資源簡介

生物學高考備考教案
第十一章 生物技術與工程
課時6 基因工程的基本工具與操作程序
教師尊享·命題分析
課標要求 核心考點 五年考情 核心素養對接
1.闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具； 2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體的構建、目的基因導入受體細胞和目的基因及其表達產物的檢測鑒定等步驟； 的提取和鑒定； 4.利用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗 基因工程的基本工具 2022：湖北 ； 湖北T7、全國卷乙T38; 2018：全國卷Ⅱ 、北京T5 1.科學思維——建立模型:基因工程的操作流程。分析與綜合:理解基因工程的工具；PCR的原理,推斷PCR反應所需的條件;根據基因表達的過程,推斷目的基因檢測與鑒定的方式。 2.科學探究——通過DNA的粗提取與鑒定及DNA片段的擴增與鑒定的實際操作,培養科學探究能力
基因工程的操作程序 2022：江蘇T24、全國卷乙T38、遼寧T12和T24Ⅰ; 山東T25、河北T24、遼寧T24、廣東T22、湖北T16、全國卷甲T38、天津T16、江蘇T23、福建T21、浙江6月T29（二）（2）； 2020：浙江7月T24和T29（一）（1）（2）、浙江1月T29（二）（2）； 2019：江蘇T33、全國卷Ⅰ 、天津T9； 2018：浙江4月T32（二）（1）（2）、全國卷Ⅰ38
DNA的粗提取與鑒定及DNA片段的擴增與鑒定 2022：山東T13； 2021：山東T13; 2019：江蘇T10
命題分析預測 1.基因工程是高考的重點,常以科研或生產實踐為情境，考查基因工程的基本工具及基本操作程序,也常與核酸的結構、遺傳的物質基礎、細胞工程、胚胎工程等知識相結合進行綜合考查,多以非選擇題形式呈現，但也可以選擇題的形式呈現。 2.預計2024年高考試題仍可能延續往年的考查形式及特點,分層設置問題,多角度考查基因工程的工具、操作程序等相關知識，同時原因分析型試題的比例將大大增加
知識導圖 教材讀薄
考點1 基因工程的基本工具
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1.基因工程的概念
（1）手段：按照人們的愿望，通過 轉基因 等技術，賦予生物新的遺傳特性。
（2）目的：創造出更符合人們需要的新的生物類型和 生物產品 。
（3）操作水平： 分子水平 。由于在DNA分子水平上進行設計和施工，因此又叫作 重組DNA技術 。
2.基因工程的基本工具
3.與DNA有關的幾種酶的比較
種類 項目 作用底物 作用結果
限制酶 DNA分子 切開磷酸二酯鍵,形成黏性末端或平末端
DNA連接酶 兩個DNA分子片段 通過形成磷酸二酯鍵,進而形成新的單鏈DNA分子
DNA聚合酶 DNA片段、脫氧核苷酸 通過形成磷酸二酯鍵,進而形成新的單鏈DNA分子
DNA酶 DNA分子 斷開磷酸二酯鍵,形成脫氧核苷酸
解旋酶 雙鏈DNA分子 斷開堿基對間的氫鍵,形成單鏈DNA分子
RNA聚合酶 RNA片段、核糖核苷酸 通過形成磷酸二酯鍵,進而形成單鏈RNA分子
知識活用 教材讀活
深度思考
1. 原核生物中存在限制酶的意義是什么？
提示 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來DNA的入侵。
2. 原核生物中限制酶為什么不切割自身的DNA
提示 原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已被修飾等。
3. 基因工程中的載體與細胞膜上的載體相同嗎？
提示 不同。基因工程中的載體通常是DNA，主要是攜帶外源基因進入受體細胞并在受體細胞中進行自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA進行同步復制；細胞膜上的載體一般為蛋白質，主要是運載要進入細胞的特定物質。
4. 天然質粒一般不能直接用作基因工程載體的原因是什么？
提示 只有具有能自我復制、有一個或多個限制酶切割位點、有標記基因及對受體細胞無害等特點的質粒才可以直接用作基因工程的載體。實際上天然質粒一般不完全具備上述條件，其往往需要進行人工改造后才能用于基因工程操作。
基礎自測
1. 重組DNA技術所需要的工具酶有限制酶、DNA連接酶和載體。( × )
2. 所有的限制酶都只能識別同一種特定的核苷酸序列。( × )
3. 切割質粒的限制性內切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列。( × )
4. DNA聚合酶也可以用作重組DNA技術的工具。( × )
5. 限制酶和DNA連接酶的作用部位一致,但作用相反。( √ )
6. 所有DNA連接酶都能連接黏性末端和平末端。( × )
7. 載體的種類有質粒、噬菌體和動植物病毒等,其中動植物病毒必須是DNA病毒。( √ )
8. 載體質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選的標記基因。( × )
高考幫 研透高考 明確方向
命題點 基因工程所需的工具酶分析
1. [2022雙鴨山檢測，多選]圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內切核酸酶的酶切位點， 表示氨芐青霉素抗性基因， 表示新霉素抗性基因。下列敘述錯誤的是( AD )
A. 在構建重組質粒時，可用 和 切割質粒和外源DNA
B. 在酶切過程中，不能破壞質粒中全部的標記基因
C. 若只用 處理質粒和外源DNA分子片段，無法避免自身環化和反向連接
D. 導入重組質粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養基中生長
[解析] 的切割位點在目的基因上，故用 切割會破壞目的基因，A錯誤；在酶切過程中，不能破壞質粒中全部的標記基因，至少需要保留一個，B正確；若只用 切割質粒和外源DNA分子片段，會出現目的基因自身環化，或目的基因和質粒的反向連接，C正確；用 切割后，氨芐青霉素抗性基因被破壞，導入重組質粒的大腸桿菌不能在含氨芐青霉素的培養基中生長，D錯誤。
2. [2021全國卷乙,15分]用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內切核酸酶的切割位點如圖所示。
回答下列問題:
（1） 常用的DNA連接酶有 連接酶和 連接酶。圖中 、 酶切割后的DNA片段可以用 連接酶連接。圖中 、 、 、 酶切割后的DNA片段可以用 連接酶連接。
[解析] 由圖可以直接看出， 、 、 、 切割后分別形成黏性末端、平末端、黏性末端、平末端； 連接酶可用于連接黏性末端， 連接酶可用于連接黏性末端和平末端。
（2） DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段之間形成的化學鍵是磷酸二酯鍵。
[解析] DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵。
（3） DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征。如質粒DNA分子上有復制原點，可以保證質粒在受體細胞中能復制；質粒DNA分子上有限制酶的切割位點，便于外源DNA插入；質粒DNA分子上有標記基因（如某種抗生素抗性基因），利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞，方法是用含抗生素的培養基進行培養。
[解析] 復制原點是在基因組上復制起始的一段序列，可以保證質粒在宿主細胞中復制。質粒上有限制酶的切割位點，可被限制酶切開并使目的基因插入其中。采用在含有特定抗生素的選擇培養基上進行選擇培養的方法可將含質粒載體的細胞篩選出來。
（4） 表達載體含有啟動子，啟動子是指RNA 聚合酶識別、結合和驅動轉錄的一段DNA序列。
[解析] 啟動子是RNA 聚合酶識別、結合和驅動轉錄的一段DNA 序列。
3. [2023保定模擬,10分]如圖為大腸桿菌及質粒載體的結構模式圖，據圖回答下列問題。
（1） 和質粒的本質相同，都是DNA，二者還具有其他共同點，如能夠自我復制（寫出一條即可）。
[解析] 圖中 是擬核DNA，擬核DNA和質粒的本質都是DNA分子，均能夠自我復制。
（2） 若質粒的切割末端為，則與之連接的目的基因切割末端應為；可使用DNA連接酶把質粒和目的基因連接在一起。
[解析] DNA連接酶可以將具有互補末端的2個DNA片段連接在一起，形成重組DNA分子，若質粒的切割末端為，則與之連接的目的基因切割末端應為。
（3） 氨芐青霉素抗性基因在質粒DNA上作為標記基因，其作用是便于重組DNA的鑒定和篩選。
[解析] 質粒上常具有標記基因（如抗生素的抗性基因），便于重組DNA的鑒定與篩選。
（4） 下列常在基因工程中作為載體的是( C )
A. 蘇云金桿菌抗蟲基因 B. 農桿菌環狀RNA分子
C. 大腸桿菌的質粒 D. 動物細胞的染色體
（5） 除質粒外，常用的載體還有噬菌體和動植物病毒。
考點2 基因工程的操作程序
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1.基因工程的操作程序
[選必3 P77“相關信息”] 抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環境中才能表現出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體。
2.利用PCR獲取和擴增目的基因
PCR與體內DNA復制的異同
類型 PCR 體內DNA復制
時期 人工控制，隨時進行 有絲分裂和減數分裂前的間期
場所 細胞外 細胞內
解旋方式 以上高溫條件下變性解旋 解旋酶催化
酶 耐高溫的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶
子鏈合成方式 從兩條引物的 端開始連續合成 一條連續合成，另一條不連續合成
結果 擴增DNA片段或基因 合成整個DNA分子
相同點 ①都需要DNA模板、引物、能量和一定的溫度條件；②都遵循堿基互補配對原則；③DNA合成方向都是從子鏈的 端向 端延伸
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深度思考
1. 構建基因表達載體時，為什么一般選用兩種限制酶切割目的基因和載體？
提示 因為用不同的限制酶分別處理目的基因和載體時，可以使目的基因兩側和載體上各自具有兩個不同的黏性末端，防止目的基因或載體發生自身環化。
2. 農桿菌轉化法中的“轉化”與肺炎鏈球菌轉化實驗中的“轉化”的原理是否相同？
提示 相同，都是基因重組。
3. 在構建質粒載體時，目的基因的序列中能否含有用到的限制酶的識別序列，為什么？
提示 不能，因為目的基因的序列中若含有用到的限制酶的識別序列，目的基因可能會被切斷。
4. 在用農桿菌轉化法將目的基因導入植物細胞的過程中，為什么一定要將目的基因插入 質粒的 上？
提示 質粒的 是可轉移的DNA,可轉移到受體細胞，并且整合到受體細胞染色體DNA上。將目的基因插入 質粒的 上，就可以使目的基因進入植物細胞。
5. 復性時，引物與DNA模板的結合是隨機的，但兩條解開的DNA模板鏈結合的概率較低，其原因是什么？
提示 ①模板鏈一般較長，比引物復雜得多，重新結合的概率低；②加入引物的量足夠多，而模板鏈較少，故引物和模板鏈結合的機會遠大于模板鏈間的。
基礎自測
1. 基因表達載體中含有啟動子和密碼子。( × )
2. 基因表達載體的構建是基因工程的核心。( √ )
3. 啟動子是與RNA聚合酶識別和結合的部位,是起始密碼子。( × )
4. 質粒上的 可與植物受體細胞的染色體DNA整合在一起。( √ )
5. 將重組表達載體導入動物受精卵常用基因槍法。( × )
6. PCR擴增時, 左右,引物與作為模板的單鏈DNA特定部位相互配對、結合。( √ )
高考幫 研透高考 明確方向
命題點1 PCR的過程和應用分析
1. [2021湖北]某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對）。為了減少反應中非特異條帶的產生，以下措施中有效的是( D )
A. 增加模板DNA的量 B. 延長熱變性的時間
C. 延長延伸的時間 D. 提高復性的溫度
[解析] PCR過程中，引物和模板不完全配對會形成非特異條帶，增加模板DNA的量不會減少反應中非特異條帶的產生，A錯誤；延長熱變性的時間，有利于雙鏈DNA解聚為單鏈，不能減少反應中非特異條帶的產生，B錯誤；延長延伸的時間，有利于合成新的DNA鏈，但不能減少反應中非特異條帶的產生，C錯誤；在一定溫度范圍內，選擇較高的復性溫度可減少引物和模板間的非特異性結合，D正確。
2. [2021全國卷甲,15分]PCR技術可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌,醫生進行了相關操作:①分析PCR擴增結果;②從病人組織樣本中提取DNA;③利用PCR擴增DNA片段;④采集病人組織樣本。回答下列問題:
（1） 若要得到正確的檢測結果,正確的操作順序應該是④②③①（用數字序號表示）。
[解析] 用PCR技術進行臨床的病原菌檢測時，首先應采集病人組織樣本，從病人組織樣本中提取DNA，再利用PCR技術擴增DNA片段，分析PCR擴增結果。
（2） 操作③中使用的酶是耐高溫的DNA聚合酶（ 酶）。PCR反應中的每次循環可分為變性、復性、延伸三步,其中復性的結果是兩種引物分別與兩條單鏈DNA模板結合。
[解析] 利用PCR擴增DNA片段過程中使用的酶是 酶。PCR由變性—復性—延伸三個基本反應步驟構成，其中復性的結果是兩種引物分別與兩條單鏈DNA模板結合。
（3） 為了做出正確的診斷，PCR反應所用的引物應該能與病原菌DNA特異性結合。
[解析] 要擴增病原菌DNA，設計的引物應該能和病原菌DNA特異性結合。
（4） PCR（多聚酶鏈式反應）技術是指一種在生物體外迅速擴增特定DNA片段的技術，它能在短時間內大量擴增目的基因。該技術目前被廣泛地應用于疾病診斷等方面。
[解析] 多聚酶鏈式反應（PCR）是一種體外迅速擴增特定DNA片段的技術，它能以極少量的DNA為模板，在短時間內大量擴增目的基因。
命題點2 基因工程的基本操作程序分析
3. [2023浙江三市聯考，多選]自然界中很少出現藍色的花，天然藍色花產生的主要原因是花瓣細胞液泡中花青素在堿性條件下顯藍色。我國科學家利用鏈霉菌的靛藍合成酶基因 及其激活基因 構建基因表達載體（如圖），通過農桿菌轉化法導入白玫瑰中，在細胞質基質中形成穩定顯色的靛藍。下列敘述錯誤的是( AC )
A. 上述獲得藍色玫瑰的方案中需要轉入能調控液泡 的基因
B. 將 基因插入 質粒時宜使用的限制酶是 和
C. 和 基因具有各自的啟動子，前者調控后者的表達
D. 農桿菌可將 質粒上的 整合到白玫瑰染色體DNA上
[解析] 分析題意，用農桿菌轉化法將鏈霉菌的靛藍合成酶基因 及其激活基因 導入白玫瑰后，在細胞質基質中形成穩定顯色的靛藍，所以不需要轉入能調控 的基因，A錯誤；分析題圖可知，將 基因插入 質粒時可用 和 限制酶，B正確；分析題圖可知， 和 基因具有各自的啟動子，表達是相互獨立進行的，C錯誤；將目的基因導入植物細胞可用農桿菌轉化法，農桿菌可將 質粒上的 整合到白玫瑰染色體DNA上，D正確。
4. [2021福建節選，10分]微生物吸附是重金屬廢水的處理方法之一。金屬硫蛋白 是一類廣泛存在于動植物中的金屬結合蛋白，具有吸附重金屬的作用。科研人員將棗樹的 基因導入大腸桿菌構建工程菌。回答下列問題：
（1） 根據棗樹的 的核苷酸序列設計了相應的引物（圖中甲），通過PCR擴增 基因。已知 位點和 位點分別是起始密碼子和終止密碼子對應的基因位置。選用的引物組合應為引物1和引物4。
[解析] 據題中信息知， 位點和 位點分別是起始密碼子和終止密碼子對應的基因位置，若要通過PCR技術擴增 基因，應選用引物1和引物 。
（2） 本實驗中，PCR所用的DNA聚合酶擴增出的 基因的末端為平末端。由于載體 只有能產生黏性末端的酶切位點，需借助中間載體 將 基因接入載體 。載體 和載體 的酶切位點及相應的酶切序列如圖中乙所示。
[解析]
① 選用 酶將載體 切開，再用 （填“ ”或“ ”）連接酶將 基因與載體 相連，構成重組載體 。
[解析] 通過PCR技術擴增出的 基因的末端為平末端，載體 中有限制酶 、 、 、 的酶切位點，用限制酶 、 切割載體 得到的均為黏性末端，而用限制酶 和 切割載體 得到的均是平末端,但不能用限制酶 進行酶切，若用限制酶 進行酶切，無法將目的基因插入載體 中，因此，應選用 酶將載體 切開，再用能連接平末端的 連接酶將 基因與載體 相連，構成重組載體 。
② 載體 不具有表達 基因的啟動子和終止子。選用 和 酶組合對載體 和載體 進行酶切，將切下的 基因和載體 用DNA連接酶進行連接，將得到的混合物導入用鈣離子處理的大腸桿菌，篩出 工程菌。
[解析] 載體 不具有表達 基因的啟動子和終止子。再選用 和 酶組合對載體 和載體 進行酶切，將切下的 基因和載體 用DNA連接酶進行連接，將得到的混合物導入用鈣離子處理的大腸桿菌中，篩出 工程菌。
考點3 DNA的粗提取與鑒定及DNA片段的擴增與鑒定
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1.DNA的粗提取與鑒定
2.DNA片段的擴增及電泳鑒定
（1）原理
（2）方法步驟
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深度思考
1. 能否選擇哺乳動物的成熟紅細胞作為DNA粗提取的實驗材料，為什么？
提示 不能。因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體等，不含DNA。
2. DNA的粗提取實驗中，過濾時能否用濾紙代替紗布？
提示 不可以，因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。
基礎自測
1. 進行“DNA的粗提取”實驗時為獲得較好的提取效果,應離心2次,第一次離心后應保留上清液,第二次離心后應棄去上清液,且兩次離心的轉速也不相同。( √ )
2. PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭等在使用前必須進行高壓蒸汽滅菌。( √ )
3. 聚合酶是用PCR儀對DNA分子擴增過程中常用的一種耐高溫的DNA聚合酶。( √ )
4. PCR中離心的目的是讓反應組分在離心管中分層分布。( × )
5. 電泳鑒定PCR產物時,應在每個加樣孔中加入等量的PCR產物與凝膠載樣緩沖液的混合液。( × )
高考幫 研透高考 明確方向
命題點1 DNA的粗提取與鑒定
1. [2022山東]關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是( B )
A. 過濾液沉淀過程在 冰箱中進行是為了防止DNA降解
B. 離心研磨液是為了加速DNA的沉淀
C. 在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色
D. 粗提取的DNA中可能含有蛋白質
[解析] 低溫時DNA酶的活性較低，過濾液沉淀過程在 冰箱中進行是為了防止DNA降解，A正確；離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀，B錯誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色，C正確；細胞中的某些蛋白質可能不溶于酒精，在體積分數為 的冷酒精中與DNA同時析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質，D正確。
命題點2 DNA片段的擴增與電泳鑒定
2. [2023煙臺檢測]正常情況下， 基因只在胎盤組織和腦組織中表達，為了探究 基因在肝癌細胞中的表達情況，實驗小組分別提取肝癌組織和正常組織細胞的RNA，以RNA為模板指導合成單鏈 ，再將獲得的 進行電泳，電泳結果如表所示。下列相關敘述正確的是( C )
表達 基因樣本 正常肝組織樣本 肝癌樣本1 肝癌樣本2 肝癌樣本3
A. 以RNA為模板合成 時需要加入RNA聚合酶
B. 以RNA為模板合成的 中的嘌呤數目和嘧啶數目相等
C. 基因的表達情況可作為肝細胞是否癌變的檢測依據
D. 該實驗也可以直接提取肝組織細胞中的DNA后再進行電泳
[解析] RNA聚合酶的作用是促進RNA的合成，因此合成 時，不需加入RNA聚合酶，A錯誤；以RNA為模板形成的 為單鏈DNA，并無堿基互補配對，因此不一定存在嘌呤數目和嘧啶數目相等的現象，B錯誤；由題意可知，正常肝組織細胞中無 基因的表達，而肝癌組織細胞中有 基因的表達，因此該基因的表達情況可以作為肝細胞是否癌變的檢測依據，C正確；直接從肝組織細胞中提取出來的DNA鏈過長，在電泳過程中移動較慢或者不移動，不易觀察，D錯誤。
教師尊享·備課題組
1. [2022遼寧]抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12-5是我國自主研發的轉基因品種。為給監管轉基因生物安全提供依據，采用PCR方法進行目的基因監測，反應程序如圖所示。下列敘述正確的是( B )
A. 預變性過程可促進模板DNA邊解旋邊復制
B. 后延伸過程可使目的基因的擴增更加充分
C. 延伸過程無需引物參與即可完成半保留復制
D. 轉基因品種經檢測含有目的基因后即可上市
[解析] 預變性的溫度為 ，在這個溫度下，雙鏈DNA解旋為單鏈，但模板鏈不易和引物結合，不能進行復制，A錯誤。延伸的目的是合成新的子鏈，后延伸延長了延伸時間，使目的基因的擴增更加充分，B正確。延伸過程需要引物與模板鏈結合,在引物的 端加上相應的核苷酸，C錯誤。轉基因品種經檢測含有目的基因且已經表達使生物體表現出相應性狀后，還需要經過系列的安全性評價，符合相應標準后才能上市，D錯誤。
2. [2021山東]粗提取DNA時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液進行下列處理后再進行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是( A )
A. 加入適量的木瓜蛋白酶
B. 的水浴箱中保溫10～15分鐘
C. 加入與濾液體積相等的、體積分數為 的冷卻的酒精
D. 加入 調節濃度至 過濾→調節濾液中 濃度至
[解析] 木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質，故在得到的濾液中加入適量的木瓜蛋白酶后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物，A符合題意。將制備的含有DNA的濾液放入 的水浴箱中保溫10～15分鐘，利用DNA和蛋白質對高溫的耐受性不同，使蛋白質變性，從而更好地與DNA分離，B不符合題意。DNA不溶于體積分數為 的冷卻的酒精，因此向含有DNA的濾液中加入與濾液體積相等的、體積分數為 的冷卻的酒精后DNA會析出，不能得到DNA相對含量較高的白色絲狀物，C不符合題意。DNA在 的 溶液中的溶解度最低，因此將含DNA的 溶液調至 ，濾液中幾乎不含DNA，D不符合題意。
3. [2022遼寧節選，10分]某抗膜蛋白治療性抗體藥物研發過程中，需要表達 蛋白胞外段，制備相應的單克隆抗體，增加其對 蛋白胞外段特異性結合的能力。 蛋白胞外段抗原制備，流程如圖。
（1） 構建重組慢病毒質粒時，選用氨芐青霉素抗性基因作為標記基因，目的是篩選出含目的基因（ 蛋白胞外段基因）的病毒包裝細胞。用脂質體將重組慢病毒質粒與輔助質粒導入病毒包裝細胞，質粒被包在脂質體雙分子層中（填“雙分子層中”或“兩層磷脂分子之間”）。
[解析] 構建重組慢病毒質粒時，選用氨芐青霉素抗性基因作為標記基因，將病毒包裝細胞在含有氨芐青霉素的培養基上培養，就可以將含有目的基因（ 蛋白胞外段基因）的病毒包裝細胞篩選出來。用脂質體將重組慢病毒質粒與輔助質粒導入病毒包裝細胞，質粒被包在脂質體的雙分子層中。
（2） 質粒在包裝細胞內組裝出由 蛋白胞外段基因重組慢病毒質粒、輔助質粒和蛋白質外殼組成的慢病毒，用慢病毒感染海拉細胞進而表達并分離、純化 蛋白胞外段。
[解析] 質粒在包裝細胞內組裝出由 蛋白胞外段基因重組慢病毒質粒、輔助質粒和蛋白質外殼組成的慢病毒，用慢病毒感染海拉細胞進而表達并分離、純化 蛋白胞外段。
4. [2021江蘇，11分]某小組為研究真菌基因 的功能，構建了融合表達蛋白 和 標簽的質粒。請結合實驗流程回答下列問題。
（1） 目的基因的擴增：
① 提取真菌細胞RNA，經逆轉錄獲得 ,進一步獲得基因 片段。
② 為了獲得融合 標簽的蛋白 ，設計引物P2時，不能包含基因 終止密碼子的編碼序列，否則將導致蛋白 上不含 標簽。
[解析] 從構建好的重組質粒來看， 序列位于目的基因下游，若設計的引物P2上包含基因 終止密碼子的編碼序列,則獲得的蛋白 上不含 標簽。③由題中信息“加熱到 以上 擴增”可知， 酶的最適催化溫度在 左右，A錯誤； 酶不具有特異性，D錯誤。
③ 熱啟動PCR可提高擴增效率，方法之一是先將除 聚合酶（ 酶）以外的各成分混合后，加熱到 以上再混入酶，然后直接從 開始PCR擴增。下列敘述正確的有BC。
A. 酶最適催化溫度范圍為
B. 與常規PCR相比，熱啟動PCR可減少反應起始時引物錯配形成的產物
C. 兩條子鏈的合成一定都是從 端向 端延伸
D. PCR產物DNA堿基序列的特異性體現了 酶的特異性
（2） 重組質粒的構建：
① 將 切開的載體 與添加同源序列的 混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進黏性末端堿基配對，形成 結合體。將 結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及DNA連接酶等，完成質粒的環化。
② 若正確構建的重組質粒 仍能被 切開，則 的酶切位點可能在基因 的連接處、基因 的內部。
[解析] 由題圖可知,載體 上只有一個 的酶切位點，用 將載體 切開，用特定的DNA酶處理形成黏性末端，則載體 上 的酶切位點不存在了。若正確構建的重組質粒 仍能被 切開，則 的酶切位點可能在基因 內部，也可能在基因 的連接處。
（3） 融合蛋白的表達：
① 用含有尿嘧啶的培養基培養 基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導入質粒 ,然后涂布于無尿嘧啶的培養基上，篩選獲得目的菌株，其機理是受體菌在無尿嘧啶的培養基上無法生長，導入重組質粒的受體菌含有 基因可以長成菌落。
[解析] 篩選獲得目的菌株的機理是導入重組質粒 的菌株由于含有 基因，能在無尿嘧啶的培養基上存活，而 基因缺失型酵母在無尿嘧啶的培養基上不能存活。
② 若通過抗原—抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含 標簽，說明融合基因表達，后續實驗可借助 標簽進行蛋白 的分離純化。
[解析] 若通過抗原—抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含 標簽，說明融合基因表達。
作業幫 練透好題 精準分層
基礎過關
一、選擇題
1. [2022延安檢測]下列關于基因工程的敘述錯誤的是( D )
A. 基因工程是按照人們的愿望，進行嚴格的設計，在體外進行的操作技術
B. 基因工程是在分子水平上進行設計和施工的
C. 基因工程賦予生物新的遺傳特性，可以創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品
D. 基因工程常用的載體質粒中含有兩個游離的磷酸基團
[解析] 基因工程是按照人們的愿望，進行嚴格的設計，在體外進行的操作技術，基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，A、B正確；基因工程賦予生物新的遺傳特性，可以創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品，C正確；質粒為環狀的DNA分子，不含有游離的磷酸基團，D錯誤。
2. [2023湖南模擬]限制性內切核酸酶 的識別序列及切割位點是，用 完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到DNA片段的平均長度（堿基對）約為( C )
A. B. C. D.
[解析] 據圖可知， 的識別序列有6個核苷酸，由于DNA分子的堿基組成為 、 、 、 ，則某一位點出現該序列的概率為 ，即約4 000個堿基對可能出現一個限制酶 的酶切位點，故理論上得到DNA片段的平均長度（堿基對）約為 ，C符合題意。
3. [2022贛州檢測]如圖表示DNA分子在不同酶的作用下所發生的變化，下列表示限制酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用圖解的正確順序的是( C )
A. ①②③④ B. ①②④③ C. ①④②③ D. ①④③②
[解析] 圖中①表示切割DNA片段，并且形成了黏性末端，需要用限制酶；②表示將兩個DNA片段連接起來，需要用DNA連接酶；③表示解旋過程，需要用解旋酶；④表示DNA復制過程，需要用DNA聚合酶。綜上分析，C符合題意。
4. [2023孝感檢測]PCR技術在生物工程中應用廣泛，PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定，下列有關敘述錯誤的是( C )
A. PCR及電泳過程中用到了多種緩沖液，PCR反應的緩沖液中一般要添加 用于激活DNA聚合酶，凝膠中的DNA可用紫外燈進行檢測
B. 用于構建基因表達載體的質粒用限制酶切割前后長度可能不發生變化，此時無法通過電泳檢測質粒是否被切開
C. PCR反應體系中需加入耐高溫的DNA聚合酶，該酶主要在復性過程起作用
D. 采用PCR技術對一個DNA進行擴增，第 次循環共需要引物 個
[解析] 真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要 激活，因此PCR反應的緩沖液中一般要添加 ，凝膠中的DNA可用紫外燈進行檢測，A正確。用一種限制酶切割用于構建基因表達載體的質粒后，質粒由環狀的DNA分子變為線狀的DNA分子，此時酶切前后質粒長度不發生變化，無法通過電泳檢測質粒是否被切開，B正確。PCR反應體系中需加入耐高溫的DNA聚合酶，該酶主要在延伸過程起作用，C錯誤。PCR技術擴增時，每一輪循環每個DNA分子的每條模板鏈都需要一個引物，故第 次循環共需要引物為 個，D正確。
5. 研究人員比較了不同儲藏條件對棉葉DNA純度及提取率（提取率越高，獲得的DNA越多）的影響，實驗結果如圖所示。下列有關敘述錯誤的是( A )
A. 提純DNA時可加入體積分數為 的酒精去除蛋白質等物質
B. 從新鮮棉葉中提取的DNA純度最高，但提取DNA的量不是最多的
C. 用二苯胺試劑鑒定，藍色最深的是冷凍 處理后提取的DNA
D. DNA在 溶液中的溶解度隨溶液濃度的不同而不同
[解析] DNA不溶于酒精，但細胞中的某些蛋白質溶于酒精，所以DNA的粗提取和鑒定實驗中，提純DNA時，加入冷卻的體積分數為 的酒精可以去除部分蛋白質，形成含雜質較少的DNA絲狀物，A錯誤；由圖可知，從新鮮棉葉中提取的DNA純度和冷凍 處理后提取的DNA純度接近，但提取率明顯較冷凍 處理后的提取率低，因此從新鮮棉葉中提取DNA的量不是最多的，B正確；由圖可知，從冷凍 的棉葉中提取的DNA量是最多的，因此用二苯胺試劑鑒定時顏色最深，C正確；DNA在不同濃度 溶液中的溶解度不同，DNA在 的 溶液中的溶解度最低，高于或低于該濃度，DNA的溶解度都會增大，D正確。
6. [2022青島調研，多選]DNA片段有 發生變性時的溫度稱為熔解溫度 。變性梯度凝膠電泳 是一種根據DNA片段的熔解性質而使之分離的凝膠系統。 的凝膠中沿電場方向變性劑含量遞增，當DNA片段通過這種變性劑遞增的凝膠時，不同分子的電泳遷移率在不同區域會發生改變，可使核苷酸序列不同的DNA片段分開。下列說法正確的是( AC )
A. 的大小主要取決于DNA分子中 、 含量的多少
B. 不能用來檢測DNA分子中堿基是否發生改變
C. 變性劑含量的改變會影響DNA分子中氫鍵的斷裂
D. 提高電泳溫度有利于DNA分子變性，提高分離效率
[解析] 、 之間有三個氫鍵，而 、 之間有兩個氫鍵， DNA分子中 、 含量越高，則DNA分子的熱穩定性越高，因此 的大小主要取決于DNA分子中 、 含量的多少，A正確；據題干信息“變性梯度 片段分開”可知，DNA分子中堿基發生改變，則進行變性梯度凝膠電泳時，該DNA分子的電泳遷移率在某些區域會發生改變，即 能用來檢測DNA分子中堿基是否發生改變，B錯誤；由題意可知，變性劑會使DNA分子的氫鍵斷裂從而熔解DNA片段，故變性劑含量的改變會影響DNA分子中氫鍵的斷裂，C正確；根據熔解溫度的概念和 的原理可知，提高電泳溫度一般對分離效率無影響，D錯誤。
7. [2023大同檢測]為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因 （圖1），擬將其與質粒（圖2）重組，再借助農桿菌導入菊花細胞中。
下列操作與實驗目的不符的是( C )
A. 用限制性內切核酸酶 和DNA連接酶構建重組質粒
B. 用含 基因的農桿菌侵染菊花愈傷組織，將 基因導入細胞
C. 在培養基中添加卡那霉素，篩選被轉化的菊花細胞
D. 用PCR技術檢測 基因是否整合到菊花染色體上
[解析] 根據目的基因兩側的限制酶切割位點可知，用限制性內切核酸酶 和DNA連接酶構建重組質粒，A正確；將目的基因導入植物細胞常用農桿菌轉化法，即用含 基因的農桿菌侵染菊花愈傷組織，將 基因導入細胞，B正確；圖2中顯示標記基因是潮霉素抗性基因，因此可在培養基中添加潮霉素，篩選被轉化的菊花細胞，C錯誤；可采用PCR技術檢測 基因是否整合到菊花染色體上，D正確。
8. [2022山東質檢]楊樹被根瘤農桿菌感染后會長出瘤狀物，稱為冠癭瘤，冠癭瘤內的冠癭堿是一種含氮有機物，它是根瘤農桿菌生存所需的碳源和氮源。冠癭瘤的形成是由于根瘤農桿菌攜帶天然的 質粒，該質粒的結構如圖所示。下列說法錯誤的是( C )
A. 質粒上的生長素基因可在楊樹生長發育過程中發揮作用
B. 質粒上的 區域至少含有一個限制酶的切割位點
C. 冠癭堿合成基因在根瘤農桿菌細胞中表達并分泌到細胞外
D. 根瘤農桿菌內 質粒的存在決定了其感染植物的范圍
[解析] 質粒上的生長素基因可隨 整合到楊樹細胞的染色體DNA上，并進行表達，故 質粒上的生長素基因可在楊樹生長發育過程中發揮作用，A正確； 質粒上的 區域至少含有一個限制酶的切割位點，以便轉入目的基因，B正確；冠癭堿合成基因會隨 整合到楊樹細胞的染色體DNA上，并在楊樹細胞中表達，C錯誤；根瘤農桿菌內 質粒的存在決定了其能感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有感染能力，D正確。
二、非選擇題
9. [2023重慶聯考，15分]通過咽拭子取樣進行 檢測是目前臨床上診斷新冠病毒感染疑似患者的常用方法，用于核酸檢測的 試劑盒的部分工作原理簡圖如下:
（1） 是指以病毒的RNA為模板通過逆轉錄合成 ，并對 進行PCR擴增的過程。利用 試劑盒進行核酸檢測時，除借助上述 技術外，還需要有特異性探針，利用該探針進行核酸檢測的原理是分子雜交。若用 技術擴增胰島素基因，應選擇胰島 細胞提取RNA。
[解析] 以RNA為模板合成 的過程為逆轉錄過程。制作特異性探針依據的是新冠病毒的核苷酸序列，利用該探針進行核酸檢測的原理是分子雜交。若用 技術擴增胰島素基因，應選擇胰島 細胞提取RNA。
（2） 與體內DNA復制相比，PCR時不需要解旋酶。利用PCR技術擴增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列。
[解析] 利用PCR技術擴增目的基因時，在高溫條件下，DNA雙鏈可解旋成單鏈，因此與體內DNA復制相比，PCR時不需要解旋酶。
（3） 若將一個DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖液中至少加入 個引物。
[解析] 利用PCR技術大量擴增目的基因時，緩沖液中需要加入的引物個數的計算公式為 ，因此，若將一個DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖液中至少加入 個引物。
（4） PCR反應中的每次循環可分為變性、復性、延伸三步，其中復性是指兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。
[解析] PCR反應中的每次循環可分為變性、復性、延伸三步，其中復性是指兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。
10. [2023廣西檢測，15分]某種熒光蛋白 在紫外光或藍光激發下會發出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白 基因連接在 基因的 末端，獲得了 融合基因（簡稱為甲），并將其插入質粒P0，構建了真核表達載體P1，其部分結構和酶切位點的示意圖如下，圖中 四種限制酶產生的黏性末端各不相同。
（1） 據圖推斷，該團隊在將甲插入質粒P0時，使用了兩種限制酶，這兩種限制酶是 和 。使用這兩種限制酶進行酶切是為了保證甲的完整，也是為了保證甲與載體正確連接。
[解析] 為了使目的基因在受體細胞中表達，目的基因的首端應有啟動子，尾端應有終止子。甲（ 融合基因）是將某種病毒的外殼蛋白 基因連接在 基因的 末端獲得的，再結合圖示分析可知，將甲插入質粒P0時，如果用限制酶 或 進行切割，則甲會被破壞，而使用 和 這兩種限制酶進行酶切既保證了甲的完整，也保證了甲與載體正確連接，因此，使用的兩種限制酶是 和 。
（2） 將P1轉入體外培養的牛皮膚細胞后，若在該細胞中觀察到了綠色熒光，則說明 基因在牛的皮膚細胞中完成了轉錄和翻譯過程。
[解析] 構建的真核表達載體P1中含有 基因，而 基因的表達產物是某種熒光蛋白 ，該種熒光蛋白在紫外光或藍光激發下會發出綠色熒光。將P1轉入體外培養的牛皮膚細胞后，若在該細胞中觀察到了綠色熒光，則說明 基因在牛的皮膚細胞中完成了表達。基因的表達過程包括轉錄和翻譯。
（3） 為了獲得含有甲的牛，該團隊需要做的工作包括將能夠產生綠色熒光的細胞的細胞核移入牛的去核卵母細胞中，然后進行體外培養、胚胎移植等。
[解析] 若要獲得含有甲的牛，可采用核移植技術，即將能夠產生綠色熒光的細胞的細胞核移入牛的去核卵母細胞中獲得重組細胞，再將該重組細胞在體外培養成重組胚胎，最后進行胚胎移植等。
（4） 為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學用PCR技術進行鑒定。在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的核DNA（填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”）作為PCR模板。
[解析] PCR是一項在生物體外復制特定DNA片段的技術。若利用PCR檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，則在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的核DNA作為PCR模板。
11. [2023昆明質檢，15分]如圖為“乙肝基因工程疫苗”生產過程圖解，質粒上箭頭所指部位為相應的限制酶的切割位點。質粒中 基因編碼產生的酶可以分解培養基中的 ，產生藍色物質，使菌落呈現藍色；否則菌落為白色。
回答下列問題。
（1） 過程①選用限制酶的最佳方案是B。
A. 和 B. 和 C. 和 D. 只有
[解析] 為了酶切目的基因，可以選擇 和 、 和 、 和 這些限制酶組合，為了酶切質粒載體，可以選擇 和 ，不能選擇 ，否則會破壞青霉素抗性基因，影響篩選，因此構建重組質粒時選用限制酶的最佳方案是 和 ,故選B。
（2） 構建基因表達載體時，一般將目的基因插在啟動子和終止子之間。啟動子的作用是RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動目的基因轉錄出mRNA。
[解析] 構建基因表達載體時，一般將目的基因插在啟動子和終止子之間。啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，能驅動目的基因轉錄出mRNA。
（3） 為了篩選含目的基因表達載體的大腸桿菌，可在培養大腸桿菌的通用培養基中額外加入青霉素和 ，培養一段時間后挑選出白色（填“藍色”或“白色”）的菌落進一步培養，從而獲得大量目的菌。實驗室中通過發酵工程可以對目的菌進行擴大培養，一般選用液體（填“液體”或“固體”）培養基，理由是大腸桿菌能與液體培養基中的營養物質和氧氣充分接觸，有利于其大量繁殖。
[解析] 轉基因成功的大腸桿菌內含有青霉素抗性基因且 基因被破壞，因此需要在培養基中加入青霉素和 ；無 基因，則菌落呈白色，有青霉素抗性基因，則在含青霉素的培養基中能存活，因此若出現白色菌落，則說明基因表達載體成功轉入大腸桿菌。實驗室中通過發酵工程可以對目的菌進行擴大培養，一般選用液體培養基，這樣大腸桿菌能與液體培養基中的營養物質和氧氣充分接觸，有利于其大量繁殖。
（4） 目的基因導入受體細胞后，常用抗原—抗體雜交技術檢測目的基因是否翻譯出乙肝病毒外殼蛋白。
[解析] 目的基因導入受體細胞后，檢測目的基因是否翻譯出蛋白質可用抗原—抗體雜交技術。
能力提升
一、選擇題
12. [2023南京六校調研]大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進行兩輪PCR反應即可獲得，第一輪加誘變引物和側翼引物，第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物，過程如圖所示。下列有關敘述正確的是( D )
A. 兩輪PCR過程中復性時的溫度一樣
B. 單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因重組
C. 第二輪PCR所用的引物都是第一輪PCR的產物——DNA的兩條鏈
D. 利用該技術將某功能蛋白的結構改變屬于蛋白質工程
[解析] 單核苷酸的定點誘變需進行兩輪PCR反應，第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物，為了使引物與模板鏈準確配對，第二輪PCR的復性溫度應比第一輪的高，A錯誤；單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因突變，B錯誤；由圖可知，第二輪PCR需加入另一種側翼引物，C錯誤；蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎,通過改造或合成基因，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，利用該技術將某功能蛋白的結構改變屬于蛋白質工程，D正確。
13. [多選]用 和 兩種限制酶分別處理同一DNA片段，酶切位點及酶切產物分離結果如圖1和圖2所示。以下敘述錯誤的是( BC )
A. 圖1中兩種酶識別的核苷酸序列不同
B. 圖2中泳道②的酶切產物說明該限制酶斷開了6個磷酸二酯鍵
C. 若用兩種限制酶同時切割該DNA，電泳后泳道中將出現7條條帶
D. 圖2泳道①中是用 處理得到的酶切產物
[解析] 不同的限制酶識別并切割的核苷酸序列不同，圖1中兩種酶識別的核苷酸序列不同，A正確。分析圖1和圖2可知，泳道②是限制酶 的酶切結果，該DNA片段共有2個該限制酶酶切位點，所以斷開了4個磷酸二酯鍵，B錯誤。由題圖可知，若用兩種限制酶同時切割該DNA，該DNA的每個酶切位點都會被切開，則將被切成6個片段，如果6個片段分子大小不同則在泳道中出現6條條帶；如果其中有片段分子大小相同，則條帶數目小于6條，C錯誤。根據圖2分析泳道①中是用 處理（其有3處切割位點，切割后產生4個DNA片段）得到的酶切產物，D正確。
14. [2023南通檢測，多選] 細胞療法是通過設計 基因，導入癌癥患者的 細胞中，使其轉化為 細胞， 細胞膜上的 蛋白與癌細胞表面抗原特異結合后，激活 細胞使其增殖、分化，從而實現對癌細胞的特異性殺傷和記憶，主要過程如圖。腫瘤浸潤淋巴細胞是對腫瘤起識別、抵抗和攻擊作用的細胞群體。下列說法正確的是( AD )
A. 胞外結合區DNA序列可來自患者自身的腫瘤浸潤淋巴細胞
B. 基因缺少啟動子，無法在 細胞中復制，故過程②在導入 細胞前完成
C. 重組分子導入 細胞后，應當用PCR技術檢驗指導 合成的基因是否表達成功
D. 細胞療法具有持久性是因為 細胞能夠在體內形成記憶細胞
[解析] 由題意可知， 細胞膜上的 蛋白可與癌細胞表面抗原特異結合，因此 蛋白的胞外結合區DNA序列可來自患者自身的腫瘤浸潤淋巴細胞，A正確；啟動子能啟動目的基因的轉錄， 基因缺少啟動子，無法在 細胞中轉錄，故過程②在導入 細胞前完成，B錯誤；通過PCR技術可以檢測目的基因是否成功插入或轉錄出mRNA，不能檢驗指導 合成的基因是否表達成功，C錯誤；由圖可知， 細胞能夠在體內形成記憶細胞，因此 細胞療法具有持久性，D正確。
二、非選擇題
15. [2023河南模擬，13分]科研人員通過轉基因技術培育出超量表達 蛋白的轉基因甜玉米。在超量表達 基因載體的構建中，含 基因的DNA片段以及 質粒的酶切位點如圖所示，其中強啟動子能驅動基因的持續轉錄。請回答下列問題。
限制酶 識別序列
（1） 以RNA為模板，通過 技術可獲取 基因。進行 時需加入的酶有逆轉錄酶和耐高溫的DNA聚合酶。為了特異性擴增 基因序列，需根據 基因兩端的堿基序列設計特異性引物。
[解析] 以RNA為模板獲取 基因需要用到逆轉錄酶，進行PCR時需要用到耐高溫的DNA聚合酶。為了特異性擴增 基因序列，需根據 基因兩端的堿基序列設計特異性引物。
（2） 在構建基因表達載體時，應優先選用的限制酶是 和 ，這樣操作不僅使 基因在玉米植株中超量表達，還可利用 的可轉移特性，最終使 基因整合到玉米細胞染色體DNA上。
[解析] 在構建基因表達載體時，要想使 基因在玉米植株中超量表達，需要把強啟動子和 基因一起切割下來，再結合含 基因的DNA片段以及 質粒的酶切位點可知，基因上游需要用限制酶 切割，基因下游含限制酶 和 的酶切位點，在質粒中， 的酶切位點在 的酶切位點的左側，終止子在右側，如果用 、 切割，目的基因和質粒連接后， 基因不在啟動子和終止子之間，因此在構建基因表達載體時，應優先選用的限制酶是 和 。 是 質粒上的一個可轉移的DNA片段。如果將目的基因插入 質粒的 上，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞，并將其插到植物細胞中染色體的DNA上。
（3） 對轉基因再生玉米植株進行鑒定時發現，有些植株雖有 基因，但幾乎沒有 蛋白，出現該現象的原因可能有基因轉化過程中強啟動子可能丟失或斷裂，未能真正轉化成功；雖然轉化成功，但是 基因保持沉默，不能有效表達（合理即可）。
[解析] 有些植株雖有 基因，但幾乎沒有 蛋白，出現該現象的原因可能有基因轉化過程中強啟動子可能丟失或斷裂，未能真正轉化成功；雖然轉化成功，但是 基因保持沉默，不能有效表達等。
16. [2023成都市七中零診，15分]人乳鐵蛋白 對細菌、真菌和病毒等都有抑制作用。研究人員開展人乳鐵蛋白基因乳腺特異性表達載體構建及轉染研究，主要流程如圖。 過程需先進行逆轉錄合成 ，然后再進行PCR。圖中 、 、 、 代表相關限制酶酶切位點， 為新霉素抗性基因， 基因為 乳鐵蛋白基因， 基因為綠色熒光蛋白基因。請回答：
（1） 過程①不能從人肌肉細胞中提取RNA用于 ，是因為 基因在人肌肉細胞中不表達。在 過程中，加入的引物需在 端添加 和 兩種限制酶的識別序列，以便 基因插入 質粒中。
[解析] 由于 基因在人肌肉細胞中不表達，因此過程①不能從人肌肉細胞中提取RNA用于 。根據質粒的復制方向和過程②構建的重組質粒中目的基因兩側限制酶的識別序列可知，在 過程中，加入的引物需在 端添加 和 兩種限制酶的識別序列，以便 基因插入 質粒中。
（2） 過程②中， 基因插入 基因之后的目的是使 基因在山羊乳腺上皮細胞中表達（或使目的基因表達）。
[解析] 過程②中， 基因在復制原點之后、終止子之前，故 基因插入 基因之后的目的是使人乳鐵蛋白基因在山羊的乳腺細胞中表達。
（3） 過程③中利用磷脂分子構成脂質體介導的機理是利用生物膜的流動性使脂質體與山羊乳腺上皮細胞融合，從而將（重組）質粒導入受體細胞。
我們還學過利用顯微注射法將基因表達載體導入動物受體細胞。
[解析] 利用生物膜的流動性使脂質體與山羊乳腺上皮細胞融合，將重組質粒導入受體細胞。顯微注射法也可將基因表達載體導入動物受體細胞。
（4） 將轉染后的山羊乳腺上皮細胞先置于含新霉素的培養液中培養，能夠存活的細胞應該是導入 質粒、 質粒的細胞，再利用熒光顯微鏡觀察山羊乳腺上皮細胞中是否有綠色熒光，以篩選出轉染成功的細胞。
[解析] 質粒上有新霉素抗性基因，可使導入質粒的細胞在含新霉素的培養基中生存，將轉染后的山羊乳腺上皮細胞先置于含新霉素的培養液中培養，能夠存活的細胞應該是導入 質粒或 質粒的細胞； 質粒上有綠色熒光蛋白基因，可使細胞產生綠色熒光，利用熒光顯微鏡觀察山羊乳腺上皮細胞中是否有綠色熒光，以篩選出轉染成功的細胞。
（5） 科研過程中，也可以用PCR技術檢測受體細胞是否成功轉入了目的基因。提取轉染后的細胞的全部DNA分子，用目的基因的引物擴增。擴增完畢后，檢測發現擴增產物中除目的基因外，還有其他不同大小的非目的基因片段，可能的原因一般有①③。
①模板受到污染 ②復性溫度過高
③引物太短 ④延伸溫度偏低
[解析] 模板受到污染和引物太短可能會使擴增產物中除目的基因外，還有其他不同大小的非目的基因片段，故提取轉染后的細胞的全部DNA分子，用目的基因的引物擴增。擴增完畢后，檢測發現擴增產物中除目的基因外，還有其他片段，故可能的原因一般有①③。

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