資源簡介

新人教高考生物（不定項版）二輪專題復習
專題七　生物技術與工程
考點3　基因工程
基因工程的操作對象是DNA分子，利用限制酶、DNA連接酶、載體等進行基因工程的操作，基因工程在農牧業、醫藥衛生、食品工業等方面有廣泛的應用，在基因工程的基礎上，崛起了第二代基因工程—蛋白質工程。
(對照課本回顧主干知識)
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
重要概念1　基因工程是一種重組DNA技術
[例1]　(2020·北京等級考)為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中(如圖)。
為檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因，同時避免內源HMA3基因的干擾，在進行PCR擴增時，應選擇的引物組合是(　　)
A.①＋③ B．①＋②
C.③＋② D．③＋④
答案　B
解析　PCR擴增時，由于子鏈延伸方向為5′端到3′端，因此應在模板DNA兩條鏈的3′端分別設計一個引物，A錯誤；為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者擴增獲得的DNA片段只要既包含外源高效啟動子序列又包含HMA3基因的序列，便可在檢測是否有HMA3基因的同時，又可排除內源HMA3基因的干擾，若用③＋②或③＋④引物組合進行PCR擴增，擴增獲得的HMA3基因不包含外源高效啟動子序列，C、D錯誤；若用①＋②或①＋④引物組合進行PCR擴增，獲得的DNA片段符合要求，B正確。
[例2]　(2022·北京海淀期末)乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物質，由乳酸脫氫酶催化產生，影響白酒品質和風格。科研人員將釀酒酵母質粒上的丙酮酸脫氫酶基因(PD)替換為植物乳桿菌中的乳酸脫氫酶基因(L－PG)，可獲得乳酸乙酯高產菌株，該過程如圖所示。下列關于該過程的分析不合理的是(　　)
A.轉入的L－PG基因表達產物不能影響釀酒酵母活性
B.可以利用PCR技術篩選含有L－PG基因的受體細胞
C.通過同源重組實現酵母菌的PD基因被替換為L－PG基因
D.標記基因Amp′可檢測是否成功構建乳酸乙酯高產菌株
答案　D
解析　釀酒酵母質粒上的PD基因替換為L－PG基因前后，標記基因Amp′均正常，故標記基因Amp′不能檢測是否成功構建乳酸乙酯高產菌株。
[例3]　(不定項)下列關于生物工程中常見的敘述，正確的是(　　)
A.DNA連接酶可把目的基因與載體的黏性末端的堿基黏合，形成重組DNA
B.限制性內切核酸酶將一個DNA分子片段切成兩個片段需消耗兩個水分子
C.在進行基因工程操作中，天然質粒需經過人工改造后才能作為載體
D.利用酶解法處理植物細胞獲得原生質體，便于進行植物雜交育種
答案　BC
解析　DNA連接酶可把目的基因與載體的黏性末端或平末端的磷酸二酯鍵黏合，形成重組DNA，A錯誤；限制性內切核酸酶將一個DNA分子片段切成兩個片段，即斷裂兩個磷酸二酯鍵，因此需消耗兩個水分子，B正確；在進行基因工程操作中，真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的，C正確；用酶處理植物細胞獲得原生質體，便于植物細胞融合，屬于植物體細胞雜交技術，植物雜交育種一般是通過雜交的方式獲得所需的子代，D錯誤。
[例4]　(2021·全國乙卷改編)用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內切核酸酶的切割位點如圖所示。
回答下列問題：
(1)常用的DNA連接酶有E.coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶。上圖中________________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA連接酶連接。上圖中______________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。
(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段之間形成的化學鍵是__________。
(3)DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征，如質粒DNA分子上有復制原點，可以保證質粒在受體細胞中能________；質粒DNA分子上有____________________________，便于外源DNA插入；質粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞，方法是__________________________________________________。
(4)表達載體含有啟動子，啟動子是指__________________________________________________。
答案　(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ
(2)磷酸二酯鍵
(3)自我復制　一至多個限制酶切割位點　用含有該抗生素的培養基培養宿主細胞，能夠存活的即為含有質粒載體的宿主細胞
(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶識別及結合的部位，能驅動轉錄過程
解析　(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA連接酶來源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來，而T4 DNA連接酶來源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶連接，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)用T4 DNA連接酶連接。
[例5]　(2021·廣東選擇考適應性測試)CRISPR/Cas9基因編輯技術可以按照人們的意愿精準剪切、改變任意靶基因的遺傳信息，對該研究有突出貢獻的科學家被授予2020年諾貝爾化學獎。我國科學家領銜的團隊利用CRISPR/Cas9等技術，將人的亨廷頓舞蹈病致病基因(HTT基因)第1外顯子(其中含150個CAG三核苷酸重復序列)“敲入”豬基因組內，獲得了人—豬“鑲嵌”HTT基因，利用胚胎工程技術成功地構建了亨廷頓舞蹈病的動物模型。回答下列問題：
(1)PCR技術是獲得人HTT基因常用的方法，制備PCR反應體系時，向緩沖溶液中分別加入人HTT基因模板、4種脫氧核糖核苷酸及________________________________等，最后補足H2O。
(2)CRISPR/Cas9基因編輯技術中，SgRNA是根據靶基因設計的引導RNA，準確引導Cas9切割與SgRNA配對的靶基因DNA序列，由此可見，Cas9在功能上屬于________酶。與CRISPR/Cas9相比，限制酶的特性決定了其具有__________________________的局限性。
(3)在實驗過程中，為確認實驗豬細胞基因組內是否含有人—豬“鑲嵌”HTT基因，常用的檢測手段包括PCR技術及____________________。
(4)含有“敲入”序列的豬胚胎成纖維細胞在體外培養時通過細胞分裂，數量不斷增加，當細胞貼壁生長到表面相互接觸時，細胞停止分裂增殖，這種現象稱為________。貼滿瓶壁的細胞常用________進行消化處理，以便進行傳代培養。
(5)將含有“敲入”序列的豬胚胎成纖維細胞的細胞核導入去核的卵母細胞的過程，稱為________________。此后進行體外胚胎培養并移植到代孕母豬體內，最終獲得亨廷頓舞蹈病動物模型。
答案　(1)引物、耐高溫的DNA聚合酶
(2)水解　只能識別并切割特定核苷酸序列
(3)DNA分子雜交技術
(4)接觸抑制　胰蛋白酶(或膠原蛋白酶)
(5)動物體細胞核移植
解析　(2)第一個空為水解酶，原因為后面一個空：該酶與限制酶相比，限制酶具有某種局限性，則反證該酶不是限制酶，沒該局限性，因此該空不應該填“限制酶”，應該是水解酶。
[例6]　(2021·湖南適應性考試)p53基因是一種抑癌基因，在惡性腫瘤患者中突變率達50%以上。與人相比，大象體內含有多對p53基因，推測是其很少患腫瘤的主要原因。設計實驗探究人p53基因在乳腺腫瘤細胞中的作用。回答下列問題：
(1)利用PCR技術擴增p53基因。首先根據p53基因的核苷酸序列，設計并合成________，其能與變性p53基因單鏈結合，在________________催化作用下延伸，如此循環多次。
(2)p53基因表達載體的構建。如圖所示，表達載體上除了標注的DNA片段外，在p53基因上游還必須擁有的DNA片段(箭頭所示)是________，其作用機理是____________________________。外源p53基因插入載體中至少需要兩種工具酶，包括準確切割DNA的限制性內切核酸酶和將雙鏈DNA片段“縫合”起來的________。
(3)乳腺腫瘤細胞培養。完成倫理學審查和病人知情同意書簽署后，將患者乳腺腫瘤組織塊剪碎，制成細胞懸液在適宜的條件下培養。培養環境中所需的主要氣體包括細胞代謝必需的________和維持培養液pH值的________。保持培養環境處于無菌無毒條件的操作包括________________________________(答出兩點即可)。
(4)檢測p53基因表達對乳腺腫瘤細胞增殖的影響。分別將空載體和p53表達載體轉入腫瘤細胞培養，采用特殊方法檢測細胞增殖情況，并從培養的腫瘤細胞中提取蛋白質，用相應的________進行雜交，檢測p53基因翻譯成蛋白質的情況，探索雜交帶強度與細胞增殖率相關性。
答案　(1)引物　耐高溫的DNA聚合酶
(2)啟動子　RNA聚合酶識別和結合位點，啟動轉錄　DNA連接酶
(3)O2　CO2　對培養液和培養器具進行滅菌以及在無菌環境下進行操作，定期更換培養液等
(4)抗體
[例7]　(2022·全國乙卷，38)新冠疫情出現后，病毒核酸檢測和疫苗接種在疫情防控中發揮了重要作用。回答下列問題。
(1)新冠病毒是一種RNA病毒，檢測新冠病毒RNA(核酸檢測)可以采取RT PCR法。這種方法的基本原理是先以病毒RNA為模板合成cDNA，這一過程需要的酶是____________，再通過PCR技術擴增相應的DNA片段。根據檢測結果判斷被檢測者是否感染新冠病毒。
(2)為了確保新冠病毒核酸檢測的準確性，在設計PCR引物時必須依據新冠病毒RNA中的______________________來進行。PCR過程每次循環分為3步，其中溫度最低的一步是________。
(3)某人同時進行了新冠病毒核酸檢測和抗體檢測(檢測體內是否有新冠病毒抗體)，若核酸檢測結果為陰性而抗體檢測結果為陽性，說明________________________(答出1種情況即可)；若核酸檢測和抗體檢測結果均為陽性，說明__________________________。
(4)常見的病毒疫苗有滅活疫苗、蛋白疫苗和重組疫苗等。已知某種病毒的特異性蛋白S(具有抗原性)的編碼序列(目的基因)，為了制備蛋白疫苗，可以通過基因工程技術獲得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是__________________________________________________________________________________________。
答案　(1)逆轉錄酶(反轉錄酶)
(2)特異性核苷酸序列　復性
(3)曾感染新冠病毒，已康復　已感染新冠病毒，是患者
(4)獲取S蛋白基因→構建S蛋白基因與運載體的表達載體→導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定
[練]　培育轉基因抗蟲棉主要有四個步驟，請在每一個步驟各寫出一個有聯系的不重復的名詞。
答案　1.Bt蛋白基因、PCR、瓊脂糖凝膠電泳等；2.啟動子、基因表達載體、標記基因、重組DNA等；3.受體細胞、轉化、花粉管通道法等；4.檢測、鑒定、抗原—抗體雜交。
重要概念2　蛋白質工程是基因工程的延伸
[例8]　科學家為提高玉米中賴氨酸的含量，計劃將天冬氨酸激酶第352位的蘇氨酸變成異亮氨酸，將二氫吡啶二羧酸合成酶中104位的天冬氨酸變成異亮氨酸，就可以使玉米葉片和種子中的游離賴氨酸含量分別提高5倍和2倍。此操作過程是(　　)
A．直接改造上述兩種蛋白質的空間結構
B．直接改造上述兩種酶相應的mRNA
C．直接改造上述兩種酶相應的基因
D．重新合成新的基因
答案　C
重要概念3　生物技術在造福人類社會的同時也可能會帶來安全與倫理問題
[例9]　CCR5是HIV入侵人體輔助性T細胞的主要輔助受體之一。有科學家為了使嬰兒一出生就具有抵抗艾滋病的能力，通過基因編輯破壞了受精卵中的CCR5基因，該做法引起了民眾普遍的擔憂。下列各項不屬于擔憂依據的是(　　)
A．CCR5基因可能還參與了其他生理過程的調控
B．基因編輯技術有可能因編輯對象錯誤(脫靶)造成不可預知的后果
C．被編輯個體受其他疾病感染的風險可能會提高
D．該技術雖然符合人類倫理道德，但可能存在潛在的安全風險
答案　D
解析　該技術不符合人類倫理道德，D符合題意。
[例10]　“試管嬰兒”技術是通過將不孕夫婦的精子和卵細胞取出，在試管中完成受精，并在試管中培養使其發育到如圖所示的時期，再將胚胎植入女性子宮內發育成胎兒，該技術使一部分不能生育的夫婦重新獲得了生育的機會。下列敘述正確的是(　　)
A．“試管嬰兒”技術在生物學上所依據的原理是無性生殖
B．如圖所示時期是胚胎發育的囊胚期，①代表內細胞團，②代表囊胚腔，③代表滋養層
C．“試管嬰兒”的形成用到的技術有人工授精、體內培養、核移植
D．“試管嬰兒”技術誕生后，繼而出現了“設計試管嬰兒”技術，二者對人類的作用是相同的
答案　B
[例11]　(不定項)下列關于生物武器及其使用的敘述，正確的是(　　)
A．生物武器傳播途徑包括空氣傳播、食物傳播、生活必需品傳播等
B．利用轉基因技術制造的新型致病菌可能具有超強的傳染性和致病性
C．天花病毒能作為危害極強的生物武器是因為現在的年輕人對其無特異性免疫能力
D．《禁止生物武器公約》中明確提出在任何情況下不發展、不生產、不儲存生物武器
答案　ABD
解析　天花病毒能作為危害極強的生物武器是因為現在的年輕人從未接觸過該病毒，可以讓大批感染者突然發病，引起嚴重后果，而不是對其無特異性免疫能力。
[練]　“基因編輯嬰兒”事件被人們廣泛關注，請談談你的看法。
答案　不支持；違背倫理、違反法律。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
例　(2020·山東等級考)水稻胚乳中含直鏈淀粉和支鏈淀粉，直鏈淀粉所占比例越小糯性越強。科研人員將能表達出基因編輯系統的DNA序列轉入水稻，實現了對直鏈淀粉合成酶基因(Wx基因)啟動子序列的定點編輯，從而獲得了3個突變品系。
(1)將能表達出基因編輯系統的DNA序列插入Ti質粒構建重組載體時，所需的酶是______________________，重組載體進入水稻細胞并在細胞內維持穩定和表達的過程稱為________。
(2)根據啟動子的作用推測，Wx基因啟動子序列的改變影響了____________________________________，從而改變了Wx基因的轉錄水平。與野生型水稻相比，3個突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“發生”或“不發生”)改變，原因是____________________________。
(3)為檢測啟動子變化對Wx基因表達的影響，科研人員需要檢測Wx基因轉錄產生的mRNA(WxmRNA)的量。檢測時分別提取各品系胚乳中的總RNA，經__________過程獲得總cDNA。通過PCR技術可在總cDNA中專一性的擴增出Wx基因的cDNA，原因是______________________________。
(4)各品系WxmRNA量的檢測結果如圖所示，據圖推測糯性最強的品系為________，原因是___________________________________________。
第(4)題為分析原因類試題，為高考常考類型，這類題的解題方法是：首先理清題干、題圖中已知條件與結果之間的邏輯關系，同時將所學的生物學的基本概念和原理與之聯系，找到解決這類問題的知識載體。
答案　(1)限制性內切核酸酶和DNA連接酶　轉化
(2)RNA聚合酶與啟動子的識別和結合　不發生　編碼直鏈淀粉合成酶的堿基序列中不含啟動子
(3)逆轉錄(或反轉錄)　引物是根據Wx基因的一段已知序列設計合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結合)
(4)品系3　品系3的WxmRNA最少，控制合成的直鏈淀粉合成酶最少，直鏈淀粉合成量最少，糯性最強
解析　(1)將目的基因與Ti質粒構建基因表達載體時，需要限制酶的切割，將目的基因插入載體時需要DNA連接酶的連接。
(2)啟動子是RNA聚合酶識別并結合的位點，如果啟動子序列改變將會影響RNA聚合酶與之識別和結合，進而影響基因的轉錄水平。在真核生物中，編碼蛋白質的序列是基因中的編碼區，編碼區中不包括啟動子序列，因此3個突變品系中Wx基因控制合成的直鏈淀粉合成酶的氨基酸序列不發生改變。
[練1－1]　(2022·河南鄭州模擬)為了研究低溫誘導對某基因的啟動子P活性的影響，科研人員進行了啟動子P的PCR提取、特定表達載體的構建和轉基因煙草的功能鑒定。該基因及其啟動子P的結構及相應限制酶的切割位點如下圖所示，圖中灰色區域堿基序列是已知的，啟動子P(圖中黑色區域)及上游堿基序列未知，片段Ⅰ和片段Ⅱ中的字母A～F均表示引物。請回答下列問題。
(1)不能直接根據片段Ⅰ擴增啟動子P的原因是__________________________________________________。
(2)為了能擴增正常啟動子P，科研人員先用______________酶處理上圖中的片段Ⅰ，使片段Ⅰ成為環狀DNA；再將環狀DNA用________(填“酶1”或“酶2”)處理得到了片段Ⅱ，如下圖所示。根據片段Ⅱ能不能擴增出啟動子P？若能，請寫出可選用的引物組合(用C、D、E、F表示)，若不能請說明理由。____________________________________。
(3)已知卡那霉素可抑制煙草細胞的生長，基因M可在煙草的根部正常表達，其表達產物可將X Gluc水解生成藍色物質。將啟動子P和基因M結合并與含有卡那霉素抗性基因的Ti－質粒重組構建基因表達載體。將表達載體轉入農桿菌，通過農桿菌的轉化作用將啟動子P和基因M導入煙草細胞，用含有__________________的培養基篩選出所需的煙草細胞，然后經過________獲得轉基因煙草植株。
(4)將上述轉基因煙草植株分為A、B兩組，A組在常溫(25 ℃，對照組)下培養，B組在低溫(4 ℃，實驗組)下培養，一段時間后取A、B的幼根，浸入適量________溶液中，觀察煙草細胞中基因M的表達情況(表達強度越大，細胞表現的藍色越深)。若A、B組的結果分別為__________________，則說明低溫抑制啟動子P的功能。
答案　(1)啟動子P及上游堿基序列未知，無法合成PCR所需要的引物
(2)酶1和DNA連接　酶2　能，可選用的引物組合是D和E
(3)卡那霉素和X Gluc　組織培養
(4)X Gluc　A藍色較深、B藍色較淺
解析　(2)圖中的片段Ⅰ在啟動子P的左右兩端各有一個酶1的切割位點，酶1可切割片段Ⅰ的左右兩端產生相同的末端，再用DNA連接酶連接可形成環狀DNA；片段Ⅱ的首尾兩端都有灰色區域，結合題圖分析可知，片段Ⅱ是用酶2切割處理環狀DNA產生的。子鏈合成方向是從子鏈的5′－3′，所以可以用引物D和E擴增出啟動子P。
(3)煙草細胞在卡那霉素中能存活說明轉入了質粒，能將X Gluc水解成藍色說明獲得了基因M的表達產物，因此用含有卡那霉素和X Gluc的培養基可以篩選出成功轉入目的基因的煙草細胞。篩選出的煙草細胞經過植物組織培養可獲得轉基因植株。
(4)由題意可知，基因M可在煙草的根部正常表達，其表達產物可將X Gluc水解生成藍色物質，故可用適量X Gluc溶液檢測A、B的幼根細胞中基因M的表達情況，表達強度越大，細胞表現的藍色越深。若A組藍色深而B組藍色較淺，則說明B組低溫使啟動子P受抑制，表達的產物少。
[練1－2]　(2022·北京東城高三模擬)中國甜柿的自然脫澀與乙醛代謝關鍵酶基因(PDC)密切相關，推測澀味程度可能與PDC基因的表達情況有關。
(1)啟動子位于基因首端，是RNA聚合酶識別和結合的位點，同時啟動子區域還存在著許多調控蛋白的結合位點，RNA聚合酶和調控蛋白共同影響了基因的________。
(2)為篩選PDC基因的調控蛋白，科研人員進行了下列實驗。
①PDC基因的啟動子序列未知，為獲得大量該基因啟動子所在片段，可利用限制酶將基因組DNA進行酶切，然后在____________的作用下將已知序列信息的接頭片段連接在PDC基因的上游，根據________和PDC基因編碼序列設計引物進行PCR，利用質粒A(圖1)構建含有PDC基因啟動子片段的重組質粒并導入代謝缺陷型酵母菌，用不含________的培養基可篩選出成功轉化的酵母菌Y1H。
注：金擔子素是一種抗真菌藥物。
②質粒G(圖2)上的AD基因表達出的AD蛋白與啟動子足夠靠近時，能夠激活后續基因轉錄，因此需獲得待測蛋白與AD蛋白的融合蛋白用于后續篩選。科研人員從中國甜柿中提取RNA，將逆轉錄形成的各種cDNA與質粒G連接后導入酵母菌，此時應選擇質粒G中的位點________(填序號1～5)作為cDNA的插入位點，最終獲得攜帶不同cDNA片段的酵母菌群Y187。
③重組酵母Y187與Y1H能夠進行接合生殖，形成的接合子含有兩種酵母菌質粒上的所有基因。若接合子能在含有金擔子素的培養基中生存，則推測待測蛋白是PDC基因的調控蛋白，請結合圖3闡述作出該推測的理由____________________________________________________________________________________。
答案　(1)轉錄水平
(2)①DNA連接酶　接頭片段　尿嘧啶　②4
③接合子中待測蛋白與AD蛋白形成了融合蛋白，如果待測蛋白是PDC基因的調控蛋白，它就能與PDC基因啟動子特定區域結合，AD蛋白也能靠近PDC基因啟動子并激活金擔子素抗性基因的表達，使酵母菌表現出金擔子素抗性
解析　(1)啟動子與調控蛋白對基因的轉錄與否起調控作用，啟動子是RNA聚合酶識別和結合的位點，直接決定轉錄起始，后者為間接作用，對DNA的轉錄起到調控作用。
(2)①已知接頭片段連接在PDC基因的上游，且已知序列信息，則可以按照PDC基因啟動子上游的接頭片段與PDC基因編碼序列設計引物進行PCR擴增；由質粒A的示意圖可知帶有選擇功能的基因片段有尿嘧啶合成基因、金擔子素抗性基因兩種，但是金擔子素抗性基因無啟動子無法轉錄，所以選擇尿嘧啶合成基因作為標記基因，則在選擇培養基配制時不加尿嘧啶。②cDNA片段需要插入啟動子之后，且不能破壞其他蛋白質基因的表達，因此選擇4作為cDNA的插入位點。③依據題干，重組酵母Y187與Y1H接合子應同時含有質粒A、質粒G，則接合子有質粒A為含有PDC基因、金擔子素抗性基因的質粒；質粒G為可正常表達AD蛋白、待測蛋白的質粒，若質粒A、G正常執行功能，則AD蛋白攜帶的待測蛋白靠近PDC基因啟動子，激活PDC基因的轉錄，并激活金擔子素抗性基因的表達，使酵母菌表現出金擔子素抗性。
[練1－3]　(2021·天津等級考)乳酸菌是乳酸的傳統生產菌，但耐酸能力較差，影響產量。釀酒酵母耐酸能力較強，但不產生乳酸。研究者將乳酸菌的乳酸脫氫酶基因(LDH)導入釀酒酵母，獲得能產生乳酸的工程菌株。下圖1為乳酸和乙醇發酵途徑示意圖，圖2為構建表達載體時所需的關鍵條件。
(1)乳酸脫氫酶在轉基因釀酒酵母中參與厭氧發酵的場所應為______________________。
(2)獲得轉基因釀酒酵母菌株的過程如下：
①設計引物擴增乳酸脫氫酶編碼序列。
為使擴增出的序列中編碼起始密碼子的序列由原核生物偏好的GTG轉變為真核生物偏好的ATG，且能通過雙酶切以正確方向插入質粒，需設計引物1和2。其中引物1的5′端序列應考慮__________________和__________________。
②將上述PCR產物和質粒重組后，導入大腸桿菌，篩選、鑒定，擴增重組質粒。重組質粒上有______________________，所以能在大腸桿菌中擴增。啟動子存在物種特異性，易被本物種的轉錄系統識別并啟動轉錄，因此重組質粒上的乳酸脫氫酶編碼序列________(填“能”或“不能”)在大腸桿菌中高效表達。
③提取重組質粒并轉入不能合成尿嘧啶的釀酒酵母菌株，在________的固體培養基上篩選出轉基因釀酒酵母，并進行鑒定。
(3)以葡萄糖為碳源，利用該轉基因釀酒酵母進行厭氧發酵，結果既產生乳酸，也產生乙醇。若想進一步提高其乳酸產量，下列措施中不合理的是________(單選)。
A．進一步優化發酵條件
B．使用乳酸菌LDH基因自身的啟動子
C．敲除釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶基因
D．對轉基因釀酒酵母進行誘變育種
答案　(1)細胞質基質
(2)①包含BamHⅠ的識別序列　將GTG改為ATG　②原核生物復制原點　不能　③缺失尿嘧啶
(3)B
解析　(1)酵母細胞厭氧發酵即無氧呼吸的場所為細胞質基質。
(2)①設計引物1的5′端序列，應考慮將編碼起始密碼子的序列由原核生物偏好的GTG轉變為真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母細胞中更好的表達；同時能通過雙酶切以正確方向插入質粒，需要包含BamHⅠ的識別序列。②將重組質粒導入大腸桿菌，重組質粒上有原核生物復制原點，所以能在大腸桿菌中擴增。由于啟動子存在物種特異性，重組質粒上帶有真核釀酒酵母基因的啟動子，故重組質粒上的乳酸脫氫酶編碼序列在大腸桿菌中不能高效表達。③在缺乏尿嘧啶的選擇培養基上，不能合成尿嘧啶的釀酒酵母菌株不能生存，導入重組質粒的釀酒酵母菌株因為獲得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，從而起到篩選作用。
(3)進一步優化發酵條件，使其更有利于乳酸的產生，可以提高其乳酸產量，A正確；由于啟動子存在物種特異性，使用乳酸菌LDH基因自身的啟動子，在酵母細胞中不表達，B錯誤；敲除釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶基因，使酵母菌不能釀酒，從而提高乳酸產量，C正確；對轉基因釀酒酵母進行誘變育種，可能會出現乳酸的高產菌株，D正確。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
雙練一　基礎測試
一、單項選擇題(每題給出的四個選項中，只有一個選項是符合題目要求的)
1．在三個培養皿中各加入等量但不同種的大腸桿菌培養基，在培養皿中培養36小時后統計細菌菌落數(如表)。下列表述不正確的是(　　)
培養皿 培養基成分 培養皿中的菌落數
Ⅰ 瓊脂、糖類 35
Ⅱ 瓊脂、糖類和維生素 250
Ⅲ 瓊脂和維生素 0
A.培養皿Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ表明瓊脂是培養基中必須營養成分
B．培養皿Ⅰ和Ⅱ說明維生素是大腸桿菌需要的生長因子
C．培養皿Ⅱ和Ⅲ說明糖類是大腸桿菌需要的碳源
D．本實驗使用的都是固體培養基
答案　A
解析　瓊脂只是作為凝固劑，不能為微生物生長提供營養成分，A錯誤；Ⅱ和Ⅲ對照，說明大腸桿菌的生長需要糖類，糖類可以作為碳源，C正確；由于三個實驗中都加入了凝固劑瓊脂，都是固體培養基，D正確。
2．(2022·北京豐臺一模)釀酒酵母常用于制作葡萄酒、面包等，某同學利用購買的釀酒酵母制作白葡萄酒。下列操作不正確的是(　　)
A．購買的干粉菌種需活化后再接種
B．將白葡萄清洗后搗碎有助于發酵
C．定期用斐林試劑檢測發酵產物
D．接種量、溫度等影響放氣頻率
答案　C
3．下圖表示玉米(2n＝20)的花藥離體培養及單倍體育種的大致過程。下列敘述錯誤的是(　　)
A．過程①是脫分化，形成的愈傷組織細胞處于未分化狀態
B．過程②進行的是有絲分裂，植株A是從試管苗中篩選出的可育二倍體
C．過程①和②均要使用生長素和細胞分裂素，但兩種激素的比例不同
D．可用體積分數為70%的酒精對花藥進行消毒處理
答案　B
解析　過程①是脫分化過程，脫分化后的細胞的結構和功能都發生了明顯改變，變為未分化狀態，A正確；過程②是愈傷組織進行再分化的過程，植株A是由花藥離體培養而得的單倍體，B錯誤。
4．(2021·福建適應性測試改編)下圖是利用體細胞核移植技術獲得克隆奶牛的流程圖。
下列敘述錯誤的是(　　)
A．過程①通過顯微操作去除細胞核
B．獲得的克隆奶牛是高產奶牛，與供體奶牛完全相同
C．過程③可用電融合法使供體細胞和去核卵母細胞融合
D．過程⑤操作前需要對代孕母牛進行發情處理
答案　B
解析　去除牛卵母細胞中的細胞核可以用顯微操作技術，A正確；克隆奶牛與供體奶牛細胞核內遺傳物質相同，細胞質遺傳物質不同，由于受到細胞質基因與環境的影響，克隆奶牛與供體奶牛不完全相同，B錯誤；過程⑤是將早期胚胎移植入代孕母牛的子宮內，操作前需要對代孕母牛進行發情處理，D正確。
5．吳茱萸是一種中藥，其主要成分為吳茱萸堿(EVO)，為研究EVO對人胃癌細胞增殖的影響及作用機制，科研人員做了相關實驗。研究發現，EVO不僅能通過誘導胃癌細胞中p53蛋白的表達，使其細胞周期阻滯在G2/M期，還能影響細胞凋亡蛋白Caspase 3的表達，最終起到治療胃癌的作用。下列說法錯誤的是(　　)
A．培養胃癌細胞，需將含動物血清的培養基置于恒溫培養箱中
B．加入胰蛋白酶制備的胃癌單細胞懸液，會出現接觸抑制現象
C．p53可能是一種細胞周期抑制蛋白，EVO能夠抑制胃癌細胞的增殖
D．患者服用EVO后，胃癌細胞中Caspase 3的含量會增加
答案　B
解析　胃癌細胞糖蛋白減少，黏著性降低，不會出現接觸抑制現象，B錯誤。
6．(2021·遼寧適應性測試)PCR是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術，與人體細胞內DNA分子復制相比，下列有關敘述錯誤的是(　　)
A．都遵循堿基互補配對原則
B．DNA聚合酶作用的最適溫度不同
C．都是邊解旋邊復制的過程
D．復制方式都是半保留復制
答案　C
解析　PCR技術是在較高溫度條件下進行的，因此PCR與細胞內DNA復制相比所需要酶的最適溫度較高，B正確；PCR技術是在較高溫度條件下打開雙鏈后進行擴增的，不是邊解旋邊復制的，C錯誤。
7．圖甲、乙中標注了相關限制酶的酶切位點。下列關于培育轉基因大腸桿菌的敘述錯誤的是(　　)
A．若通過PCR技術獲取該目的基因，應該選用引物甲和引物丙
B．圖中質粒和目的基因構建表達載體，應選用BclⅠ和HindⅢ剪切
C．若將基因表達載體導入受體細胞中，需選用處于能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態的大腸桿菌
D．在受體細胞中，氨芐青霉素抗性基因和目的基因可同時表達
答案　D
解析　PCR技術能獲得兩個引物之間的DNA序列，獲取該目的基因，目的基因在引物甲和引物丙之間，應該選用引物甲和引物丙，A正確；圖中質粒和目的基因構建表達載體，應選用BclⅠ和HindⅢ剪切，既可以將目的基因切下來(獲取目的基因)，又可以保證質粒中四環素抗性基因不被破壞，B正確；在受體細胞中，氨芐青霉素抗性基因由于目的基因的插入被破壞，不能表達，D錯誤。
8．從某海洋動物中獲得一基因，其表達產物為一種抗菌性和溶血性均較強的多肽P1。目前在P1的基礎上研發抗菌性強但溶血性弱的多肽藥物，首先要做的是(　　)
A．合成編碼目的肽的DNA片段
B．構建含目的肽DNA片段的表達載體
C．依據P1氨基酸序列設計多條模擬肽
D．篩選出具有優良活性的模擬肽作為目的肽
答案　C
解析　蛋白質工程的第一步是根據蛋白質的功能設計蛋白質的結構，推測多肽的氨基酸序列，C正確。
二、不定項選擇題(每題給出的四個選項中，有的只有一個選項符合題目要求，有的有多個選項符合題目要求)
9．泡菜制作方便、口味獨特，深受人們喜愛，下列敘述正確的是(　　)
A．泡菜腌制過程中，進行發酵的主要微生物屬于原核生物
B．泡菜腌制過程中，需加入一定的抗生素來抑制雜菌的繁殖
C．泡菜腌制過程中，用水封的方式保證壇內發酵所需的無氧環境
D．泡菜腌制過程中，亞硝酸鹽的含量會先增加后減少
答案　ACD
解析　抗生素會殺死細菌，故在泡菜腌制過程中，不能加入抗生素，否則會影響乳酸菌的繁殖，導致發酵失敗，B錯誤。
10．某實驗室做了下圖所示的實驗研究。下列相關敘述中不正確的是(　　)
A．與纖維母細胞相比，過程①形成的誘導干細胞的全能性較高
B．單克隆抗體不需細胞膜上載體蛋白的協助就能釋放到細胞外
C．每個Y細胞只產生一種抗體，故過程④不需進行篩選
D．過程②是誘導干細胞的結構和遺傳物質發生穩定性差異的過程
答案　CD
解析　與纖維母細胞相比，干細胞的全能性較高，A正確；抗體是大分子化合物，分泌出細胞的方式是胞吐，需要能量，但不需要載體蛋白，B正確；雖然每個Y細胞只產生一種抗體，但從乙小鼠體內分離出的Y細胞有多種，且經③過程獲得的Z細胞有融合的具有同種核的細胞和多種雜交細胞，過程④需進行篩選，C錯誤；過程②是誘導干細胞分化為多種細胞，這些細胞的結構發生改變，但遺傳物質都未發生改變，D錯誤。
三、非選擇題
11．(2021·重慶選擇性考試適應性測試改編)某研究人員設計了下列技術路線，以期獲得甘藍和蘿卜體細胞雜交植株。
請回答下列問題：
(1)制備原生質體時，常用兩種酶處理，分別是________________。誘導原生質體融合常用的化學誘導劑是________________。原生質體融合成功的標志是________________________。圖中X是________。
(2)為誘導融合體產生不定芽，通常應在培養基中加入兩類植物激素，其中起主要作用的是______________。
(3)若想獲得抗鹽植株，可選用融合原生質體作為人工誘變的材料，原因是________________________________________________________________________________________，且需在含較高濃度的NaCl培養基中篩選。
答案　(1)纖維素酶和果膠酶　PEG(聚乙二醇)　雜種細胞再生成細胞壁　愈傷組織
(2)細胞分裂素
(3)具有分裂分化能力，突變頻率高，融合原生質體包含了兩個物種的全部遺傳信息，且具有全能性
解析　(2)植物組織培養中常加入細胞分裂素和生長素，當生長素和細胞分裂素的比值低時，有利于芽的形成，所以起主要作用的是細胞分裂素。
12．(2022·湖南百所名校聯考)黃粉蟲可以吞食、降解塑料，利用黃粉蟲腸道微生物對白色污染進行生物降解，是一種綠色環保的處理工藝。下圖是從黃粉蟲腸道中分離、純化微生物的過程。請回答下列問題：
(1)解剖取腸道內容物后，進行富集培養的目的是____________________________________________________________________________。
(2)進行選擇培養時，培養基中需加入____________作為唯一的碳源。要判斷選擇培養基是否起到了選擇作用，需要設置____________________________作為對照。
(3)將培養后的菌液稀釋涂布到固體培養基上，涂布平板時的工具是________，整個過程都應在____________附近進行，待平板上長出菌落后，選擇所需菌種。
(4)在統計菌落數目時，一般選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，這樣可以防止因____________而遺漏菌落的數目。
(5)與傳統填埋、焚燒相比，黃粉蟲腸道微生物對白色污染的降解具有________________的優點。
答案　(1)增加塑料降解微生物的濃度，以確保能從腸道中分離到所需要的微生物
(2)PVC塑料膜　接種了的牛肉膏蛋白胨培養基
(3)涂布器　酒精燈火焰
(4)培養時間不足(答案合理即可)
(5)不會造成二次污染(答案合理即可)
解析　(1)從腸道內容物中分離目的微生物時，進行富集培養的目的是為了增加目的微生物的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。
(2)為篩選能降解塑料的微生物，進行選擇培養時，培養基中需加入PVC塑料膜作為唯一的碳源。牛肉膏蛋白胨培養基中由牛肉膏、蛋白胨提供的碳源大多數微生物都可以利用，以PVC塑料膜為唯一碳源的培養基只有能分解PVC的微生物可以存活，因此，以牛肉膏蛋白胨培養基作為對照，能判斷選擇培養基是否起到了選擇作用。
13．科研人員探究S蛋白在水稻減數分裂過程中的作用。
(1)減數分裂Ⅰ的主要特征是：____________________________________(寫出一條)。
(2)為確定S蛋白的作用位點，科研人員將紅色熒光標記的S蛋白抗體與綠色熒光標記的著絲粒特異性蛋白抗體加入到野生型水稻花粉母細胞樣品中，若熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光位點與綠色熒光位點________，則表明S蛋白作用于染色體的著絲粒處。
(3)為探究S蛋白的作用，研究人員構建使S蛋白基因沉默的轉基因水稻。
①提取野生型水稻的總RNA，獲取大量S基因(目的基因)的方法為：通過________過程獲得cDNA，設計與___________________________________的引物，進而通過PCR擴增S基因。
②將S基因反向接入質粒，構建表達載體，利用____________法將其導入受體細胞，獲得轉基因水稻植株。
③利用____________技術檢測水稻體內S蛋白表達情況，判斷圖1中植株B為轉基因水稻，植株B的S蛋白表達量低的原因是S基因反向接入后，________________________________________________________________，導致S蛋白條帶變暗。
(4)對轉基因水稻和野生型水稻減數分裂Ⅱ后期的染色體行為進行觀察，科研人員發現轉基因水稻在減數分裂Ⅱ后期姐妹染色單體提前分離，染色體散亂排列(如圖2)，據此推測S蛋白的作用是____________________________________________，從而保證細胞兩極的兩套染色體形態和數目完全相同。
答案　(1)同源染色體配對聯會(或四分體中的非姐妹染色單體發生互換或同源染色體分離，分別移向細胞的兩極)
(2)重疊
(3)①逆轉錄　S基因兩端序列特異性結合　②農桿菌轉化　③抗原—抗體雜交　轉錄產生的mRNA能與正常S基因的mRNA互補配對，抑制S基因的翻譯過程
(4)抑制著絲粒提前分離(或保證姐妹染色單體同步分開)
解析　(2)根據題意，S蛋白抗體會與S蛋白結合顯紅色熒光，著絲粒特異性蛋白抗體會跟著絲粒蛋白結合顯綠色熒光，若觀察到紅色熒光位點與綠色熒光位點重疊，說明S蛋白作用于染色體的著絲粒處。
(3)①提取野生型水稻的總RNA，通過逆轉錄過程獲得cDNA，設計與S基因兩端序列特異性結合的引物，進而通過PCR擴增S基因，即可得到大量S基因。
雙練二　能力提升
一、單項選擇題(每題給出的四個選項中，只有一個選項是符合題目要求的)
1．(2021·山東等級考)解脂菌能利用分泌的脂肪酶將脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸會使醇溶青瓊脂平板變為深藍色。將不能直接吸收脂肪的甲、乙兩種菌分別等量接種在醇溶青瓊脂平板上培養。甲菌菌落周圍呈現深藍色，乙菌菌落周圍不變色。下列說法錯誤的是(　　)
A．甲菌屬于解脂菌
B．實驗中所用培養基以脂肪為唯一碳源
C．可將兩種菌分別接種在同一平板的不同區域進行對比
D．該平板可用來比較解脂菌分泌脂肪酶的能力
答案　B
解析　根據題干信息“甲菌菌落周圍呈現深藍色”，說明甲可以分泌脂肪酶將脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸會使醇溶青瓊脂平板變為深藍色，因此甲菌屬于解脂菌，A正確；乙菌落周圍沒有出現深藍色，說明乙菌落不能產生脂肪酶，不能利用脂肪為其供能，但乙菌落也可以在培養基上生存，說明該培養基不是以脂肪為唯一碳源，B錯誤；可將兩種菌分別接種在同一平板的不同區域進行對比，更加直觀，C正確；該平板可用來比較解脂菌分泌脂肪酶的能力，觀察指標為菌落周圍深藍色圈的大小，D正確。
2．束頂病毒是香蕉的嚴重病害之一，常用感病植株的莖尖作外植體以獲得脫毒苗。科研人員進行相關實驗的結果如下表所示，敘述錯誤的是(　　)
莖尖預處理 莖尖數量 成活莖尖數 成活率(%) 脫毒莖尖數 脫毒率(%)
未低溫保存 32 30 93.75 8 26.67
超低溫保存 60 33 55.00 20 60.61
A.獲得脫毒苗利用植物細胞具有全能性的原理
B．培養基中常添加生長素、細胞分裂素等激素
C．結果顯示超低溫保存莖尖可以提高脫毒率
D．用光學顯微鏡觀察病毒顆粒檢測莖尖脫毒率
答案　D
解析　光學顯微鏡無法觀察到病毒，D錯誤。
3．哺乳動物的單倍體胚胎干細胞(haESCs)是指只含有一套染色體(性染色體只含X染色體)、擁有類似于正常胚胎干細胞特性的細胞類群，可分為孤雌單倍體胚胎干細胞和孤雄單倍體胚胎干細胞兩種類型，在研究隱性基因突變、表觀遺傳修飾和配子發育中具有獨特的優勢。下列說法錯誤的是(　　)
A．在體外培養條件下，haESCs可以只增殖而不發生細胞分化
B．推測僅攜帶Y染色體的早期單倍體胚胎可能難以發育到囊胚階段
C．haESCs與成體干細胞類似，可誘導分化成各種功能的細胞、組織和器官
D.haESCs中通常不含等位基因，為獲取遺傳操作的動物模型提供了新思路
答案　C
解析　單倍體胚胎干細胞是擁有類似于正常胚胎干細胞特性的細胞類群，在體外培養條件下，單倍體胚胎干細胞同樣具有胚胎干細胞的特點，只增殖而不發生細胞分化，A正確；根據題干信息“單倍體胚胎干細胞性染色體只含X染色體”推測，僅攜帶Y染色體的早期單倍體胚胎可能難以發育到囊胚階段，B正確；單倍體胚胎干細胞類似于正常胚胎干細胞，具有發育的全能性，可誘導分化成各種功能的細胞、組織和器官，而成體干細胞來源于已經分化組織中的未分化細胞，如造血干細胞，只能分化為特定的組織和細胞，C錯誤。
4．菌種M和菌種N在發酵工程應用上具有不同的優越性，為了獲得具有它們共同優良性狀的融合菌，進行了下圖所示的實驗。已知菌種M為組氨酸依賴(組氨酸合成相關基因突變為B－)，菌種N為色氨酸依賴(色氨酸合成相關基因突變為A－)，下列分析錯誤的是(　　)
A．菌種M和N可通過人工誘變和選擇性培養篩選獲得
B．用PEG誘導融合之前需要去除菌種M和N的細胞壁
C．在培養基X中添加組氨酸和色氨酸以篩選出雜種融合菌
D．從培養基X中分離出的雜種融合菌P對兩種氨基酸均不依賴
答案　C
解析　人工誘變可獲得不同類型的突變體，再利用選擇培養基從中選取組氨酸依賴型和色氨酸依賴型的菌種，即為M、N菌種，A正確；由圖示流程可知，M、N菌經處理后得到與之前形態不同的原生質體，再用PEG處理，說明M、N菌均有細胞壁結構，B正確；M菌和N菌融合后的細胞，同時含有M、N兩種菌的基因，對兩種氨基酸均不依賴，故培養基X中應不添加組氨酸和色氨酸以篩選出雜種融合菌P，C錯誤，D正確。
二、不定項選擇題(每題給出的四個選項中，有的只有一個選項符合題目要求，有的有多個選項符合題目要求)
5．下圖1是蘋果酒和蘋果醋的現代生產裝置簡圖，在制備蘋果醋時，乙罐內先填充經滅菌處理的木材刨花，然后加入含醋酸菌的培養液。圖2是與生產過程關聯的某些物質濃度隨時間的變化情況。下列有關敘述正確的是(　　)
A．甲、乙罐中的微生物的代謝類型不同
B．甲罐頂上管道彎曲及加水的目的是防止空氣和雜菌進入，以及排氣減壓等
C．乙罐中刨木花既有利于發酵菌的附著，又能為其提供一定的碳源
D．圖2中的a、b曲線可分別代表乙酸和酒精的濃度變化規律
答案　AB
解析　甲、乙罐中的微生物分別為酵母菌和醋酸菌，它們的代謝類型分別是異養兼性厭氧型、異養需氧型，A正確；乙罐中刨木花有利于發酵菌的附著，但不能為其提供一定的碳源，醋酸菌以甲罐中的酒精作為碳源，C錯誤；果醋發酵能將酒精轉化為乙酸，因此發酵過程中酒精含量先增加后減少，而乙酸含量一直升高，且從酒精減少的時刻開始產生，因此a、b曲線分別代表酒精和乙酸的濃度變化規律，D錯誤。
6．亞洲棉的突變型光籽和野生型毛籽是一對相對性狀，研究發現，亞洲棉某突變體的光籽表型與8號染色體的～880 kb至～903 kb區間相關，研究人員根據野生型毛籽棉的該區間設計連續的重疊引物進行PCR，產物擴增結果如圖所示，下列說法正確的是(　　)
A．應提取該突變體和野生型亞洲棉的全部染色體DNA進行PCR
B．上圖中PCR產物的鑒定是通過瓊脂糖凝膠電泳來進行的
C．據圖分析可知，分子量較大的擴增產物與點樣處的距離較小
D．該突變體出現的根本原因是第6對引物對應區間發生了基因突變
答案　BCD
解析　由于8號染色體的～880 kb至～903 kb區間與突變體的光籽表型相關，故應該提取突變體和野生型的8號染色體上的DNA進行擴增，A錯誤；題圖中PCR產物的鑒定是通過瓊脂糖凝膠電泳來進行的，主要依據分子量不同，采用外加電場使其分開，B正確；由圖可知，分子量較大的擴增產物遷移速率慢，與點樣處的距離較小，C正確；根據野生型和突變體經引物6擴增的產物不同可知，8號染色體上的第6對引物對應的區間基因突變是突變體光籽性狀出現的根本原因，D正確。
三、非選擇題
7．R 7是家蠶體內的一種小分子非編碼RNA，可與某些mRNA尾端的一段非編碼序列(3′ UTR)結合，進而影響基因的表達。為研究R 7是否影響家蠶基因B(調控家蠶眼睛發育)的表達，科研人員將基因B中對應3′ UTR的DNA片段與熒光素酶基因(R 7不影響熒光素酶基因的表達)重組，如圖1所示。將該重組載體導入家蠶胚胎細胞并檢測其表達情況，結果如圖2所示。請回答下列問題：
(1)要想短時間內獲得大量目的基因，需要用到的技術是________________，該技術的原理是________________。若將一個含目的基因的DNA擴增n代，則共需消耗________對引物。
(2)圖1中對應3′ UTR的DNA片段應插入到位點________，原因是__________________________________________________________。基因工程的核心步驟是________________，其目的是__________________________________________________________________________________________。
(3)科研人員從圖2所示的實驗組和對照組細胞中提取蛋白質，經處理檢測后獲得相對熒光值(在適宜條件下，熒光素酶可催化熒光素發生氧化反應并發出熒光)。實驗組為將重組載體導入含R 7的家蠶胚胎細胞中，對照組1為將含有熒光素酶基因的表達載體(不含對應3′ UTR的DNA片段)導入含R 7的家蠶胚胎細胞中，則對照組2應為____________________________________。由結果推知R 7通過________________________________進而抑制基因B的表達。
答案　(1)PCR擴增技術　DNA雙鏈復制　2n－1
(2)2　目的基因應插入到啟動子與終止子之間，且不能破壞熒光素酶基因　基因表達載體的構建　使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用
(3)將重組載體導入不含(或去除)R 7的家蠶胚胎細胞中　與基因B所轉錄的mRNA的3′ UTR結合
解析　(1)短時間內獲得大量目的基因需用到的技術是PCR擴增技術，該技術原理是DNA雙鏈復制。若對一個含基因B的DNA擴增n代，共得到2n個DNA，凈增DNA為2n－1，因此共需消耗的引物為2n－1對。
(3)由圖2可知實驗組的相對熒光值較低，而對照組1和對照組2的相對熒光值較高。又因為對照組1的處理為將含有熒光素酶基因的表達載體(不含對應3′ UTR的DNA片段)導入含R 7的家蠶胚胎細胞中，說明沒有3′ UTR片段的細胞中熒光素酶基因正常表達，相對熒光值較高。實驗組為將重組載體導入含R 7的家蠶胚胎細胞中，相對熒光值較低，說明R 7抑制了熒光素酶基因的表達。由此可以推測對照組2的處理應為將重組載體導入不含(或去除)R 7的家蠶胚胎細胞中。由結果可推知R 7通過與基因B所轉錄的mRNA的3′ UTR結合進而抑制基因B的表達。
8．(2020·北京等級考)枯草芽孢桿菌可分泌纖維素酶。研究者篩選到一株降解纖維素能力較強的枯草芽孢桿菌菌株(B菌)，從中克隆得到了一種纖維素酶(C1酶)基因。將獲得的C1酶基因與高效表達載體(HT質粒)連接，再導入B菌，以期獲得降解纖維素能力更強的工程菌。
(1)纖維素屬于__________糖，因此經過一系列酶催化最終可降解成單糖，該單糖是__________。
(2)對克隆得到的C1酶基因測序，與數據庫中的C1酶基因編碼序列相比有兩個堿基對不同，但兩者編碼出的蛋白質的氨基酸序列相同，這是因為______________________。
(3)C1酶基因以B鏈為轉錄模板鏈，轉錄時mRNA自身的延伸方向為5′→3′。為了使C1酶基因按照正確的方向與已被酶切的HT質粒連接，克隆C1酶基因時在其兩端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位點。該基因內部沒有這兩種酶切位點。圖1中酶切位點1和2所對應的酶分別是____________________。
(4)將纖維素含量為20%的培養基分為三組，一組接種工程菌，對照組1不進行處理，對照組2進行相應處理。在相同條件下培養96小時，檢測培養基中纖維素的含量。結果(圖2)說明工程菌降解纖維素的能力最強。對照組2的處理應為_______________________________________________________________。
(5)預期該工程菌在處理廢棄物以保護環境方面可能的應用。(舉一例)
___________________________________________________________。
答案　(1)多　葡萄糖
(2)密碼子具有簡并性
(3)BamHⅠ、SmaⅠ
(4)接種了降解纖維素能力較強的枯草芽孢桿菌(B菌)
(5)利用該工程菌處理植物秸稈等廢棄物
解析　(3)由于mRNA的合成在啟動子處開始，根據題中信息“C1酶基因以B鏈為轉錄模板鏈，轉錄時mRNA自身的延伸方向為5′→3′”及圖1中HT質粒啟動子的位置可知，轉錄模板鏈(B鏈)的3′端應位于啟動子一側，由此判斷酶切位點1對應的酶是BamHⅠ，酶切位點2對應的酶是SmaⅠ。
(4)比較圖2中的三組實驗結果，可知工程菌降解纖維素的能力最強，對照組2次之，對照組1中纖維素含量未變，由此判斷，對照組2接種了降解纖維素能力較強的枯草芽孢桿菌(B菌)。
(5)在保護環境方面，可利用該工程菌處理植物秸稈等廢棄物，或處理在草原上的牛糞等排泄物。
9．在石油開采過程中，利用表面活性劑可提高采收率。但化學合成表面活性劑的生產和使用，也帶來一定的環境污染。某些微生物可代謝產生生物表面活性劑。擬從含油污水中篩選耐高溫、高壓的產生生物表面活性劑的菌株。
(1)分離能利用石油的耐高溫菌種，流程如下圖。
①上述過程所用的培養液應以石油為________。
②固體培養基的制備過程包括：計算→稱量→溶化→________→倒平板。
③圖中A處應采用________法進行接種。
(2)通過上述分離過程，獲得16個菌株。如何從這些菌株中進一步篩選耐高壓、高產生物表面活性劑的菌種？請寫出基本思路：____________________________________________________________________________________________________________________。
(3)菌種鑒定
①根據菌種在平板上形成的________的特征，對菌種進行初步鑒定。
②16S rDNA基因存在于所有細菌中，該基因包含多個恒定區和可變區，恒定區序列基本保守，可變區序列具有種的特異性。利用16S rDNA基因的________(選填“恒定區”或“可變區”)序列設計引物，PCR擴增16S rDNA片段，然后測序，將測序結果與數據庫中相關數據進行比較進而鑒定。
(4)研究者篩選出的菌種BQ 2為好氧菌，但油井深處通常缺氧。現有一耐高溫高壓、不能產生生物表面活性劑的厭氧菌DQ 1。請寫出利用這兩個菌株獲取目的菌株的思路：_____________________________________________。
(5)簡述產生物表面活性劑菌株在石油工業應用的生態學意義。
___________________________________________________________
答案　(1)①唯一碳源　②滅菌　③涂布
(2)將待選菌種分別接種于含石油的液體培養基中，在高壓條件下培養，挑選生物表面活性劑產量高的菌株(或將待選菌種接種于石油平板培養基中，在高壓條件下培養，挑選擴油圈大的菌落)
(3)①菌落　②恒定區
(4)將BQ 2參與生物表面活性劑合成的基因導入DQ 1中(或將BQ 2與DQ 1進行融合)，然后在高溫、高壓、無氧環境下培養并分離，再篩選其中生物表面活性劑產量高的菌株
(5)生物表面活性劑由微生物生產，使用后還可以降解，有利于減少污染、保護環境

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