資源簡介

生物學高考總復習教案
第45講　微生物的培養技術及應用
課標內容　(1)闡明在發酵工程中滅菌是獲得純凈的微生物培養物的前提。(2)闡明無菌技術是在操作過程中，保持無菌物品與無菌區域不被微生物污染的技術。
(3)舉例說明通過調整培養基的配方可有目的地培養某種微生物。(4)概述平板劃線法和稀釋涂布平板法是實驗室中進行微生物分離和純化的常用方法。(5)概述稀釋涂布平板法和顯微鏡計數法是測定微生物數量的常用方法。
考點一　微生物的基本培養技術
1.培養基的配制
幾種微生物的營養和能量來源
　　　
2.無菌技術
(1)目的：獲得純凈的培養物。
(2)關鍵：防止雜菌污染。
(3)常見物品的消毒或滅菌方法
①消毒方法及適用對象
②滅菌方法及適用對象
3.微生物的純培養
酵母菌純培養的操作步驟：
跳出題海　
【情境推理·探究】
下圖是采用純化微生物培養的兩種接種方法接種后培養的效果圖，請分析并回答下列問題：
(1)獲得圖A效果和圖B效果的接種方法分別是什么？_____________________________________________________。
(2)某同學在純化土壤中的細菌時，發現培養基上的菌落連成了一片，最可能的原因是什么？應當怎樣操作才可避免此種現象？_____________________________
____________________________________________________________________。
(3)接種操作為什么一定要在火焰附近進行？
_____________________________________________________________________。
提示　(1)獲得圖A效果的接種方法為稀釋涂布平板法，獲得圖B效果的接種方法為平板劃線法
(2)最可能的原因是菌液濃度過高或劃線時在劃下一區域前未將接種環灼燒滅菌；采取的措施是增大稀釋倍數或每次劃新區域前先將接種環灼燒滅菌
(3)火焰附近存在著無菌區域
【重點難點·透析】
1.倒平板的操作步驟
(1)培養基要冷卻到50 ℃左右時開始倒平板。溫度過高會燙手，過低培養基又會凝固。
(2)要使錐形瓶的瓶口通過酒精燈火焰。通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。
(3)倒平板時，要用左手的拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，不要完全打開，以免雜菌污染培養基。
(4)平板冷凝后，要將平板倒置。因為平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，平板倒置后，既可避免培養基表面的水分過快地揮發，又可防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。　　　
2.平板劃線法操作步驟
(1)實驗成功關鍵點
(2)平板劃線法操作中幾次灼燒接種環的目的
考向1　結合培養基的配制和無菌技術，考查科學思維
1.(2023·湖北襄陽四校聯考)微生物培養過程中，要重視無菌操作，現代生物學實驗中的許多方面也要進行無菌操作，防止雜菌污染，請分析下列操作，正確的是(　　)
A.煮沸消毒法中100 ℃煮沸5～6 min可以殺死全部微生物的細胞和芽孢、孢子
B.將接種環直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，可以迅速徹底地滅菌
C.加入培養基中的指示劑和染料不需要滅菌
D.家庭制作葡萄酒時要將容器和葡萄進行滅菌
答案　B
解析　煮沸消毒可以殺死微生物的營養細胞和部分芽孢，而滅菌能殺滅環境中一切微生物，包括孢子和芽孢，A錯誤；指示劑和染料可能混有微生物，因此加入培養基中的指示劑和染料也需要滅菌，C錯誤；家庭制作葡萄酒時，要將容器進行滅菌或消毒，但是葡萄不能滅菌，因為發酵用的酵母菌來自葡萄，D錯誤。
2.(2023·河南名校聯盟)“掌心對掌心，手心壓手背，十指交叉摩，手握關節搓，拇指圍軸轉，指尖掌心揉，手腕別放過。”七步洗手法可以清除手部的污物和微生物，是預防新冠病毒感染的有效措施之一。某生物實驗小組設計了“比較洗手前后手上細菌分布情況”的探究活動：各小組成員分別將拇指在甲組培養基上輕輕按一下，然后用肥皂將該手洗干凈，再將洗凈后的拇指在乙組培養基上輕輕按一下。將這兩組培養基放入恒溫培養箱中，在適宜溫度下培養24小時后，統計兩組培養基中菌落數目，請回答下列問題：
(1)該實驗中用到的培養基中加入了牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水，蛋白胨可以為微生物的生長提供_____________________________________________________
等營養物質，為了使配制的溶液呈固體狀態，還需要加入________。為了防止外來雜菌的入侵，可以將培養基放入盛有適量________的高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌15～30 min。
(2)實驗中“將拇指在培養基上輕輕按一下”相當于微生物培養操作中的________，該操作應該在酒精燈火焰附近進行，原因是
_____________________________________________________________________。
(3)統計甲、乙兩組培養皿中的菌落，乙組中菌落數比甲少得多，實驗結果說明肥皂洗手不能徹底清除手上的微生物。為避免手上微生物在無菌操作中污染培養基，洗過的手還應進行_______________________________________________
等方法處理(答出1種即可)。
(4)有同學認為乙中也有菌落產生，是因為培養過程受到雜菌污染，請你在本實驗的基礎上設計一個簡單的方案驗證他的猜想是否正確，并預期結果和結論。
____________________________________________________________________。
答案　(1)氮源和維生素　瓊脂　水　(2)接種　避免周圍環境中的微生物污染培養基 (3)酒精棉球擦拭雙手、戴消毒手套 (4)再加一個不接種的相同培養基(空白培養基)，與甲、乙在相同條件下培養，若該培養基上沒有生長菌落，說明培養過程未被雜菌污染，猜想錯誤；若該培養基上生長菌落，說明培養過程中被雜菌污染，猜想正確。
考向2　結合微生物的純培養，考查科學探究能力
3.(2023·江蘇南京調研)下圖為實驗室培養和純化大腸桿菌過程中的部分操作步驟，下列說法正確的是(　　)
A.步驟①后需將培養基滅菌并調節pH
B.步驟①②③操作時需要在酒精燈火焰附近進行
C.步驟③到④的過程中，接種環共灼燒處理了5次
D.圖中步驟①結束后需倒置平板，④結束后不需要
答案　B
解析　步驟①表示倒平板，培養基需要先調節pH后滅菌，冷卻后倒平板，A錯誤；接種環在每次接種前和接種結束后都要通過灼燒來滅菌，所以步驟③到步驟④的過程中5次劃線操作前都要灼燒滅菌，接種結束后還需灼燒滅菌1次，防止造成污染，由此可見，步驟③到步驟④的過程中，共需灼燒接種環6次，C錯誤；步驟④操作結束后需在培養皿的底上做好標記并倒置后放入培養箱中進行培養，D錯誤。
4.(2023·河北衡水金卷)丁草胺是一種有機除草劑，主要用于水稻田雜草的防除，具有潛在的致畸變和致突變性。而在水稻種植過程中農田有一段很長的淹水期，淹水會導致水稻田深層土壤處于厭氧狀態。因此研究丁草胺厭氧降解菌對于水稻田土壤中丁草胺的降解具有重要意義。研究人員要對丁草胺厭氧降解菌進行分離、鑒定和擴大培養(如圖)，請回答下列問題：
(1)你認為研究小組應該在哪里取樣？____________________________________
____________________________________________________________________
(2)配制選擇培養基時，研究人員先加入了K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、MgCl2、NH4Cl、CaCl2、NaCl、微量元素復合液、維生素復合液等，他們還需要加入一定量的________。對培養基滅菌通常采用________法。滅菌結束后，應趁熱將適量培養基分裝于錐形瓶中，充入氮氣，塞住膠塞并用鋁帽固定，這樣操作的目的是
_____________________________________________________________________。
(3)步驟③中，應將平板放入厭氧罐中，置于培養箱中恒溫培養，對長出的菌落進行初步鑒定。菌落是初步區分微生物類型的重要特征，這些特征包括_____________________________________________________________________
______________________________________________________________________(至少答出2點)等。
(4)步驟④中，從第二次劃線操作起，每次總是要從上一次劃線的末端開始劃線，其原因是_____________________________________________________________
____________________________________________________________________。
答案　(1)頻繁使用丁草胺的水稻田深層土壤
(2)丁草胺　高壓蒸汽滅菌　創造無氧的培養環境
(3)菌落的形狀、大小、顏色、隆起程度、邊緣特征　(4)劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨劃線次數的增加逐步減少，最終得到由單個細菌繁殖而來的菌落
解析　(1)施用過丁草胺的稻田中能夠分解丁草胺的菌株數量多，易獲得目的菌株，同時由于目的菌株是厭氧型微生物，故獲取分離目的菌的土壤樣品應從頻繁使用丁草胺的水稻田深層土壤獲取。(2)配制培養基時除微生物生長所必需的營養物質外，還需加入一定量的丁草胺。培養基滅菌一般采用高壓蒸汽滅菌法。滅菌后的培養基趁熱充入氮氣的目的是去除培養基中的氧氣，創造無氧環境。(3)菌落的特征包括菌落的形狀、大小、隆起程度、顏色、邊緣特征、光澤等。(4)劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨劃線次數的增加逐步減少，最終得到由單個細菌繁殖而來的菌落。
考點二　微生物的選擇培養和計數
1.選擇培養基
常見選擇培養基舉例
①缺少氮源的培養基可以篩選能利用大氣中N2的微生物。②含青霉素的培養基可淘汰細菌，篩選出真菌。③無有機碳源的培養基可篩選出自養微生物。　　　
2.稀釋涂布平板法
(1)系列稀釋操作
取1 mL菌液加入盛有9 mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。
(2)涂布平板操作
3.微生物的數量測定
(1)利用稀釋涂布平板法計數
①為了保證結果準確，一般選擇菌落數為30～300的平板計數，并且在同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數，并求平均值。
②統計結果往往比實際值少。
(2)利用顯微鏡直接計數
①需用細菌計數板或血細胞計數板。
②統計結果一般是活菌數和死菌數的總和。
4.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數的實驗操作
(1)實驗原理
(2)操作步驟
(3)實驗結果分析與評價
5.分解纖維素的微生物的分離
(1)分離方法與原理
(2)纖維素分解菌的培養基成分及鑒定原理
【情境推理·探究】
1.利用稀釋涂布平板法進行微生物數量測定時，統計的菌落數往往比活菌的實際數目要少，這是因為____________________________________________________
____________________________________________________________________。
提示　當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落
2.傳統酒曲含有多種有助于釀酒的微生物，某同學想研究一種傳統酒曲中所含的微生物，進行了實驗。將酒曲制成懸液稀釋到一定的倍數，接種到以淀粉為唯一碳源的培養基上，培養一段時間后，觀察透明圈的大小，并從最大的透明圈中央挑取菌落并保存。有人說，實驗中形成的菌落并不只是能分解淀粉的菌落，你是否同意他的說法？請說明你的理由。
提示　同意。分解淀粉的微生物將淀粉分解后形成的有機物，可供不能分解淀粉的微生物生活。
3.土壤中的某些微生物可以利用空氣中的氮氣作為氮源。若要設計實驗進一步確定甲、乙菌能否利用空氣中的氮氣作為氮源，請簡要寫出實驗思路、預期結果和結論。
提示　將甲、乙菌分別接種在無氮源培養基上，若細菌能生長，則說明該細菌能利用空氣中的氮氣作為氮源。
考向1　結合微生物的選擇培養，考查科學思維
1.(2023·山東淄博月考)某小組同學為了調查湖水中細菌的污染情況而進行了實驗，包括制備培養基、滅菌、接種及培養、菌落觀察與計數。下列與此實驗相關問題的敘述，正確的是(　　)
A.實驗用過的帶菌培養基經過加熱后才能倒掉
B.可利用平板劃線法對細菌進行分離純化并計數
C.培養基中含有的蛋白胨主要為細菌培養提供氮源和維生素等
D.觀察細菌培養的實驗時，最好是在另一平板上接種清水作為對照實驗
答案　C
解析　帶菌的培養基經高壓蒸汽滅菌后才能倒掉，以免污染環境，加熱不能達到滅菌的目的，A錯誤；利用稀釋涂布平板法對細菌進行分離純化并計數，平板劃線法不能用于細菌的計數，B錯誤；培養基中含有的蛋白胨主要為細菌培養提供了氮源和維生素等，C正確；要使該實驗所得結果可靠，還應該同時在另一平板上接種無菌水作為對照進行實驗，D錯誤。
2.(2023·福建莆田模擬)某紡織廠為使牛仔布呈現“穿舊”效果，準備用纖維素分解菌處理代替傳統的浮石擦洗。工作人員擬從土壤樣品中分離該類微生物，并進行擴大培養，相關工藝流程如下圖。請回答下列問題：
(1)進行土樣中細菌數量的測定，常用稀釋涂布平板法(選用104～106倍的稀釋液)統計樣品中活菌的數量。當第一次用稀釋涂布平板法測定土樣中纖維素分解菌的數量時，所進行實驗的一般基本思路是_____________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)在系列稀釋操作前，選擇培養的一般目的是_____________________________
_____________________________________________________________________。
(3)涂布接種時，轉動培養皿的目的是____________________________________。
(4)在鑒別培養基上，菌落周圍的透明圈大小可能與纖維素酶的________有關。
答案　(1)將稀釋范圍適當放寬的稀釋液，采用稀釋涂布平板法分別接種到鑒別培養基(用剛果紅染色)，以保證從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數　
(2)以確保能夠從樣品中分離得到所需要的微生物，增加纖維素分解菌的數量　
(3)使菌液分布均勻　(4)量和活性
解析　(1)第一次用稀釋涂布平板法測定土樣中纖維素分解菌的數量時，需要將稀釋范圍適當放寬的稀釋液，采用稀釋涂布平板法分別接種到鑒別培養基(用剛果紅染色)，以保證從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數。(2)選擇培養的目的是確保能夠從樣品中分離得到所需要的纖維素分解菌，增加纖維素分解菌的數量。(3)涂布接種時，轉動培養皿的目的是使菌液分布均勻。(4)該實驗中的透明圈的大小與纖維素酶的量和活性有關。
跳出題海　 兩種純化方法的比較
考向2　圍繞微生物的分離和計數，考查科學思維和探究能力
3.(2022·廣東卷，21)研究深海獨特的生態環境對于開發海洋資源具有重要意義。近期在“科學號”考察船對中國南海科考中，中國科學家采集了某海域1 146米深海冷泉附近沉積物樣品，分離、鑒定得到新的微生物菌株并進一步研究了其生物學特性。
回答下列問題：
(1)研究者先制備富集培養基，然后采用________________法滅菌，冷卻后再接入沉積物樣品，28 ℃厭氧培養一段時間后，獲得了含擬桿菌的混合培養物，為了獲得純種培養，除了稀釋涂布平板法，還可采用________法。據圖分析，擬桿菌新菌株在以________為碳源時生長狀況最好。
(2)研究發現，將采集的樣品置于各種培養基中培養，仍有很多微生物不能被分離篩選出來，推測其原因可能是____________________________________________
_________________________________________________________(答一點即可)。
(3)藻類細胞解體后的難降解多糖物質，通常會聚集形成碎屑沉降到深海底部。從生態系統組成成分的角度考慮，擬桿菌對深海生態系統碳循環的作用可能是
_____________________________________________________________________。
(4)深海冷泉環境特殊，推測此環境下生存的擬桿菌所分泌的各種多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能還有________。
答案　(1)高壓蒸汽滅菌　平板劃線　纖維素 (2)某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物質才能生存(或需要在深海冷泉的特定環境中才能存活)　(3)擬桿菌作為分解者，將沉降到深海底部的難降解多糖物質分解為無機物，歸還到無機環境中，有利于碳循環的順利進行　(4)耐低溫
解析　(1)培養基通常采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌。可以采用稀釋涂布平板法或平板劃線法，將單個微生物分散在固體培養基上，經過培養得到單菌落，從而獲得純種培養。分析題圖可知，在以纖維素為碳源的培養基中，細胞數量最多，可推知擬桿菌新菌株在以纖維素為碳源時生長狀況最好。(2)深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物質才能生存(或需要在深海冷泉的特定環境中才能存活)，故將采集的樣品置于各種培養基中培養，仍可能有很多微生物不能被分離篩選出來。(3)擬桿菌為異養生物，作為該生態系統的分解者，能將沉降到深海底部的難降解多糖物質分解為無機物，歸還到無機環境中，有利于碳循環的順利進行。(4)深海冷泉溫度較低，故生活在其中的擬桿菌所分泌的各種多糖降解酶，應具有耐低溫的特性，才能高效降解多糖，保證擬桿菌的正常生命活動所需。
重溫真題　經典再現
1.(2022·湖北卷，5)滅菌、消毒、無菌操作是生物學實驗中常見的操作。下列敘述正確的是(　　)
A.動、植物細胞DNA的提取必須在無菌條件下進行
B.微生物、動物細胞培養基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C.為防止蛋白質變性，不能用濕熱滅菌法對牛肉膏蛋白胨培養基進行滅菌
D.可用濕熱滅菌法對實驗中所使用的微量離心管、細胞培養瓶等進行滅菌
答案　D
解析　動、植物細胞DNA的提取不需要在無菌條件下進行，A錯誤；動物細胞培養基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保證無菌環境，而微生物的培養一般不能加入抗生素，B錯誤；一般用濕熱滅菌法對牛肉膏蛋白胨培養基進行滅菌，以防止雜菌污染，C錯誤；可用濕熱滅菌法對實驗中所使用的微量離心管、細胞培養瓶等進行滅菌，以防止雜菌污染，D正確。
2.(2021·山東等級考試，14)解脂菌能利用分泌的脂肪酶將脂肪分解成脂肪酸和甘油并吸收利用。脂肪酸會使醇溶青瓊脂平板變為深藍色。將不能直接吸收脂肪的甲、乙兩種菌分別等量接種在醇溶青瓊脂平板上培養。甲菌菌落周圍呈現深藍色，乙菌菌落周圍不變色。下列說法錯誤的是(　　)
A.甲菌屬于解脂菌
B.實驗中所用培養基以脂肪為唯一碳源
C.可將兩種菌分別接種在同一平板的不同區域進行對比
D.該平板可用來比較解脂菌分泌脂肪酶的能力
答案　B
解析　根據題意，甲、乙兩種菌分別接種在醇溶青瓊脂平板上，二者都能生存，甲周圍呈現深藍色，說明培養基的脂肪被分解為脂肪酸，使平板呈現深藍色，脂肪的分解需要脂肪酶的催化，說明甲能夠分泌脂肪酶，屬于解脂菌，A正確；乙周圍不變色，說明乙不能分泌脂肪酶分解脂肪，沒有脂肪酸的產生，不能利用脂肪，但由于乙能在該培養基上生存，說明該培養基中除了脂肪作為碳源外，還存在別的碳源，否則乙不能在該培養基上生存，B錯誤；為了便于比較結果，可以將兩種菌接種到同一平板的不同區域，C正確；菌落周圍深藍色的直徑越大，說明解脂菌分泌脂肪酶的能力越強，D正確。
3.(2022·山東卷，14)青霉菌處在葡萄糖濃度不足的環境中時，會通過分泌青霉素殺死細菌，以保證自身生存所需的能量供應。目前已實現青霉素的工業化生產，關于該生產過程，下列說法錯誤的是(　　)
A.發酵液中的碳源不宜使用葡萄糖
B.可用深層通氣液體發酵技術提高產量
C.選育出的高產菌株經擴大培養后才可接種到發酵罐中
D.青霉素具有殺菌作用，因此發酵罐不需嚴格滅菌
答案　D
解析　青霉菌處于葡萄糖濃度不足的環境中會通過分泌青霉素殺死細菌；發酵液中的碳源不宜使用葡萄糖，A正確；青霉菌的代謝類型為異養需氧型，可用深層通氣液體發酵技術提高產量，B正確；選育出的高產青霉素菌株經擴大培養純化后，才可接種到發酵罐中進行工業化生產，C正確；為了防止細菌、其他真菌等微生物的污染，獲得純凈的青霉素，發酵罐仍需嚴格滅菌，D錯誤。
4.(2022·全國甲卷，37)某同學從被石油污染的土壤中分離得到A和B兩株可以降解石油的細菌，在此基礎上采用平板培養法比較二者降解石油的能力，并分析兩個菌株的其他生理功能。
實驗所用的培養基成分如下：
培養基Ⅰ：K2HPO4、MgSO4、NH4NO3、石油。
培養基Ⅱ：K2HPO4、MgSO4、石油。
操作步驟：
①將A、B菌株分別接種在兩瓶液體培養基Ⅰ中培養，得到A、B菌液；
②液體培養基Ⅰ、Ⅱ中添加瓊脂，分別制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按圖中所示在平板上打甲、乙兩孔。
回答下列問題：
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
(1)實驗所用培養基中作為碳源的成分是__________。培養基中NH4NO3的作用是為菌株的生長提供氮源，氮源在菌體內可以參與合成__________(答出2種即可)等生物大分子。
(2)步驟①中，在資源和空間不受限制的階段，若最初接種N0個A細菌，繁殖n代后細菌的數量是__________。
(3)為了比較A、B降解石油的能力，某同學利用步驟②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ進行實驗，結果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示無透明圈)，推測該同學的實驗思路是___________________________________
____________________________________________________________________。
(4)現有一貧氮且被石油污染的土壤，根據上表所示實驗結果，治理石油污染應選用的菌株是__________，理由是__________________________________________
____________________________________________________________________。
答案　(1)石油　DNA、RNA、蛋白質 (2)N0·2n　(3)在無菌條件下，將等量等濃度的A菌液和B菌液分別接種到平板Ⅰ的甲和乙兩孔處，平板Ⅱ也進行同樣的操作，在相同且適宜條件下培養一段時間，比較兩個平板的兩孔處的透明圈大小并作記錄，根據透明圈大降解能力強，透明圈小降解能力弱，進而比較A、B降解石油的能力　(4)A　A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在沒有添加氮源的培養基中也能生長
解析　(1)培養基的成分有碳源、氮源、無機鹽和水等，從組成培養基的物質所含化學元素可知，作為碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白質都含有N元素，故氮源在菌體內可以參與合成這些物質。(2)由題意“資源和空間不受限制”可知，細菌數量的增長呈“J”形曲線，細菌每繁殖一代就是上一代的2倍，根據公式Nt＝N0·λt，λ＝2，繁殖n代后細菌的數量是N0·2n。(3)分析表格數據可知，實驗的結果是：在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根據實驗的單一變量和對照原則，推測該同學的思路是：在無菌條件下，將等量等濃度的A菌液和B菌液分別接種到平板Ⅰ的甲和乙兩孔處，平板Ⅱ也進行同樣的操作，在相同且適宜條件下培養一段時間，比較兩個平板的兩孔處的透明圈大小并作記錄，根據透明圈大降解能力強，透明圈小降解能力弱，進而比較A、B降解石油的能力。(4)由表格數據可知，在平板Ⅱ(無氮源的培養基)上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理貧氮且被石油污染的土壤，應該選用A菌株，因為A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在沒有添加氮源的培養基中也能生長。
限時強化練
(時間：35分鐘)
【對點強化】
考點一　微生物的基本培養技術
1.(2023·江蘇徐州調研)下列關于微生物培養的敘述，正確的是(　　)
A.微生物在培養液中培養一段時間后用顯微鏡觀察，可見到形成的菌落
B.NH3可以作為硝化細菌的氮源和能源物質
C.任何培養基都必須含有碳源、氮源、無機鹽、水和瓊脂
D.某些細菌生長過程中需要額外補充營養物質，比如培養酵母菌時，要添加維生素
答案　B
解析　微生物在固體培養基表面或內部生長，可以形成肉眼可見的菌落，A錯誤；硝化細菌可利用氧化NH3釋放的能量合成有機物，B正確；培養基不一定都含有碳源、氮源，如培養自養微生物的培養基中不需加入碳源，分離自生固氮菌的培養基中，不需加入氮源，C錯誤；酵母菌不屬于細菌，D錯誤。
2.(2022·海南卷，12)為探究校內植物園土壤中的細菌種類，某興趣小組采集園內土壤樣本并開展相關實驗。下列有關敘述錯誤的是(　　)
A.采樣時應隨機采集植物園中多個不同地點的土壤樣本
B.培養細菌時，可選有牛肉膏蛋白胨固體培養基
C.土壤溶液稀釋倍數越低，越容易得到單菌落
D.鑒定細菌種類時，除形態學鑒定外，還可借助生物化學的方法
答案　C
解析　采集植物園中土壤樣本的原則之一是要隨機采樣，A正確；牛肉膏蛋白胨固體培養基中含有細菌生長所需的碳源、氮源、水、無機鹽等，可用于細菌的培養，B正確；土壤溶液稀釋倍數足夠高時，才能將聚集的細菌分散開，有助于在培養基表面形成單菌落，C錯誤；不同種類細菌的理化特性一般不同，鑒定細菌種類時，除根據菌落特征進行形態學鑒定外，還可以借助生物化學的方法進行鑒定，D正確。
3.(2023·北京大學附中期末改編)在生產、生活和科研實踐中，經常通過消毒和滅菌來避免雜菌的污染。下列相關敘述，錯誤的是(　　)
A.玻璃和金屬材質的實驗器具可放入干熱滅菌箱中干熱滅菌
B.接種前后的接種環都要在酒精燈的火焰上進行灼燒消毒
C.沒有將高壓蒸汽滅菌鍋內的冷空氣排盡將影響培養基的滅菌效果
D.噴灑石炭酸同時配合紫外線照射可提高對接種室的消毒效果
答案　B
解析　在實驗室中，玻璃和金屬材質的實驗器具可以放入干熱滅菌箱中進行干熱滅菌，一些金屬材質的實驗器具也可以灼燒滅菌，A正確；為了防止雜菌污染和感染操作者，每次接種前后，接種環都要進行灼燒滅菌，B錯誤；若未將高壓蒸汽滅菌鍋內的冷空氣排盡，會因達不到規定溫度而影響滅菌的效果，C正確；紫外線能破壞DNA結構，密閉空間常采用紫外線照射消毒，噴灑石炭酸同時配合紫外線照射可提高對接種室的消毒效果，D正確。
考點二　微生物的選擇培養和計數
4.(2023·江蘇鹽城期中)餐廚垃圾中具有高效降解能力的微生物，可用于餐廚垃圾高效無害化處理。科研人員取一定量的餐廚樣品，制備不同濃度的樣品稀釋液，并將樣品接種于利用蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂配制的培養基表面進行培養并分離。下列分析正確的是(　　)
A.牛肉膏主要為微生物提供氮源
B.接種時需用力將菌種接種到培養基內
C.稀釋樣品獲得單個菌落以便判斷菌種類型
D.經過培養可篩選出有高效降解能力的微生物
答案　C
解析　牛肉膏主要為微生物提供碳源、磷酸鹽和維生素等，A錯誤；在培養基接種菌種時，應將菌種接入培養基表面，有利于其生長，如果用力接種會劃破培養基，從而會影響菌株的生長，不能形成正常的特征形態，影響對菌落形態的觀察及特征鑒別，B錯誤；該培養基為基本培養基，不能選出有高效降解能力的微生物，經過培養、篩選后還需要進行鑒定，才能選出有高效降解能力的微生物，D錯誤。
5.(2023·江西九江質檢)在篩選纖維素分解菌的培養基中加入剛果紅染料，研究者觀察到幾個有透明圈的菌落。據圖分析正確的是(　　)
A.透明圈內的剛果紅染料已被分解
B.菌落②中的菌株降解纖維素能力最強
C.圖中菌落可能是細菌也可能是真菌
D.圖中培養基可用牛肉膏、蛋白胨配制
答案　C
解析　透明圈不顯紅色的原因是其中的纖維素已被分解，A錯誤；菌落①形成的透明圈直徑與菌落直徑之比最大，說明菌落①降解纖維素能力最強，B錯誤；根據題干信息不能判斷圖中菌落的微生物類型，可能是細菌也可能是真菌，C正確；圖中培養基應以纖維素為唯一碳源，不可用牛肉膏、蛋白胨配制，D錯誤。
6.(2023·中原名校聯盟)營養缺陷型菌株是野生型菌株經過人工誘變或自發突變失去合成某種生長因子的能力，只能在補充了相應的生長因子的基本培養基中才能正常生長的變異菌株。某研究小組對酵母菌用紫外線照射后將其接種到甲培養皿的培養基上，一段時間后將甲培養皿的菌落影印接種(不改變菌落位置)到乙、丙兩培養皿的培養基中，進一步培養得到如下圖所示結果。
下列分析正確的是(　　)
A.接種到甲培養皿采用的是平板劃線法
B.甲、丙兩培養皿中的培養基是基本培養基
C.甲培養皿中菌落數目有可能比接種的酵母菌數少
D.甲、乙、丙三個培養皿都可能存在營養缺陷型菌落
答案　C
解析　甲培養皿的菌落均勻分布，接種方法應為稀釋涂布平板法，A錯誤；甲、丙培養基菌落數目多，包括野生型酵母菌菌株和某種營養缺陷型酵母菌菌株，乙培養皿沒有生長的菌株是某種營養缺陷型酵母菌菌株，故乙培養皿的培養基是基本培養基，甲和丙生長了同樣的菌株，則甲和丙是加入了同種生長因子的培養基，B錯誤；由于基因突變具有不定向性，接種到甲培養皿的酵母菌可能還有其他營養缺陷型菌株，且有些菌落不一定由一個酵母菌形成，所以，甲培養皿中菌落數有可能比接種的酵母菌數少，C正確；乙培養皿的培養基是基本培養基，形成的菌落只可能是野生型菌落，D錯誤。
【綜合提升】
7.(2023·湖南長沙調研)某生物活動小組為探究當地農田土壤中分解尿素的細菌的數量，進行了隨機取樣、系列梯度稀釋、涂布平板、培養、計數等步驟，實驗操作過程如下：
請分析并回答下列問題：
(1)該實驗中含有瓊脂的培養基從物理性質來說，屬于________培養基，培養基中只選擇了________作為唯一氮源。
(2)分解尿素的細菌能產生________酶，將尿素分解為______________________。
(3)在采用稀釋涂布平板法對微生物進行計數時，需要進行梯度稀釋的原因是
_____________________________________________________________________。
(4)實驗結果：6號試管涂布的三個平板的菌落數為550、501、688，7號試管涂布的三個平板的菌落數為58、73、97，8號試管涂布的三個平板的菌落數為8、15、28。該10 g土壤樣品中含有分解尿素的細菌的估算數目是____________________
___________________________________________________________________個。
答案　(1)固體　尿素　(2)脲　NH3和CO2 (3)只有在稀釋度足夠高時，聚集在一起的微生物才被分散成單個細胞，并形成單個菌落；但稀釋度過高時，得到的平板菌落數太少，實驗的偶然性太大。進行梯度稀釋時，取菌落數為30～300個的平板進行計數，所得的實驗結果最準確(合理即可) (4)7.6×1011
解析　(1)瓊脂可作為凝固劑，故從物理性質來說，含瓊脂的培養基屬于固體培養基。篩選分解尿素的細菌的選擇培養基應以尿素為唯一氮源。(2)分解尿素的細菌產生的脲酶能將尿素分解為NH3和CO2。(3)在采用稀釋涂布平板法對微生物進行計數時，只有在稀釋度足夠高時，聚集在一起的微生物才被分散成單個細胞，并形成單個菌落；但稀釋度過高時，得到的平板菌落數太少，實驗的偶然性太大，所以需進行梯度稀釋，取菌落數為30～300個的平板進行計數，實驗結果最準確。(4)由于平板計數的適宜值在30～300之間，所以應選擇7號試管涂布的平板進行計數，其平均菌落數為(58＋73＋97)/3＝76個，據圖可知，10 g土壤樣品經梯度稀釋至7號試管，稀釋度為108倍，而不是107倍，因為在錐形瓶處已經稀釋10倍，所以利用公式計算每克土壤樣品中的菌落數：(C÷V)×M＝(76÷0.1)×108＝7.6×1010個，但要特別注意，此時求出的是1 g土壤中的微生物數量，所以該
10 g土壤樣品中含有分解尿素的細菌的數目是7.6×1010×10＝7.6×1011個。
8.(2023·湖北十堰模擬)自生固氮菌是土壤中能獨立固定空氣中N2的細菌，將玉米種子用自生固氮菌拌種后播種，可顯著提高產量并降低化肥的使用量。科研人員進行了土壤中自生固氮菌的分離和固氮能力測定的研究，部分實驗流程如下圖。回答下列問題：
(1)步驟①土樣應取自當地表層土壤的原因是___________________________
__________________________________________________________________；
步驟②需充分振蕩的主要目的是______________________________________
_________________________________________________________________。
(2)下表為兩種培養基的配方，步驟④應選其中的________培養基，原因是
____________________________________________________________________。
培養基類型 培養基組分
Ashby培養基 甘露醇(C6H14O6)、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、K2SO4、CaCO3、蒸餾水、瓊脂
LB培養基 蛋白胨、酵母提取物、NaCl、蒸餾水、瓊脂
(3)步驟④所用的接種工具是________，若在④的平板上統計的菌落的平均數量為126個，則每克土壤中含有的固氮菌為________個。
(4)將純化的固氮菌置于完全培養液中擴大培養48小時，經離心后收集下層細胞并轉移至特定培養基中進行固氮能力的測定，篩選出固氮能力最強的菌種CM12，為進一步鑒定其固氮能力，科研人員選用發芽一致的玉米種子進行3組盆栽實驗，30天后測定土壤微生物有機氮含量，結果如圖。
注：CK：對照處理組；N：尿素處理組(每盆土壤中50 mL有氮全營養液：成分為在1 000 mL無氮植物營養液中加入0.12 g尿素)；CM12：自生固氮菌CM12處理組(每盆土壤澆50 mL接種自生固氮菌的無氮植物營養液)。
①對照組(CK)的處理為_________________________________________。
②實驗結果表明：施用尿素處理和接種固氮菌CM12處理均能顯著增加土壤微生物有機氮含量。與尿素處理組相比，CM12處理組土壤微生物有機氮含量增加了約________%(保留1位小數)。
③自生固氮菌較共生固氮菌(如根瘤菌)的應用范圍更廣，原因是
_____________________________________________________________________。
答案　(1)在富含有機質的土壤表層，有更多的固氮菌生長　使土壤中的微生物充分釋放到無菌水中　(2)Ashby　該培養基不含氮源，具有選擇作用，自生固氮菌可以利用空氣中的氮氣作為氮源，LB培養基中的蛋白胨可以提供氮源，不具有選擇作用　(3)涂布器　1.26×107　(4)①每盆土壤澆50 mL無氮植物營養液　②83.3　③自生固氮菌能在土壤中獨立固氮，不受宿主的限制
9.(2023·湖南邵陽模擬)植物秸稈中的纖維素可被某些微生物分解。分解秸稈中纖維素的微生物能分泌纖維素酶，該酶是由3種組分組成的復合酶，其中的葡萄糖苷酶可將纖維二糖分解成葡萄糖。回答下列問題：
(1)微生物生長繁殖所需的主要營養物質有碳源、水、________四類，為從富含纖維素的土壤中分離獲得纖維素分解菌的單菌落，某同學設計了甲、乙兩種培養基(成分見下表)：
酵母膏 無機鹽 淀粉 纖維素粉 瓊脂 剛果紅溶液 水
培養基甲 ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
培養基乙 ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋
注：“＋”表示有，“－”表示無。
(2)據表判斷，培養基甲________(填“能”或“不能”)用于分離和鑒別纖維素分解菌，原因是__________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)據表判斷，培養基乙________(填“能”或“不能”)用于分離和鑒別纖維素分解菌，原因是__________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)在含纖維素的培養基中加入剛果紅(CR)時，CR可與纖維素形成________色復合物。用含有CR的該種培養基培養纖維素分解菌時，培養基上會出現以該菌的菌落為中心的________。
(5)純化菌株時，通常使用的劃線工具是________。劃線的某個平板培養后，第一劃線區域的劃線上都不間斷地長滿了菌，第二劃線區域的第一條線上無菌落，其他劃線上有菌落。造成劃線無菌落可能的操作失誤有
____________________________________________________________________。
答案　(1)氮源和無機鹽　(2)不能　纖維素分解菌選擇培養基屬于液體培養基，纖維素分解菌鑒別培養基屬于固體培養基(培養基中沒有瓊脂)　(3)不能　培養基中沒有纖維素粉　(4)紅　透明圈 )接種環　①接種環灼燒后未冷卻；②劃線未從第一區域末端開始
解析　(1)實驗室培養微生物需要配制培養基，培養基中一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽。
(2)分析表格可知，培養基甲的配方中無瓊脂，為液體培養基，不能用于分離和鑒別纖維素分解菌，纖維素分解菌鑒別培養基屬于固體培養基。
(3)培養基乙沒有纖維素粉，因此也不能用于分離和鑒別纖維素分解菌。
(4)在含纖維素的培養基中加入剛果紅(CR)時，CR可與纖維素形成紅色復合物。用含有CR的該種培養基培養纖維素分解菌時，培養基上會出現以該菌的菌落為中心的透明圈。
(5)接種時常用接種環，平板劃線法操作時要求將灼燒后的接種環冷卻后再劃線，否則會灼傷菌株甚至導致菌株死亡，劃線時要從上一次劃線的末端開始，這樣接種環上才有菌株，因此若第一劃線區域的劃線上都不間斷地長滿了菌，而第二劃線區域的第一條線上無菌落，其他劃線上有菌落，可能的原因有接種環灼燒后未冷卻或劃線未從第一區域末端開始。
10.(2022·廣東中山調研)鯨死亡后會沉入海底，俗稱“鯨落”。“鯨落”后期會形成一個以厭氧菌和硫細菌等為主體的生態系統。厭氧菌以“鯨落”肌肉中的脂肪為食，同時產生一些硫化氫等硫化物，硫細菌將硫化物氧化成硫酸鹽，并以該過程中釋放的能量合成有機物。請回答相關問題：
(1)培養微生物的培養基中一般都會含有水、無機鹽、氮源和碳源，培養“鯨落”群落中厭氧菌的碳源必須是________。要培養硫細菌，培養基中的成分需要特殊配制，主要體現在________________________，這種培養基可以用來專一性培養硫細菌，所以稱為____________培養基。
(2)在分離“鯨落”中的微生物時要制備固體培養基，在倒平板操作后，將平板倒置，這樣做的目的是________________________________________________
__________________________________________________________________。
(3)為了研究“鯨落”中含有微生物的情況，需將“鯨落”提取物加水稀釋，然后將稀釋水樣用涂布器分別涂布到瓊脂固體培養基的表面進行培養，這種方法稱為________________。下面所示的四種菌落分布情況中，不可能由該方法得到的是________。
(4)若想得到“鯨落”中某目標菌種，可用平板劃線法進行純化。若下圖甲是接種培養后的菌落分布圖，對應的平板劃線操作示意圖為________。圖甲中的③更易獲得單菌落，判斷依據是____________________________________________
__________________________________________________________________。
答案　(1)含碳有機物(或脂肪)　碳源必須是含碳無機物(或碳酸鹽)，同時加入硫化物　選擇　(2)防止培養皿蓋上凝結的水珠落入培養皿造成污染；防止培養基中水分過快揮發　(3)稀釋涂布平板法　D　(4)丙　每次劃線的菌種都來自上一次劃線的末端，最后一次劃線結束時更容易獲得單菌落
解析　(1)厭氧菌以“鯨落”肌肉中的脂肪為食，屬于異養微生物，故培養“鯨落”群落中厭氧菌的碳源必須是含碳有機物(或脂肪)。硫細菌將硫化物氧化成硫酸鹽，并以該過程中釋放的能量合成有機物.即硫細菌為自養生物，所以要培養硫細菌，培養基中的成分需要特殊配制，主要體現在碳源必須是含碳無機物(或碳酸鹽)，同時加入硫化物。這種人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長的培養基稱為選擇培養基。(3)使用涂布器涂布接種微生物的方法為稀釋涂布平板法。稀釋涂布平板法接種的微生物會在培養基上形成均勻分布的菌落，而平板劃線法接種的微生物在劃線的起始部分菌落連在一起生長，由圖可知，A、B、C均形成了均勻分布的單個菌落，屬于稀釋涂布平板法接種的，而D中菌落是連在一起生長的，是通過平板劃線法接種的。
11.(2022·重慶一中調研)大腸桿菌是寄生于人和動物腸道中的細菌，其代謝產物能與染料伊紅美藍反應，使菌落呈黑色。下面是其培養基配方：
成分 蛋白胨 乳糖 磷酸二氫鉀 瓊脂
含量 10 g 10 g 2 g 20～30 g
成分 蒸餾水 2%的伊紅水溶液 0.5%的美藍水溶液
含量 1 000 mL 20 mL 13 mL
回答下列問題：
(1)該培養基中，蛋白胨為大腸桿菌提供的主要營養有________和維生素等。
(2)在接種大腸桿菌前，需先將滅菌后的空白培養基放在恒溫箱中培養一段時間，觀察是否有菌落生成，其目的是__________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)為了檢測嚴重污染的水體中大腸桿菌的數量，將水樣適當稀釋后，取樣涂布在上述平板培養基中，應選擇顏色為________________的菌落進行計數。該方法是通過統計平板上的菌落數來推測樣品中的活菌數，其原理是_____________________________________________________________________。
(4)將1 mL水樣稀釋1 000倍，在3個平板上用涂布法分別接入0.1 mL稀釋液；經適當培養后，3個平板上的菌落數分別為39、38和37。據此可得出每升水樣中的活菌數為__________________________________________________________。
(5)除利用特定培養基選擇鑒定某種細菌外，還可以依據________________對細菌進行初步的鑒定和分類。
答案　(1)氮源　(2)檢測培養基制備是否合格(或滅菌是否徹底)　(3)黑色　當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌　(4)3.8×108　(5)菌落的形狀、大小等菌落特征
解析　(1)蛋白胨主要為大腸桿菌提供氮源和維生素等。(2)為了檢測培養基制備是否合格(或滅菌是否徹底)，在接種大腸桿菌前，需先將滅菌后的空白培養基放在恒溫箱中培養一段時間，觀察是否有菌落生成。(3)大腸桿菌的代謝產物能與培養基中的染料伊紅美藍反應，使菌落呈黑色，因此，為了檢測嚴重污染水體中大腸桿菌的數量，將水樣適當稀釋后，取樣涂布在上述平板培養基中，應選擇顏色為黑色的菌落進行計數。當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌，因此可通過統計平板上的菌落數來推測樣品中的活菌數。(4)將1 mL水樣稀釋1 000倍，在3個平板上用涂布法分別接入0.1 mL稀釋液；經適當培養后，3個平板上的菌落數分別為39、38和37，據此可得出每升水樣中的活菌數為[(39＋38＋37)÷3]÷0.1×1 000×1 000＝3.8×108。(5)一般來說，在一定的培養條件下，同種微生物表現出穩定的菌落特征，因此可以依據菌落的形狀、大小等菌落特征對細菌進行初步的鑒定和分類。

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