗滌劑的耐受性去除蛋白質，方法有鹽析、酶解法或高溫變性法等。(3)研究人員使用大腸桿菌BL21作為受體細胞、pET20b為表達載體分別進行4種酶的表達。表達載體轉化大腸桿菌時，首先應制備感受態細胞，即利用鈣離子處理大腸桿菌，使其成為感受態細胞，使其易于接受外來的DNA分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表達的產物酶蛋白的化學本質是蛋白質，常用抗原—抗體雜交技術進行檢測。(4)依圖所示流程，在一定的溫度、pH等條件下，將4種酶與可溶性淀粉溶液混合組成一個反應體系。由于酶的作用條件較溫和，若這些酶最適反應條件不同，則可能導致有的酶失活而使反應中斷。在分子水平上，可以通過改變基因的堿基序列，從而改變蛋白質的結構，實現對酶特性的改造和優化。
10．(2020·山東卷，25題)水稻胚乳中含直鏈淀粉和支鏈淀粉，直鏈淀粉所占比例越小糯性越強。科研人員將能表達出基因編輯系統的DNA序列轉入水稻，實現了對直鏈淀粉合成酶基因(Wx基因)啟動子序列的定點編輯，從而獲得了3個突變品系。
(1)將能表達出基因編輯系統的DNA序列插入Ti質粒構建重組載體時，所需的酶是__限制性內切核酸酶和DNA連接酶__,__重組載體進入水稻細胞并在細胞內維持穩定和表達的過程稱為__轉化__。
(2)根據啟動子的作用推測，Wx基因啟動子序列的改變影響了__RNA聚合酶與啟動子的識別和結合__，從而改變了Wx基因的轉錄水平。與野生型水稻相比，3個突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列__不發生__ (填：“發生”或“不發生”)改變，原因是__編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動子__。
(3)為檢測啟動子變化對Wx基因表達的影響，科研人員需要檢測Wx基因轉錄產生的mRNA(WxmRNA)的量。檢測時分別提取各品系胚乳中的總RNA，經__逆轉錄(或反轉錄)__過程獲得總cDNA。通過PCR技術可在總cDNA中專一性的擴增出Wx基因的cDNA，原因是__引物是根據Wx基因的一段已知序列設計合成的(或：引物能與Wx基因的cDNA特異性結合)__。
(4)各品系WxmRNA量的檢測結果如圖所示，據圖推測糯性最強的品系為__品系3__，原因是__品系3的WxmRNA最少，控制合成的直鏈淀粉合成酶最少，直鏈淀粉合成量最少，糯性最強__。
解析：(1)將目的基因與Ti質粒構建基因表達載體時，需要限制酶的切割，將目的基因插入載體時需要DNA連接酶的連接，重組載體進入水稻細胞并在細胞內維持穩定和表達的過程稱為轉化。(2)根據以上分析可知，啟動子是RNA聚合酶識別并結合的位點，如果啟動子序列改變將會影響RNA聚合酶與之結合和識別，進而影響基因的轉錄水平。在真核生物中，編碼蛋白質的序列是基因中編碼區，編碼區中不包括啟動子序列，因此直鏈淀粉合成酶的基因堿基序列中不含有啟動子，因此3個突變品系中Wx基因中控制合成直鏈淀粉酶的氨基酸序列不發生改變。(3)以mRNA為模板合成cDNA的過程為逆轉錄，利用PCR技術擴增Wx基因的cDNA，需要以Wx基因合成的引物，這樣引物能夠在總cDNA中與Wx基因的cDNA特異性結合，從而利用PCR擴增技術專一性擴增出Wx基因的cDNA。(4)識圖分析可知，圖中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直鏈淀粉酶最少，直鏈淀粉合成量最少，因此該水稻胚乳中含的直鏈淀粉比例最小，糯性最強。
11．(2021·河北卷)采礦污染和不當使用化肥導致重金屬鎘(Cd)在土壤中過量積累。利用植物修復技術將土壤中的Cd富集到植物體內，進行后續處理(例如，收集植物組織器官異地妥善儲存)，可降低土壤中Cd的含量。為提高植物對Cd污染土壤的修復能力，研究者將酵母液泡Cd轉運蛋白(YCF1)基因導入受試植物，并檢測了相關指標。
回答下列問題：
(1)為獲取YCF1基因，將酵母細胞的全部DNA提取、切割后與載體連接，導入受體菌的群體中儲存，這個群體稱為__基因組文庫__。
(2)將DNA序列插入Ti質粒構建重組載體時，所需要的兩種酶是__限制酶和DNA連接酶__。構建的重組基因表達載體中必須含有標記基因，其作用是__便于目的基因的篩選和鑒定__。
(3)進行前期研究時，將含有YCF1基因的重組載體導入受試雙子葉植物印度芥菜，采用最多的方法是__農桿菌轉化法__。研究者進一步獲得了轉YCF1基因的不育楊樹株系，采用不育株系作為實驗材料的目的是__避免目的基因在自然界中的擴散__。
(4)將長勢一致的野生型和轉基因楊樹苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后測定植株干重(圖1)及不同器官中Cd含量(圖2)。據圖1可知，與野生型比，轉基因植株對Cd具有更強的__耐性__(填“耐性”或“富集能力”)；據圖2可知，對轉基因植株的__莖葉__進行后續處理對于緩解土壤Cd污染最為方便有效。
(5)已知YCF1特異定位于轉基因植物細胞的液泡膜上。據此分析，轉基因楊樹比野生型能更好地適應高Cd環境的原因是__YCF1可通過主動運輸將Cd離子運到液泡中，提高了細胞液的濃度，有利于植株吸水__。相較于草本植物，采用楊樹這種喬木作為Cd污染土壤修復植物的優勢在于__楊樹具有發達的根系和高大的樹冠，更適應污染礦區等不良環境，同時可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便運輸、利用__(寫出兩點即可)。
解析：(1)為獲取YCF1基因，將酵母細胞的全部DNA提取、切割后與載體連接，導入受體菌的群體中儲存，這個群體含有酵母菌的全部基因，稱為基因組文庫。(2)將DNA序列插入Ti質粒構建重組載體時，需要用限制酶切割供體DNA和質粒，以產生相同的黏性末端，然后用DNA連接酶進行連接?；虮磉_載體中的標記基因可用于目的基因的篩選和鑒定。(3)農桿菌容易侵染雙子葉植物，其質粒中的T－DNA可轉移并插入到受體細胞染色體DNA中，將含有YCF1基因的重組載體導入受試雙子葉植物印度芥菜，采用最多的方法是農桿菌轉化法?？紤]轉基因技術的安全性，采用不育株系作為實驗材料，可避免目的基因在自然界中的擴散。(4)根據分析可知，與野生型比，轉基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，說明轉基因植株在Cd污染的土壤中生長較好，即對Cd具有更強的耐性；據圖2分析，轉基因植株的莖、葉中Cd含量高于野生型，因此對轉基因植株的莖、葉進行后續處理，可使轉基因植株持續發揮富集Cd的作用，對于緩解土壤Cd污染最為方便有效。(5)YCF1特異定位于轉基因植物細胞的液泡膜上，可通過主動運輸將Cd離子運到液泡中，提高了細胞液的濃度，有利于植株吸水，所以轉基因楊樹比野生型能更好地適應高Cd環境。相較于草本植物，楊樹具有發達的根系和高大的樹冠，更適應污染礦區等不良環境，同時可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便運輸、利用，作為Cd污染土壤修復植物更具有優勢。第1節　重組DNA技術的基本工具
新課程標準 核心素養
1．簡述重組DNA技術所需的三種基本工具及其作用。2．認同基因工程的誕生和發展離不開理論研究和技術創新。3．進行DNA的粗提取與鑒定。 1．科學思維——模擬重組DNA分子的操作過程，說出合成新DNA分子的基本原理。2．社會責任——關注基因工程的社會議題，參與討論基礎理論和技術發展如何催生了基因工程。
知識導圖
必備知識·夯實雙基
一、基因工程的概念
1．操作場所：__生物體外__。
2．操作技術：__轉基因__等技術。
3．操作結果：賦予生物新的__遺傳特性__，創造出更符合人們需要的新的__生物類型__和生物產品。
4．操作水平：__DNA分子__水平。
二、DNA重組技術的基本工具
1．限制性內切核酸酶(又稱限制酶)——“分子手術刀”
(1)來源：主要來自__原核生物__。
(2)功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定__核苷酸序列__，并使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的__磷酸二酯鍵__斷開。
(3)結果：產生__黏性末端__或__平末端__。
2．DNA連接酶——“分子縫合針”
(1)作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的__磷酸二酯鍵__。
(2)種類[填表]
　　種類比較　　 E．coliDNA連接酶 T4DNA連接酶
來源 __大腸桿菌__ __T4噬菌體__
特點 只能連接__黏性末端__ 既可以連接黏性末端，又可以連接__平末端__
3．基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
(1)質粒
①質粒的本質：是一種裸露的、結構簡單，獨立于__真核細胞的細胞核__或__原核細胞擬核DNA__之外，并具有__自我復制__能力的環狀雙鏈DNA分子。
②質粒適于作基因運載體的特點
Ⅰ．質粒分子上有一個至多個__限制酶切割__位點，供外源DNA片段插入其中。
Ⅱ．攜帶外源DNA片段的質粒進入受體細胞后，能在細胞中__進行自我復制__，或__整合到受體DNA上__，隨
__受體細胞DNA__同步復制。
Ⅲ．人工改造的質粒常帶有__標記基因__，便于__重組DNA分子的篩選__。
(2)噬菌體、動植物病毒等。
三、DNA的粗提取與鑒定
1．實驗原理
(1)__DNA__不溶于酒精，__蛋白質__溶于酒精。
(2)DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于__2mol/L的NaCl__溶液。
(3)在一定溫度下，DNA遇__二苯胺__試劑會呈現藍色。
2．實驗步驟
(1)稱取30g洋蔥，切碎，加入10mL研磨液，充分研磨。
↓
(2)漏斗中墊__紗布__，將研磨液過濾到燒杯中，__4__ ℃處理，取上清液。
↓
(3)在上清液中加入體積相等的、預冷的__酒精__溶液，靜置2～3min，用玻璃棒沿同一方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去水分。
↓
(4)取兩支20ml的試管編號A、B，各加入2mol/L的__NaCl__溶液5mL，將絲狀物溶于B試管的NaCl溶液中。然后向兩支試管中各加入4mL的__二苯胺試劑__?；靹蚝?，將試管置于__沸水__中加熱5min。
↓
(5)結果觀察：A試管__不變藍__，B試管__變藍色__。
┃┃學霸記憶__■
1．基因工程的基本原理是基因重組，外源DNA能在受體細胞表達的理論基礎是密碼子的通用性。
2．DNA重組技術的基本工具有限制性內切核酸酶、DNA連接酶和使目的基因進入受體細胞的載體。
3．限制性內切核酸酶可識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并在特定位點上切割。
4．E．coliDNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶既能連接黏性末端，也能連接平末端。
5．質粒作為基因工程的載體需具備的條件有：能在宿主細胞內穩定保存并自我復制；具有一個或多個限制酶切割位點；具有標記基因。
6．在基因工程中使用的載體除質粒外，還有噬菌體、動植物病毒等。
7．DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精。
8．DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同。
9．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色。
┃┃活學巧練__■
1．基因工程的原理是基因重組，不過在這里這種變異是定向的。(√)
2．DNA聚合酶也可以用作DNA重組技術的工具。(×)
3．限制酶在原來的原核細胞內對細胞自身有害。(×)
4．不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端相同。(√)
5．DNA連接酶既能連接黏性末端，又能連接平末端。(×)
6．載體的種類有質粒、噬菌體、動植物病毒等，其中動植物病毒必須是DNA病毒。(√)
思考：
1．為什么限制酶主要從原核生物中分離純化而來？推測它在原核生物中的作用是什么？它會不會切割自己的DNA分子？
提示：原核細胞容易受到外源DNA的入侵，原核細胞中的限制酶能夠切割入侵的外源DNA而保護自身。原核細胞中的限制酶不會切割自己的DNA分子，因為酶具有專一性或自己的DNA分子已被修飾而不被識別。
2．限制性內切核酸酶和DNA連接酶的作用是否都體現了酶的專一性？
提示：限制性內切核酸酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開，體現了酶的專一性。E．coliDNA連接酶能將具有互補黏性末端的DNA片段連接起來，對末端的堿基序列沒有要求；T4DNA連接酶既可以連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA分子的平末端，都對末端的堿基序列沒有要求，因此DNA連接酶的作用沒有體現酶的專一性。
3．細胞膜上的載體與基因工程中的載體有什么不同？
提示：(1)化學本質不同：細胞膜上的載體化學成分是蛋白質；基因工程中的載體可能是物質，如質粒(DNA)、λ噬菌體的衍生物，也可能是生物，如動植物病毒等。
(2)功能不同：細胞膜上的載體功能是協助細胞膜控制物質進出細胞；基因工程中的載體是一種“分子運輸車”，把目的基因導入受體細胞。
4．如何檢測(重組)質粒是否導入受體細胞？
提示：含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞，抗性基因在受體細胞內表達，受體細胞對該抗生素產生抗性，因此培養受體細胞的培養基中加入該種抗生素即可篩選。在培養基上，被抗生素殺死的是沒有抗性的受體細胞，沒被殺死的具有抗性的受體細胞得以篩選。
課內探究·名師點睛
知識點?
限制性內切核酸酶(限制酶)—“分子手術刀”
1．作用特點
①切割外源DNA，對自身的DNA不起作用，從而達到保護自身的目的。
②專一性：能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。
2．作用結果：經限制酶切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式——黏性末端和平末端。
①黏性末端：錯位切，在識別序列的中心軸線兩側將DNA分子的兩條鏈分別切開，產生的是黏性末端，如下圖。
②平末端：平切，沿著識別序列的中心軸線切開，產生的是平末端，如下圖。
3．限制酶的識別序列和切割末端的判斷
(1)識別序列的特點：呈現堿基互補對稱，無論是奇數個堿基還是偶數個堿基，都可以找到一條中心軸線，如右圖，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的。如以中心線為軸，兩側堿基互補對稱；以為軸，兩側堿基互補對稱。
(2)同一種限制酶一定能切出相同的黏性末端，相同的黏性末端不一定來自同一種限制酶的切割，但同樣能相互連接。
┃┃典例剖析__■
典例1　下列有關基因工程中限制酶的描述，錯誤的是(　A　)
A．一種限制酶只能識別一種特定的核糖核苷酸序列
B．限制酶的活性受溫度、pH的影響，總有一個最合適的條件
C．限制酶能破壞相鄰脫氧核苷酸之間的化學鍵
D．限制酶不只存在于原核生物中，其合成場所是核糖體
解析：限制酶只能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的脫氧核苷酸序列，不能識別RNA分子的核糖核苷酸序列，A項錯誤；同其他的酶一樣，限制酶同樣受溫度和pH的影響，而且具有發揮最大催化效率的最適溫度和最適pH，B項正確；限制酶催化的是特定部位磷酸二酯鍵的斷裂，屬于水解反應，C項正確；限制酶主要從原核生物中分離純化，也有來自真核生物的，其本質是蛋白質，在核糖體上合成，D項正確。
┃┃變式訓練__■
1．限制酶是一種核酸切割酶，可辨識并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下圖為四種限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的辨識序列。箭頭表示每一種限制酶的特定切割部位，其中哪兩種限制酶所切割出來的DNA片段末端可以互補黏合？其正確的末端互補序列應該為(　D　)
A．BamHⅠ和EcoRⅠ；末端互補序列為—AATT—
B．BamHⅠ和HindⅢ；末端互補序列為—GATC—
C．EcoRⅠ和HindⅢ；末端互補序列為—AATT—
D．BamHⅠ和BglⅡ；末端互補序列為—GATC—
解析：A項中BamHⅠ切割出來的末端序列為—GATC—，EcoRⅠ切割出來的末端序列為—AATT—，兩者不能互補黏合；B項中HindⅢ切割出來的末端序列為—AGCT—，與BamHⅠ切割出的末端序列不能互補黏合；同理可推出C項所示兩種限制酶所切割出來的末端也不能互補黏合，只有D項所示兩種限制酶所切割出來的末端才能互補黏合。
知識點?
與DNA分子相關的幾種酶的分析
1．限制酶與DNA連接酶的比較
項目 限制酶 DNA連接酶
不同點 作用 使特定部位的磷酸二酯鍵斷裂 在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵
應用 用于提取目的基因和切割載體 用于基因表達載體的構建
關系
2．DNA連接酶與DNA聚合酶的比較
種類 DNA連接酶 DNA聚合酶
相同點 催化形成磷酸二酯鍵
不同點 模板 不需要模板 需要以DNA的一條鏈為模板
作用過程 在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵 將單個核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羥基上，形成磷酸二酯鍵
作用結果 形成完整的DNA分子 形成DNA的一條鏈
用途 基因工程等 DNA復制
　　3．限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、DNA水解酶、解旋酶的作用部位圖解
(1)作用于磷酸二酯鍵的酶：限制酶(a斷開)、DNA連接酶(a形成)和DNA聚合酶(a形成)、DNA水解酶(a斷開)。
(2)作用于b(氫鍵)的酶：解旋酶。
知識貼士
氫鍵的形成是由于分子間的作用力，其斷裂與重新形成均與限制酶、DNA連接酶無關。
┃┃典例剖析__■
典例2　下列關于DNA連接酶作用的敘述，正確的是(　B　)
A．將單個核苷酸加到某個DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵
B．將斷開的2個DNA片段的骨架連接起來，重新形成磷酸二酯鍵
C．連接2條DNA鏈上堿基之間的氫鍵
D．只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端連接起來，而不能將兩者之間的平末端進行連接
解析：DNA連接酶和DNA聚合酶都能催化2個脫氧核苷酸分子之間形成磷酸二酯鍵。但DNA連接酶是在2個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，將2個DNA片段連接成重組DNA分子；DNA聚合酶是將單個的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯鍵，合成新的DNA分子。
┃┃變式訓練__■
2.1972年伯格首先在體外進行了DNA改造的研究，成功地構建了第一個體外重組DNA分子。下列相關敘述正確的是(　B　)
A．不同的DNA分子必須用同一種限制酶切割，才能產生相同的黏性末端
B．DNA連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉錄酶都能催化形成磷酸二酯鍵
C．當限制酶在它識別序列的中心軸線兩側將DNA的兩條鏈分別切開時，產生的是平末端
D．限制酶和DNA連接酶的作用部位不同
解析：有些限制酶的識別序列不同，但可以產生相同的黏性末端，A項錯誤；DNA連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉錄酶都能催化形成磷酸二酯鍵，B項正確；當限制酶在它識別序列的中心軸線兩側將DNA的兩條鏈分別切開時，產生的是黏性末端，C項錯誤；限制酶和DNA連接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯鍵，D項錯誤。
知識點?
基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
1．載體的功能
(1)作為運載工具將目的基因轉運到宿主細胞內。
(2)利用它在受體細胞內對目的基因進行大量復制。
2．常用的載體——質粒
(1)存在場所：細菌、真菌等生物的細胞質。
(2)本質：環狀DNA分子。
(3)特點：含有標記基因。
(4)載體必須具備的條件
①能在受體細胞內穩定保存并大量復制。
②有多個限制酶切割位點，以便與外源基因連接。
③具有某些標記基因，以便進行篩選。
④載體應對受體細胞無毒害作用，否則受體細胞將受到損傷甚至死亡。
知識貼士
基因工程中的載體與載體蛋白的區別
基因工程中的載體 載體蛋白
來源 細菌的質粒、噬菌體、動植物病毒 細胞膜上的蛋白質
作用 將目的基因轉移到宿主細胞中，并能在宿主細胞中對目的基因進行大量復制 運載要進出細胞的某些物質
┃┃典例剖析__■
典例3　作為基因的運輸工具——載體，必須具備的條件之一及理由是(　A　)
A．能夠在受體細胞中穩定地保存下來并大量復制，以便提供大量的目的基因
B．具有多個限制酶切點，以便于目的基因的表達
C．具有某些標記基因，以使目的基因能夠與其結合
D．對受體細胞無傷害，以便于重組DNA的鑒定和選擇
解析：作為載體必須能夠在受體細胞中穩定地保存下來并大量復制，以便提供大量的目的基因，A正確；作為載體必須具有一個至多個限制酶切點，以便于目的基因的插入，而不是表達，B錯誤；作為載體必須具有標記基因，以便于重組DNA的鑒定和選擇，C錯誤；作為載體必須是安全的，對受體細胞無害，以便受體細胞能進行正常的生命活動，D錯誤。
┃┃變式訓練__■
3．下列關于質粒運載體的說法，正確的是(　A　)
①使用質粒運載體是為了把目的基因導入受體細胞并使之在受體細胞中穩定存在
②質粒運載體只能與目的基因重組后進入細胞
③質粒運載體可能是根據細菌或者病毒的DNA改造的
④質粒運載體的復制和表達也遵循中心法則
⑤質粒運載體只有把目的基因整合到受體細胞的DNA中才能表達
⑥沒有限制酶就無法使用質粒運載體
A．①④⑥　　　　　 B．②③④
C．①②⑤ D．③④⑥
解析：使用質粒運載體是為了把目的基因導入受體細胞，并使目的基因在宿主細胞中穩定保存，①正確；質粒運載體本身也可以進入細胞，不是與目的基因重組后才能進入細胞，②錯誤；質粒運載體可能是根據細菌DNA改造的，而病毒沒有質粒，③錯誤；質粒運載體的復制和表達也遵循中心法則，這是基因工程設計的原理之一，④正確；質粒運載體將目的基因導入受體細胞并穩定存在即可表達，不一定要把目的基因整合到受體細胞的DNA中才能表達，⑤錯誤；質粒是環狀DNA分子，將目的基因與質粒重組需要使用限制酶，因此沒有限制酶就無法使用質粒運載體，⑥正確，綜上所述①④⑥正確，故選A。
知識點?
DNA的粗提取與鑒定
1．實驗材料的選取
原則上，凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。選取的材料不同，提取DNA的方法可能稍有不同。
2．方法步驟
(1)粗提取DNA
(2)鑒定DNA
試管編號 A(對照組) B(實驗組)
步驟1 2mol·L－1的NaCl溶液5mL 2mol·L－1的NaCl溶液5mL
步驟2 不進行任何處理 加絲狀物或沉淀物
步驟3 加4mL二苯胺試劑，混勻 加4mL二苯胺試劑，混勻
步驟4 沸水浴5min 沸水浴5min
實驗現象 溶液不變藍色 溶液逐漸變為藍色
實驗結論 DNA在沸水浴的情況下遇二苯胺會被染成藍色
　　特別提醒：(1)粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白質和脂質。
(2)不用哺乳動物的血液作為實驗材料，這是因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和細胞器，不含DNA。
(3)加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
(4)沉淀DNA時必須用冷酒精。預冷的酒精溶液具有以下優點：一是可抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子運動，使DNA易形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少斷裂。
(5)二苯胺試劑要現配現用，否則會影響鑒定的效果。
┃┃典例剖析__■
典例4　下列關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是(　B　)
A．該實驗不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料
B．DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它不溶于2mol·L－1的NaCl溶液
C．該實驗中加入體積分數為95%的預冷酒精可用來析出DNA
D．用二苯胺試劑鑒定DNA需要進行沸水浴加熱
解析：由于哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和細胞器，因此不能作為提取DNA的材料，A正確；DNA可溶解在2mol·L－1的NaCl溶液中，B錯誤；DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些蛋白質溶于酒精，因此提取DNA時，加入預冷的、體積分數為95%的酒精溶液可以除去蛋白質、析出DNA，C正確；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會呈現藍色，D正確。
┃┃變式訓練__■
4．在“DNA的粗提取和鑒定”實驗中，甲、乙、丙、丁四個小組除下表中所列處理方法不同外，其他操作步驟均正確，但實驗結果卻不同。下列有關敘述不正確的是(　D　)
組別 實驗材料 提取核物質時加入的溶液 去除雜質時加入的溶液 DNA鑒定時加入的試劑
甲 雞血 蒸餾水 體積分數為95%的酒精溶液(25℃) 二苯胺
乙 菜花 蒸餾水 體積分數為95%的酒精溶液(冷卻) 雙縮脲試劑
丙 豬血 蒸餾水 體積分數為95%的酒精溶液(冷卻) 二苯胺
丁 雞血 蒸餾水 體積分數為95%的酒精溶液(冷卻) 二苯胺
　　A．實驗材料選擇錯誤的組別是丙
B．沸水浴后試管中溶液顏色變藍的組別是甲、丁
C．甲組實驗現象差的原因是25℃的酒精溶液對DNA的凝集效果差
D．乙組實驗不成功僅因為在鑒定時加入了雙縮脲試劑
解析：雞血、菜花細胞中都含有DNA，而豬是哺乳動物，其成熟的紅細胞中不含DNA，A項正確；甲、乙、丁的實驗材料中都含有DNA，但乙為植物，將植物細胞放入蒸餾水中時，植物細胞不會吸水漲破，且DNA應該用二苯胺鑒定，而不能用雙縮脲試劑鑒定，因此沸水浴后試管中溶液顏色變藍的組別是甲、丁，但因為25℃的酒精溶液對DNA的凝集效果差，所以甲組藍色淺，B、C項正確，D項錯誤。
指點迷津·撥云見日
選擇限制酶的方法
根據目的基因兩端的限制酶切割位點、質粒上的限制酶切割位點以及是否破壞目的基因和標記基因來確定限制酶的種類。
(1)應選擇酶切位點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ；不能選擇酶切位點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。
(2)為避免目的基因及質粒的自身環化、正向連接、反向連接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和質粒(雙酶切)，如圖甲可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切割位點)。
(3)切割質粒的限制酶不能同時切開質粒上的所有標記基因，即至少要保留一個標記基因，以用于重組DNA的鑒定和選擇，如圖乙中的質粒不能使用SmaⅠ切割。
知識貼士
不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一個DNA分子用不同限制酶切割，產生的黏性末端一般不相同。
┃┃典例剖析__■
典例5　利用某目的基因(圖甲)和P1噬菌體載體(圖乙)構建重組DNA。限制性內切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位點分別如下圖所示(已知這三種限制酶切割產生的黏性末端不同)。下列分析錯誤的是(　D　)
A．構建重組DNA時，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體
B．構建重組DNA時，可用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體
C．圖乙中的P1噬菌體載體只用EcoRⅠ切割后，含有兩個游離的磷酸基團
D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，再用DNA連接酶連接，只能產生一種重組DNA
解析：構建重組DNA時，如果用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，目的基因兩端將形成不同的黏性末端，同樣P1噬菌體載體也形成這兩種黏性末端，因此它們可構成重組DNA，A項正確；分析圖甲，HindⅢ的酶切位點在第二個EcoRⅠ的酶切位點的左側，因此用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段，目的基因兩端將形成不同的黏性末端，同樣用EcoRⅠ和HindⅢ切割P1噬菌體載體也形成這兩種黏性末端，因此它們可構成重組DNA，B項正確；P1噬菌體載體為環狀DNA，其上只含有一個EcoRⅠ的酶切位點，因此用EcoRⅠ切割后，該環狀DNA分子變為鏈狀DNA分子，因每條DNA單鏈各含有一個游離的磷酸基團，故切割后含有兩個游離的磷酸基團，C項正確；用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體后形成的黏性末端相同，可正向連接或反向連接，不止能產生一種重組DNA，D項錯誤。
解疑答惑
?從社會中來 P70
提示：用到的“分子工具”：限制性內切核酸酶、DNA連接酶、載體。限制性內切核酸酶的特征：準確切割DNA分子，得到所需要的目的基因。DNA連接酶的特征：能將目的基因連接到載體上。載體的特征：能將目的基因導入受體細胞中。
?旁欄思考1 P71
提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是其在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，限制酶就是一種防御性工具。當外源DNA入侵時，原核生物會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，使之失效，從而保護自身的作用。
?旁欄思考2 P72
提示：不是一回事?；蚬こ讨兴玫倪B接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為E．coliDNA連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到的，稱為T4DNA連接酶。這兩種連接酶催化反應基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口，而不能連接單鏈DNA。DNA連接酶和DNA聚合酶都是催化形成磷酸二酯鍵(在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基團的羥基之間形成)，那么，二者的差別主要表現如下：
(1)DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。
(2)DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。
此外，二者雖然都是由蛋白質構成的酶，但組成和性質各不相同。
?思考·討論 P73
1．提示：“剪刀”代表限制酶，“透明膠條”代表DNA連接酶。
2．提示：如果制作的黏性末端的堿基不能互補配對，可能是剪切位點或連接位點選擇不對(也可能是其他原因)。比如在書寫將要重組的兩個DNA分子時，一定要具有同一種限制酶的識別和切割位點，這樣切割后才會露出相同的黏性末端；否則黏性末端不同，堿基就無法配對。
3．提示：不能。真正的基因是有遺傳效應的DNA片段，且含有幾百至幾千個不等的堿基對。
?探究·實踐 P74
結果分析與評價
1．提示：觀察提取的DNA顏色：如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質較多。
二苯胺法鑒定：二苯胺鑒定出現藍色說明實驗基本成功，如果不呈現藍色，可能所提取的DNA含量低，或是實驗操作中出現錯誤，需要重新提取。
2．提示：本實驗提取的DNA粗制品中有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質。
3．提示：本實驗可以采取分組的方式進行?？梢赃x取不同的實驗材料；也可以查閱資料了解其他提取DNA的方法，對同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實驗結果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺試劑顯色的深淺等，看看哪種實驗材料、哪種提取方法的效果更好。
進一步探究
提示：DNA純化常用方法：將DNA黏稠物再溶解，繼續用物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物，仍舊沿一個方向不停攪拌3min，使DNA充分溶解，以免損失。用3～4層紗布進行過濾(或離心)，濾去雜質，收集含有DNA的濾液。向濾液中貼壁緩慢加入50mL預冷的體積分數為95%的乙醇，并用玻璃棒朝一個方向緩慢、均勻地攪拌，溶液中會出現DNA絲狀物。
此外，還有許多其他方法。例如，添加質量分數為25%的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液，使蛋白質變性后與DNA分開。隨后，加入氯仿—異丙醇混合液(體積比為24∶1)，通過離心將蛋白質及其他雜質除去，取上清液?？芍貜蜕鲜霾僮鲙状危敝辽锨逡鹤兂赏该鞯酿こ硪后w。此外苯酚可以迅速使蛋白質變性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚處理后，離心分層，DNA溶于上層水相，蛋白質變性存在于酚層中，這時可用分液漏斗或吸管等儀器將二者分開。
?練習與應用 P74
一、概念檢測
1．C　提示：DNA連接酶的作用是連接兩個DNA分子片段，既能連接黏性末端，也能連接平末端，形成磷酸二酯鍵。DNA聚合酶的作用是將單個脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵。
2．A　提示：基因工程中使用的載體有質粒、噬菌體、動植物病毒等。
二、拓展應用
1．提示：細菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA，是因為細菌在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別序列，或者通過甲基化將甲基轉移到限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。
2．提示：(1)限制酶XbaⅠ。因為限制酶XbaⅠ切割B片段產生的黏性末端與限制酶SpeⅠ切割A片段產生的黏性末端相同。
(2)識別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶。同尾酶使構建載體時，切割位點的選擇范圍擴大。例如，我們選擇了用某種限制酶切割載體，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有該限制酶的識別序列，那么用該限制酶切割含有目的基因的DNA片段時，目的基因就很可能被切斷；這時可以考慮用合適的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的識別序列)來獲取目的基因。
訓練鞏固·課堂達標
1．下列敘述符合基因工程概念的是(　B　)
A．在細胞內直接將目的基因與宿主細胞的遺傳物質進行重組，賦予生物新的遺傳特性
B．將人的干擾素基因與質粒重組后導入大腸桿菌，獲得能產生人的干擾素的菌株
C．用紫外線照射青霉菌，使其DNA發生改變，通過篩選獲得青霉素高產菌株
D．自然界中天然存在的噬菌體自行感染細菌后，其DNA整合到細菌DNA上
解析：基因工程又叫重組DNA技術，是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性，從而創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品?；蚬こ滩荒茉谏锛毎麅戎苯訉⒛康幕蚺c宿主細胞的遺傳物質進行重組，A不符合基因工程的概念；將人的干擾素基因與質粒重組后導入大腸桿菌，獲得能產生人的干擾素的菌株，B符合基因工程的概念；用紫外線照射青霉菌，使其DNA發生改變，通過篩選獲得青霉素高產菌株，屬于誘變育種，C不符合基因工程的概念；自然界中天然存在的噬菌體自行感染細菌，并將自身DNA整合到細菌DNA上，屬于基因重組，D不符合基因工程的概念。
2．下列關于限制性內切核酸酶(限制酶)的敘述，正確的是(　C　)
A．均來源于原核生物
B．識別序列均由6個核苷酸組成
C．特異性表現在識別和切割兩個方面
D．也可識別RNA分子的特定核苷酸序列
解析：限制酶主要是從原核生物中分離純化出來的，A錯誤；大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，也有少數限制酶的識別序列由4個、8個或其他數量的核苷酸組成，B錯誤；限制酶能識別特定的核苷酸序列，并切割特定核苷酸之間的磷酸二酯鍵，C正確；限制酶可識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，不能識別RNA分子的特定核苷酸序列，D錯誤。
3．下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實驗中幾個重要操作的示意圖，下列敘述錯誤的是(　B　)
A．圖①的原理是DNA不溶于酒精，而某些蛋白質可溶于酒精
B．圖①和圖③都需要用玻璃棒沿一個方向輕緩攪拌，便于DNA的析出并保持其結構完整
C．若圖③操作后接圖②操作，則DNA會留在濾液中
D．若圖④操作后接圖②操作，則DNA會留在紗布上
解析：DNA不溶于酒精，95%的冷酒精凝集效果最佳，所以圖①的原理是DNA不溶于酒精，某些蛋白質可溶于酒精，以便除去溶于酒精的雜質，提取含雜質較少(或較純凈)的DNA，A正確；圖①玻璃棒沿逆時針方向攪拌，目的是提取出含雜質較少的DNA，圖③玻璃棒沿逆時針方向攪拌，目的是加速細胞吸水破裂，B錯誤；圖③操作是加入蒸餾水，破碎細胞，圖②操作是過濾，獲取含DNA的濾液，使DNA留在濾液中，C正確；圖④操作是去除濾液中雜質，析出DNA，圖②操作是過濾，將DNA留在紗布上，D正確。
4．(不定項)以下關于基因工程的操作工具，說法錯誤的是(　ABD　)
A．限制酶可以切割DNA和RNA
B．DNA連接酶能將兩堿基間通過氫鍵連接起來
C．載體的作用是將目的基因導入受體細胞使之穩定存在并表達
D．切割質粒的限制酶均能特異性地識別6個核苷酸
解析：一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切割位點上切割DNA分子，A錯誤；DNA連接酶的作用是將兩個DNA片段通過磷酸二酯鍵連接起來，B錯誤；載體的作用是攜帶目的基因導入受體細胞中，使之穩定存在并表達，C正確；大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，少數限制酶的識別序列由4個、8個或其他數量的核苷酸組成，D錯誤。第3節　基因工程的應用
新課程標準 核心素養
1．舉例說出基因工程在農牧業、醫藥衛生和食品工業等方面的應用。2．認同基因工程的應用價值。3．關注基因工程的進展。 1．生命觀念——舉例說出植物基因工程、動物基因工程的成果及其給人類帶來的影響。2．社會責任——用基因工程培育優良品種或細胞產品，造福人類。
知識導圖
必備知識·夯實雙基
一、基因工程在農牧業方面的應用
1．轉基因抗蟲植物
(1)技術方法：從某些生物中分離出具有__抗蟲功能__的基因，將它導入作物中，培育出具有抗蟲性的作物。
(2)實例：抗蟲棉花、玉米、大豆、水稻和馬鈴薯等。
2．轉基因抗病植物
(1)技術方法：將來源于__病毒、真菌等__的抗病基因導入植物中，培育出轉基因抗病植物。
(2)實例：轉基因抗病毒甜椒、番木瓜和煙草等。
3．轉基因抗除草劑植物
(1)技術方法：將__降解或抵抗某種除草劑__的基因導入作物，可培育抗除草劑的作物品種。
(2)實例：轉基因抗除草劑玉米、大豆、油菜和甜菜等。
4．改良植物的品質
(1)技術方法：將__必需氨基酸含量多的蛋白質__編碼基因導入植物中，可以提高這種氨基酸的含量。
(2)實例：轉基因玉米中賴氨酸的含量比對照高30%。
5．提高動物的生長速率
(1)技術方法：將__外源生長激素__基因導入動物體內，提高動物的生長速率。
(2)實例：轉基因鯉魚。
6．改善畜產品的品質
(1)技術方法：將__腸乳糖酶__基因導入奶?；蚪M。
(2)實例：乳汁中乳糖含量大大降低的轉基因奶牛。
二、基因工程在醫藥衛生領域的應用
1．技術方法
(1)對微生物或動植物的細胞進行__基因改造__，使它們能夠生產藥物。
(2)利用乳腺生物反應器生產藥物：將__藥用蛋白__基因與乳腺中特異表達的基因的__啟動子__等調控元件重組在一起，通過__顯微注射__導入哺乳動物的受精卵中，培育出的轉基因動物通過__分泌乳汁__生產所需要的藥物。
(3)培育移植器官：在器官供體的基因組中導入某種__調節因子__抑制__抗原決定__基因的表達或設法除去__抗原決定__基因，然后再結合__克隆__技術，培育出不會引起__免疫排斥__反應的轉基因克隆器官。
2．實例：重組人干擾素、促紅細胞生成素、抗凝血酶、血清白蛋白等。
三、基因工程在食品工業方面的應用
1．技術方法：利用基因工程菌生產食品工業用__酶__、__氨基酸__和__維生素__等。例如將編碼牛凝乳酶的基因導入大腸桿菌、黑曲霉或酵母菌的基因組中，再通過__工業發酵__生產凝乳酶。
2．實例：淀粉酶、脂酶、天冬氨酸和苯丙氨酸。
┃┃學霸記憶__■
1．將來源于某些病毒、真菌的抗病基因導入植物中，培育轉基因抗病植物。
2．將外源生長激素基因導入鯉魚，可提高鯉魚的生長速度。
3．將藥用蛋白基因導入大腸桿菌或酵母菌構建工程菌可生產藥物。
4．將藥用蛋白基因與乳腺中特異表達的基因的啟動子等調控元件重組成表達載體導入哺乳動物的受精卵中可構建乳腺生物反應器。
5．在器官供體的基因組中導入某種調節因子，以抑制抗原決定基因的表達，或設法除去抗原決定基因，然后結合克隆技術，可培育出不會引起免疫排斥反應的轉基因克隆器官。
┃┃活學巧練__■
1．農業害蟲不會對轉基因抗蟲作物產生抗性。(×)
2．培育轉基因抗病植物的目的基因主要來源于病毒、真菌。(√)
3．基因工程中，要培育轉基因植物和動物，選用的受體細胞都是受精卵。(×)
4．利用工程菌可生產人的胰島素等某些激素。(√)
5．乳腺反應器就是把藥用蛋白基因導入動物的乳腺細胞中。(×)
思考：
1．為了生產藥物，常把藥用蛋白基因構建的表達載體導入大腸桿菌或酵母菌細胞中構建工程菌，選用細菌或酵母菌作為受體細胞的優點有哪些？
提示：細菌和酵母菌繁殖快，多為單細胞，遺傳物質相對少，生產能力大等。
2．在研制膀胱生物反應器時，應使藥用蛋白基因在什么細胞中特異表達？它與乳腺生物反應器有什么相同和不同點？
提示：應使藥用蛋白基因在膀胱上皮細胞中特異表達。相同點是收集藥用蛋白較容易，且不會對動物造成傷害。不同點是乳腺生物反應器必須是處于生殖期的雌性動物才可生產藥用蛋白，而膀胱生物反應器則是任何生長期的雌雄動物均可生產。
課內探究·名師點睛
知識點?
植物基因工程的應用
1．植物基因工程的應用
項目 外源基因類型 成果舉例
抗蟲轉基因植物 抗蟲基因：Bt抗蟲蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、植物凝集素基因 抗蟲的棉花、水稻、玉米
抗病轉基因植物 ①抗病毒基因：病毒外殼蛋白基因、病毒復制酶基因②抗真菌基因：幾丁質酶基因、抗毒素合成基因 抗病毒的煙草、小麥、番茄、甜椒
抗逆轉基因植物 抗逆基因：調節細胞滲透壓基因、抗凍蛋白基因、抗除草劑基因 抗鹽堿和抗干旱的煙草、抗寒番茄、抗除草劑的大豆
改良品質的轉基因植物 優良性狀基因：提高必需氨基酸含量的蛋白質編碼基因、控制番茄成熟的基因、與花青素代謝有關的基因 高賴氨酸玉米、耐儲存番茄、新花色矮牽牛
2．轉基因植物中的目的基因
(1)目的基因都是來自其他生物的能表現出優良性狀的外源基因，并不都是來自細菌、病毒等微生物，如抗凍蛋白基因來自魚類。
(2)有的目的基因通過控制蛋白質的合成，直接控制生物的某些性狀，這反映了基因與性狀的直接關系；有的目的基因通過控制酶的合成來控制代謝，進而控制生物的性狀，這體現的是基因和性狀的間接關系。
(3)注意“抗蟲”和“抗病”的區別，二者可以分別通過害蟲接種和病毒(或真菌等)接種來進行個體水平的檢測。
┃┃典例剖析__■
典例1　目前人類利用基因工程的方法成功培育出轉基因抗蟲棉，下列說法正確的是(　C　)
A．蘇云金芽孢桿菌的Bt抗蟲蛋白基因與質粒結合后直接進入棉花的葉肉細胞表達
B．抗蟲基因導入棉花葉肉細胞后，可通過傳粉、受精的方法，使抗蟲性狀穩定遺傳下去
C．標記基因的作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因
D．連續種植轉基因抗蟲棉不會改變棉鈴蟲的抗性
解析：重組質粒形成后需要通過農桿菌轉化法等方法導入棉花的葉肉細胞；如果抗蟲基因導入棉花葉肉細胞的細胞質中，轉基因棉花的花粉中不含該基因，如果導入細胞核基因中，該轉基因植株相當于雜合子，后代會發生性狀分離；抗蟲棉的選擇作用使具有抗性突變的棉鈴蟲生存下來，經過長時間積累，棉鈴蟲的抗性會增強。
┃┃變式訓練__■
1．北極比目魚中有抗凍基因，該基因編碼的抗凍蛋白具有11個氨基酸的重復序列，該序列重復次數越多，抗凍能力越強。下圖是獲取轉基因抗凍番茄植株的過程示意圖，下列有關敘述正確的是(　D　)
A．過程①是獲取抗凍基因的過程，用到的酶只有限制酶
B．在重組質粒上，抗凍基因首端和末端一定具有啟動子和終止子，啟動和終止翻譯的進程
C．過程②用到的質粒是農桿菌的Ti質粒，將重組質粒轉入農桿菌的目的是篩選重組質粒
D．根據抗凍基因制作的DNA探針，可以用來檢測轉基因抗凍番茄植株中目的基因的存在
解析：據題圖可知，該轉基因技術操作中，獲取目的基因的方法是利用抗凍基因(目的基因)的mRNA逆轉錄合成cDNA，進而獲取目的基因，需要的酶有逆轉錄酶和限制酶等，A項錯誤；目的基因首端和末端的啟動子和終止子均是DNA片段，分別啟動和終止轉錄的進程，B項錯誤；重組質粒轉入農桿菌的目的是通過農桿菌轉化法將目的基因導入番茄細胞中，C項錯誤；檢測目的基因是否導入受體細胞、通常是用目的基因制作DNA探針進行檢測，D項正確。
知識點?
動物基因工程的應用
項目 外源基因類型 成果舉例
提高生長速率的轉基因動物 外源生長激素基因 轉基因綿羊、鯉魚
改善畜產品品質的轉基因動物 腸乳糖酶基因 乳汁中含乳糖較少的轉基因牛
生產藥物的轉基因動物 藥用蛋白基因＋乳腺中特異表達的基因的啟動子等調控元件 乳腺生物反應器
作器官移植供體的轉基因動物 外源的抑制抗原決定基因表達的調節因子或除去供體的抗原決定基因 無免疫排斥的轉基因豬
┃┃典例剖析__■
典例2　轉基因技術可以改良動物品種，生產人類需要的藥用蛋白。下列符合生產藥用蛋白的是(　D　)
A．養殖含生長激素基因鮭魚
B．養殖能抗口蹄疫病毒的轉基因兔
C．養殖含乳糖酶基因的轉基因牛
D．從牛乳汁中獲得人血清白蛋白
解析：養殖含生長激素基因的轉基因鮭魚只能獲得生長更快的鮭魚，A錯誤；養殖能抗口蹄疫病毒的轉基因兔，只能獲得具有能抗口蹄疫病毒能力的兔，B錯誤；養殖含乳糖酶基因的轉基因牛，只能使牛乳汁中乳糖含量降低，C錯誤；從牛乳汁中獲得人血清白蛋白，血清白蛋白可用于治療失血性休克、腦水腫、腎病等，D正確。
┃┃變式訓練__■
2．下列關于用轉基因動物作器官移植供體的研究的敘述，不正確的是(　C　)
A．器官短缺和免疫排斥是目前制約人體器官移植的兩大難題
B．豬的內臟構造、大小和血管分布與人的極為相似
C．靈長類動物體內隱藏的、可導致人類疾病的病毒少于豬
D．無論以哪種動物作為供體，都需要在其基因組中導入某種調節因子以抑制抗原決定基因的表達，或設法除去抗原決定基因
解析：目前，人體移植器官短缺是一個世界性難題。要實現器官移植最大的難題是免疫排斥，A項正確。豬的內臟構造、大小、血管分布與人的極為相似，而且與靈長類動物相比，豬體內隱藏的、可導致人類疾病的病毒要少得多，B項正確，C項錯誤。目前，科學家正嘗試利用基因工程技術對豬的器官進行改造，采用的方法是在器官供體的基因組中導入某種調節因子，以抑制抗原決定基因的表達，或設法除去抗原決定基因，然后再結合克隆技術，培育出不會引起免疫排斥反應的轉基因克隆豬器官，D項正確。
指點迷津·撥云見日
乳腺生物反應器與工程菌生產藥物的比較
名稱 乳腺生物反應器 工程菌
含義 是指使外源基因在哺乳動物的乳腺中特異表達，利用動物的乳腺組織生產藥物蛋白 是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類細胞株系
基因結構 動物基因的結構與人類基因的結構基本相同 細菌和酵母菌等生物基因的結構與人類基因的結構有較大差異
基因表達 合成的藥物蛋白與天然蛋白質相同 細菌細胞內沒有內質網、高爾基體等細胞器，產生的藥物蛋白可能沒有活性
受體細胞 動物的受精卵 微生物細胞
導入目的基因的方式 顯微注射法 感受態細胞法(Ca2＋處理法)
生產條件 不需嚴格滅菌，溫度等外界條件對其影響不大 需嚴格滅菌，嚴格控制工程菌所需的溫度、pH、營養物質濃度等外界條件
藥物提取 從動物乳汁中提取 從微生物細胞中提取
┃┃典例剖析__■
典例3　下列有關利用乳腺生物反應器與微生物生產藥物的敘述，錯誤的是(　D　)
A．前者在乳汁中提取藥物，后者在細胞中提取
B．兩者都是基因工程在醫藥衛生領域的應用
C．前者合成的蛋白質可加工成熟，后者合成的蛋白質一般不能加工成熟
D．動物和微生物的基因結構與人體的基因結構均相同
解析：前者在乳汁中提取藥物，后者在細胞中提取；乳腺生物反應器和微生物生產藥物都是基因工程在醫藥衛生領域的應用；前者合成的蛋白質可加工成熟，工程菌一般是原核生物，合成的蛋白質一般不能加工成熟；真核生物基因的編碼區有內含子和外顯子之分，原核生物基因的編碼區無內含子與外顯子。
解疑答惑
?從社會中來 P87
提示：在農牧業方面生產轉基因抗蟲植物、轉基因抗病植物、轉基因抗除草劑植物、改良植物的品質、提高動物的生長速率、改善畜產品的品質。在醫藥衛生領域，除生產胰島素外，還生產干擾素、抗凝血酶等藥物。在食品工業方面，生產食品工業用酶、氨基酸和維生素等。
?異想天開 P91
提示：可能會遭到他人歧視。這就需要人們調整自己的觀念，適應科技、社會的發展、進步。(開放性問題，答案合理即可)
?到社會中來 P92
1．提示：截至2019年年底，我國批準發放過轉基因耐儲藏番茄、轉基因抗蟲棉、改變花色的轉基因矮牽牛、轉基因抗病辣椒、轉基因抗病番木瓜、轉基因抗蟲水稻、轉植酸酶基因玉米以及轉基因耐除草劑大豆的生產應用安全證書；批準了轉基因棉花、大豆、玉米、油菜、甜菜和番木瓜的進口安全證書，但我國進口的基本上是轉基因棉花的纖維，其他進口轉基因作物的用途僅限于用作加工原料；我國沒有批準任何一種轉基因糧食作物種子進口到我國境內商業化種植。
2．提示：根據實際情況回答。
?練習與應用 P92
一、概念檢測
1．C　提示：生長激素基因在轉錄時需要RNA聚合酶，不需要解旋酶和DNA連接酶，A項錯誤；發酵產生的生長激素屬于大腸桿菌的次生代謝物，B項錯誤；通過基因工程技術可以將人的生長激素基因導入大腸桿菌中，并且能穩定的遺傳，C項正確；大腸桿菌質粒標記基因中嘌呤與嘧啶含量相等，并且質粒為DNA，DNA中不含尿嘧啶，D項錯誤。
2．A　提示：用人工誘變獲得青霉菌突變菌株大量生產青霉素，不屬于基因工程的應用。
二、拓展應用
1．提示：(1)①限制酶、DNA連接酶?、郯珷颗！、苻D基因矮牽牛對草甘膦產生了一定的抗性。
(2)①對照組為非轉基因矮牽牛。②理論上增加轉入的外源EPSP合酶基因的數量，矮牽牛體內EPSP合酶的表達水平會升高，它對草甘膦的抗性會增強。思路：將不同拷貝數的EPSP合酶基因分別轉入矮牽牛細胞中，培育轉基因植株，比較它們對草甘膦抗性的差異。
2．提示：開放性題目，自由想象！例如，基因工程目前來說是對基因片段進行剪接和采取，但是也已經能夠在一定程度上改變生物的基本性狀。科學家們認為，在未來只要我們能夠突破微觀層面的操作，就能夠對人類的基因從具體的氨基酸狀態進行重組。如果真的做到這樣，那么人類可就了不起了，因為我們能夠再一次選擇我們的基本狀態。例如，我們可能并不是一個漂亮的人，但是可以通過基因技術進行重組再造。通過對特定基因的選擇，可以決定人的性狀突變，也就是說，未來完全可以做到人人都是俊男美女。只要掌握了基因工程技術，這一切都不是問題。
訓練鞏固·課堂達標
1.1987年，美國科學家將螢火蟲的熒光素基因轉入煙草植物細胞并獲得高水平的表達。長成的煙草植株通體光亮，堪稱自然界的奇跡。這一研究成果表明(　D　)
①螢火蟲與煙草的DNA結構基本相同
②螢火蟲與煙草共用一套遺傳密碼
③煙草體內合成了熒光素
④螢火蟲和煙草合成蛋白質的方式基本相同
A．①③　 B．②③
C．①④　 D．①②③④
解析：螢火蟲與煙草的遺傳物質都是雙鏈DNA，這是完成基因重組的基礎，①正確；自然界的所有生物幾乎都共用一套遺傳密碼，即無論在高等生物還是低等生物中，相同的密碼子決定的氨基酸種類都相同，②正確；螢火蟲的熒光素基因導入煙草細胞使得該植株通體光亮，可見熒光素基因在該植株中成功表達，③正確；基因的表達包括轉錄和翻譯，最后合成出蛋白質，④正確。
2．科學家在牛的乳房生物反應器中獲得了人的血清白蛋白，下列相關敘述不正確的是(　B　)
A．獲得的人血清白蛋白具有生物活性
B．應當以牛的乳腺細胞作為受體細胞
C．可用顯微注射法將目的基因導入受體細胞
D．受體細胞的性染色體組成是XX
解析：科學家在牛的乳房生物反應器中獲得了人的血清白蛋白，說明牛體內含有人的血清白蛋白基因，合成的人血清白蛋白具有生物活性，A項正確；應當以牛的受精卵作為受體細胞，B項錯誤；采用顯微注射法將目的基因導入動物受體細胞，C項正確；受體細胞應選擇雌性受精卵，故其性染色體組成是XX，D項正確。
3．普通番茄細胞中含有PG基因，其能控制合成多聚半乳糖醛酸酶(簡稱PG)，PG能破壞細胞壁使番茄軟化不耐貯藏?？茖W家將抗PG基因導入番茄細胞，培育出了抗軟化、保鮮時間長的轉基因番茄。下圖表示抗PG基因的作用原理，回答下列問題：
(1)據圖回答該轉基因番茄具有抗軟化、保鮮時間長的原理是__抗PG基因能阻止PG基因表達的翻譯過程，使細胞不能合成PG__。
(2)為培育抗軟化番茄，應采用__PCR__技術將抗PG基因進行體外擴增。在該技術的反應體系中除模板、引物、原料外，還需要加入__熱穩定DNA聚合酶(Taq酶)__，這個基因的表達需要__啟動子、終止子__等不可缺少的調控元件。
(3)將抗PG基因插入Ti質粒的__T－DNA__上構建基因表達載體，通過農桿菌轉化法將抗PG基因導入番茄細胞，為檢驗抗PG基因是否成功導入，在個體生物學水平上應檢測__轉基因番茄是否抗軟化以及保鮮時間的長短__。
(4)為避免抗PG基因通過花粉傳播進入其他植物而導致“基因污染”，應將抗PG基因導入__細胞質__(填“細胞核”或“細胞質”)。
解析：(1)據題圖可知，抗PG基因轉錄成的mRNA能夠與PG基因轉錄成的mRNA結合，阻止了PG基因表達的翻譯過程，使細胞不能合成PG，不能破壞細胞壁而使轉基因番茄抗軟化且保鮮時間延長。(2)采用PCR技術將抗PG基因進行體外擴增；PCR過程所需要的條件有：模板(抗PG基因)、引物、原料(4種游離的脫氧核糖核苷酸)、熱穩定DNA聚合酶；啟動子和終止子是基因表達不可缺少的調控元件。(3)將抗PG基因插入Ti質粒的T－DNA上構建基因表達載體，通過農桿菌轉化法將抗PG基因導入番茄細胞，為檢驗抗PG基因是否成功導入，在個體生物學水平上應檢測轉基因番茄是否抗軟化以及保鮮時間的長短。(4)花粉中的雄配子幾乎不含質基因，所以為避免抗PG基因通過花粉傳播進入其他植物而導致“基因污染”，應將抗PG基因導入細胞質。

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