資源簡(jiǎn)介

新人教生物一輪復(fù)習(xí)學(xué)案
第50講　基因工程的工具和操作
課標(biāo)要求 1.闡明重組DNA技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用三種基本工具。 2.闡明基因工程的基本操作程序。
考點(diǎn)1　基因工程的原理和基本工具
概 念 落 實(shí)
1.基因工程概述
（1）又叫作　　　　　　技術(shù)。是在分子水平上，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)創(chuàng)造出新的　　　　和　　　　。
（2）原理：　　　　　。
（3）優(yōu)點(diǎn)：克服　　　　　　　　的障礙，定向改造生物的　　　　。
整 體 提 升
基因工程的理論基礎(chǔ)
2.重組DNA技術(shù)的基本工具
（1）限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）
說明：
①將一個(gè)基因從DNA分子上切割下來，需要切兩處，同時(shí)產(chǎn)生　　　　個(gè)黏性末端或平末端。
②限制酶在識(shí)別序列中心軸線兩側(cè)切開形成的是黏性末端，在識(shí)別序列中心軸線處切開形成的是　　　　。
（2）DNA連接酶
歸 納 總 結(jié)
與DNA有關(guān)的幾種酶的比較
（3）載體
特 別 提 醒
載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理
載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞，原理如圖所示：
診斷·加強(qiáng)
判斷下列說法的正誤：
（1）DNA連接酶能將兩堿基間的氫鍵連接起來。 （　　）
（2）E.coli DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端。 （　　）
（3）限制酶也可以識(shí)別和切割RNA。 （　　）
（4）質(zhì)粒是細(xì)菌擬核之外的小型環(huán)狀DNA分子，是基因工程常用的載體。 （　　）
（5）天然質(zhì)粒或噬菌體等都可以直接用作運(yùn)載基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體。 （　　）
典 題 固 法
（2021·湖北卷，7）限制酶EcoR Ⅰ識(shí)別并切割雙鏈DNA，用EcoR Ⅰ完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到的DNA片段的平均長(zhǎng)度（堿基對(duì)）約為（　　）
A.6
B.250
C.4 000
D.24 000
（2021·全國(guó)乙卷）用重組DNA技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)如圖所示。回答下列問題：
（1）常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4 DNA連接酶。上圖中　　　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA連接酶連接。上圖中　　　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。
（2）DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是　　　　。
（3）DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征。如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能　　　　；質(zhì)粒DNA分子上有　　　　　　　　，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因（如某種抗生素抗性基因），利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是　　　　　　　。
（4）表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
考向1　基因工程中的工具酶
1.下列有關(guān)DNA連接酶的說法，正確的是（　　）
A.DNA連接酶和限制酶的作用恰好相反，DNA連接酶可以將限制酶切開的雙鏈DNA片段“縫合”起來
B.DNA連接酶和DNA聚合酶一樣能連接單鏈DNA片段
C.E.coli DNA連接酶可以連接有平末端的DNA片段，也能連接有黏性末端的DNA片段
D.T4 DNA連接酶只能連接有平末端的DNA片段
考向2　基因工程的載體
2.構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，可利用堿性磷酸單酯酶催化載體的5'－P變成5'－OH，如圖所示。將經(jīng)過該酶處理的載體與外源DNA連接時(shí)，由于5'－OH與3'－OH不能連接而形成切口（nick）。下列說法錯(cuò)誤的是（　　）
A.經(jīng)堿性磷酸單酯酶處理的載體不會(huì)發(fā)生自身環(huán)化
B.外源DNA也必須用堿性磷酸單酯酶處理
C.T4 DNA連接酶可連接黏性末端和平末端
D.重組DNA經(jīng)過2次復(fù)制可得到不含nick的子代DNA
3.（2022·華師一附中）圖1為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉時(shí)使用的質(zhì)粒，圖2為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉時(shí)所用目的基因側(cè)翼涉及的限制酶的酶切位點(diǎn)。
圖1
圖2　目的基因側(cè)翼涉及的限制酶酶切位點(diǎn)
（1）為了高效地構(gòu)建基因表達(dá)載體，最好選用　　　　　　　　　（填限制酶名稱）同時(shí)酶切質(zhì)粒和目的基因。
（2）為了篩選出基因表達(dá)載體，需要將DNA連接酶處理后的溶液與大腸桿菌混合在一起進(jìn)行培養(yǎng)，為了促使大腸桿菌吸收外源DNA，需要用　　　　處理大腸桿菌，使其處于感受態(tài)。隨后再將大腸桿菌涂布在含
　　　　　　的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一般情況下這樣培養(yǎng)出來的大腸桿菌有兩種類型：一種是結(jié)合了目的基因的質(zhì)粒，一種是未結(jié)合目的基因的質(zhì)粒。可以加入　　　　　　　分別去切割兩種質(zhì)粒，其中結(jié)合了目的基因的質(zhì)粒在酶切后能產(chǎn)生目的基因。
（3）圖示質(zhì)粒在設(shè)計(jì)時(shí)插入了T－DNA序列，并且將啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和終止子序列插入T－DNA中（注：插入不會(huì)破壞T－DNA的作用），T－DNA的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（4）有人擔(dān)心基因工程中使用的抗性基因可轉(zhuǎn)移至近緣生物中，本例中的質(zhì)粒能否有助于降低氨芐青霉素抗性基因轉(zhuǎn)移到近緣生物的風(fēng)險(xiǎn)？為什么？　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
考點(diǎn)2　基因工程的基本操作程序
概 念 落 實(shí)
1.基因工程主要的四個(gè)步驟
（1）目的基因的篩選與獲取
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心
①基因表達(dá)載體的組成
②基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程
用一定的　　　　　切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口；然后用　　　　限制酶或能產(chǎn)生　　　　的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用　　　　　　將　　　　　　　　拼接到載體的切口處，這樣就形成了一個(gè)重組DNA分子。
特 別 提 醒
（1）基因表達(dá)載體≠載體：基因表達(dá)載體與載體相比增加了目的基因。
（2）目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的：基因表達(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入啟動(dòng)子與終止子之間的部位，若目的基因插入啟動(dòng)子內(nèi)部，啟動(dòng)子將失去原功能。
（3）啟動(dòng)子、終止子與起始密碼子、終止密碼子的區(qū)別
位置 作用
啟動(dòng)子 位于DNA分子上 RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程
起始密碼子 位于mRNA分子上 決定翻譯的開始
終止子 位于DNA分子上 決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束
終止密碼子 位于mRNA分子上 決定翻譯的結(jié)束
方 法 規(guī) 律
構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)限制酶的選擇
甲
（1）根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)選擇限制酶
①應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。
②不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。這樣才能保證目的基因的完整性。
③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶（但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn)）。但如果不同的限制酶切割DNA分子所產(chǎn)生的末端也存在互補(bǔ)關(guān)系時(shí)，則這樣的兩個(gè)末端也可連接。
（2）根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類
①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。
②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中的限制酶 SmaⅠ 會(huì)破壞標(biāo)記基因。
乙
（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
受體細(xì)胞 導(dǎo)入方法 內(nèi)容
植物細(xì)胞 　　　　法 用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中等
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)的Ti質(zhì)粒上的　　　　可攜帶目的基因整合到受體細(xì)胞的　　　　　DNA上
動(dòng)物細(xì)胞 　　　　技術(shù) 常用受體細(xì)胞：　　　
原核細(xì)胞 Ca2＋處理法 用　　　　處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)
（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定
檢測(cè)水平 具體方法
分子水平 的檢測(cè) ①通過　　　　　等技術(shù)檢測(cè)棉花的染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA； ②從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行　　　　　　　　，檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)
　　　 水平的 鑒定 例如，通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定抗蟲基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度
方 法 規(guī) 律
如何篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞
（1）原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時(shí)，如果目的基因插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會(huì)導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。
（2）被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌。
（3）篩選方法：將細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長(zhǎng)的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)粒的細(xì)菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長(zhǎng)的菌落為2、3、4， 則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。
2.PCR技術(shù)
（1）PCR概述
過程 說明 圖解
　　　　 ①條件：溫度上升到　　　　℃以上； ②實(shí)質(zhì)：雙鏈DNA解鏈為單鏈
　　　　 ①條件：溫度下降到　　℃左右； ②實(shí)質(zhì)：兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合
　　　　 ①條件：　　℃左右； ②實(shí)質(zhì)：Taq DNA聚合酶有最大活性，可使DNA新鏈由　　　　端延伸
注：PCR的反應(yīng)過程都是在PCR擴(kuò)增儀中完成的。（操作詳見實(shí)驗(yàn)17）
歸 納 總 結(jié)
PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較
（2）PCR反應(yīng)體系中的條件分析
①PCR反應(yīng)需要在一定的　　　　中進(jìn)行，加入復(fù)制需要的各組分，同時(shí)控制溫度。
②因?yàn)榉磻?yīng)循環(huán)中需要高溫變性，使用的DNA聚合酶為　　　　　　　　　　。
③引物是一段20～30個(gè)堿基的　　　　　，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與模板片段結(jié)合，游離的脫氧核苷酸加到引物的　　　　端。
④PCR反應(yīng)不需要解旋酶，DNA在　　　　下會(huì)打開雙鏈。
⑤在PCR反應(yīng)過程中加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作為合成DNA子鏈的　　　　，又可為DNA的合成提供　　　　。（dNTP加入到延伸鏈的3'端，與上一個(gè)核苷酸形成二酯鍵，同時(shí)釋放一個(gè)焦磷酸PPi）
（3）PCR擴(kuò)增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律
循環(huán)次數(shù) 1 2 3 n
DNA分子數(shù) 2 4 8 　　
含引物A（或B）的DNA分子數(shù) 1 3 7 　　
同時(shí)含引物A、B的DNA分子數(shù) 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 　　
共消耗的引物數(shù)量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 －2
診斷·加強(qiáng)
1.判斷下列說法的正誤：
（1）用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)需要設(shè)計(jì)兩種引物。 （　　）
（2）用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不必知道基因的全部序列。 （　　）
（3）在PCR反應(yīng)體系中未加入ATP，因?yàn)镻CR反應(yīng)過程不需要能量。 （　　）
（4）為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體。 （　　）
（5）應(yīng)用DNA探針技術(shù)，可以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達(dá)。 （　　）
2.構(gòu)建基因表達(dá)載體需要兩種工具酶：　　　　　　　　　　　　　。
3.將導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞培育成完整的植株要用到　　　　　　　技術(shù)。
4.PCR不可以擴(kuò)增mRNA的原因：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，必須把mRNA逆轉(zhuǎn)錄成　　　　　之后再做PCR。
典 題 固 法
（2022·海南卷）以我國(guó)科學(xué)家為主的科研團(tuán)隊(duì)將OSNL（即4個(gè)基因Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A的縮寫）導(dǎo)入黑羽雞胚成纖維細(xì)胞（CEFs），誘導(dǎo)其重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS），再誘導(dǎo)iPS分化為誘導(dǎo)原始生殖細(xì)胞（iPGCs），然后將iPGCs注射到孵化2.5 d的白羽雞胚血管中，最終獲得具有黑羽雞遺傳特性的后代，實(shí)驗(yàn)流程如圖。回答下列問題：
（1）CEFs是從孵化9 d的黑羽雞胚中分離獲得的，為了獲得單細(xì)胞懸液，雞胚組織剪碎后需用　　　　　　
　　　　處理。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)通常需要在合成培養(yǎng)基中添加　　　　　等天然成分，以滿足細(xì)胞對(duì)某些細(xì)胞因子的需求。
（2）體外獲取OSNL的方法有　　　　　　　　　　（答出1種即可）。若要在CEFs中表達(dá)外源基因的蛋白，需構(gòu)建基因表達(dá)載體，載體中除含有目的基因和標(biāo)記基因外，還須有啟動(dòng)子和　　　　等。啟動(dòng)子是　
　　　　　識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)　　　　　　　　　。
（3）iPS 細(xì)胞和 iPGCs 細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能不同的根本原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。
（4）誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的技術(shù)與體細(xì)胞核移植技術(shù)的主要區(qū)別是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（5）該實(shí)驗(yàn)流程中用到的生物技術(shù)有　　　　　　　　　　　（答出2點(diǎn)即可）。
（2022·河北卷節(jié)選）蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)化是作物抗蟲育種的新途徑。某研究團(tuán)隊(duì)將胰蛋白酶抑制劑（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制劑（StPinlA）的基因單獨(dú)或共同轉(zhuǎn)化棉花，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。回答下列問題：
（1）蛋白酶抑制劑的抗蟲機(jī)制是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（2）　　　　　　　　　　是實(shí)施基因工程的核心。
（3）利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法時(shí)，必須將目的基因插入到質(zhì)粒的　　　　上。
（4）為檢測(cè)目的基因在受體細(xì)胞基因組中的整合及其轉(zhuǎn)錄和翻譯，可采用的檢測(cè)技術(shù)有　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（寫出兩點(diǎn)即可）。
（5）確認(rèn)抗蟲基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)后，還需進(jìn)一步檢測(cè)抗蟲的　　　　以鑒定其抗性程度。
（6）基因突變可產(chǎn)生新的等位基因，在自然選擇的作用下，昆蟲種群的基因頻率會(huì)發(fā)生　　　　。導(dǎo)致昆蟲朝著一定的方向不斷進(jìn)化。據(jù)此推測(cè)，胰蛋白酶抑制劑轉(zhuǎn)基因作物長(zhǎng)期選擇后，某些害蟲具有了抗胰蛋白酶抑制劑的能力，其分子機(jī)制可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（寫出2點(diǎn)即可）。
（2022·全國(guó)乙卷）新冠病毒感染出現(xiàn)后，病毒核酸檢測(cè)和疫苗接種發(fā)揮了重要作用。回答下列問題：
（1）新冠病毒是一種RNA病毒，檢測(cè)新冠病毒RNA（核酸檢測(cè)）可以采取RT－PCR法。這種方法的基本原理是先以病毒RNA為模板合成cDNA，這一過程需要的酶是　　　　，再通過PCR技術(shù)擴(kuò)增相應(yīng)的DNA片段。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷被檢測(cè)者是否感染新冠病毒。
（2）為了確保新冠病毒核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性，在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)必須依據(jù)新冠病毒RNA中的　　　　　　　　來進(jìn)行。PCR過程每次循環(huán)分為3步，其中溫度最低的一步是　　　　。
（3）某人同時(shí)進(jìn)行了新冠病毒核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)（檢測(cè)體內(nèi)是否有新冠病毒抗體），若核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性而抗體檢測(cè)結(jié)果為陽性，說明　　　　　　　　　　（答出1種情況即可）；若核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽性，說明　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（4）常見的病毒疫苗有滅活疫苗、蛋白疫苗和重組疫苗等。已知某種病毒的特異性蛋白S（具有抗原性）的編碼序列（目的基因）。為了制備蛋白疫苗，可以通過基因工程技術(shù)獲得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（2021·全國(guó)甲卷）PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測(cè)。為檢測(cè)患者是否感染了某種病原菌，醫(yī)生進(jìn)行了相關(guān)操作：①分析PCR擴(kuò)增結(jié)果；②從患者組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴(kuò)增DNA片段；④采集患者組織樣本。回答下列問題：
（1）若要得到正確的檢測(cè)結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（用數(shù)字序號(hào)表示）。
（2）操作③中使用的酶是　　　　　　　，PCR 反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、　　　　三步，其中復(fù)性的結(jié)果是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（3）為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與　　　　　　　　特異性結(jié)合。
（4）PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是指　　　　　　　　　　　　　　　　　。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。
考向1　PCR技術(shù)
1.（2022·廣東測(cè)試）圖1是我國(guó)自主設(shè)計(jì)的“本地＋移動(dòng)”一站式新冠病毒核酸檢測(cè)平臺(tái)示意圖，單平臺(tái)混樣日檢測(cè)量可達(dá)13萬人次。圖2為RT－PCR（逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR技術(shù)）的原理：PCR過程中探針和引物一起與模板結(jié)合，探針兩側(cè)分別帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)（抑制熒光發(fā)出），當(dāng)酶催化子鏈延伸至探針處時(shí)會(huì)水解探針，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而發(fā)出熒光。請(qǐng)回答下列問題：
圖1 圖2
（1）PCR技術(shù)的目的是　　　　　　　　　　　　　　。RT－PCR過程中，需先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，故裝置中需添加的酶有　　　　　　　　　　　　　　。
（2）對(duì)新冠病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，探針的設(shè)計(jì)依據(jù)是　　　　　　　　　　　　　。探針與模板結(jié)合發(fā)生在PCR循環(huán)中的　　　　（選填“變性”“復(fù)性”或“延伸”）階段。
（3）若監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到熒光信號(hào)，則可判定該檢測(cè)樣本為陽性，其原理是　　　　　　　　　　　　　。
（4）為了在沒有核酸檢測(cè)的條件下及早發(fā)現(xiàn)新冠病毒，我國(guó)于2022年3月11日推出新冠病毒抗原檢測(cè)試劑盒作為核酸檢測(cè)的補(bǔ)充措施，該試劑盒的檢測(cè)原理是　　　　　　　　　　　　　　。
考向2　基因表達(dá)載體的構(gòu)建
2.（2022·深圳模擬）將編碼四種不同酶的基因OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因連接，搭載到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T－DNA片段中構(gòu)建多基因表達(dá)載體，最終在水稻葉綠體內(nèi)構(gòu)建了一條新代謝途徑，提高了水稻的產(chǎn)量。下列說法錯(cuò)誤的是（　　）
A.可用分子雜交技術(shù)檢測(cè)四個(gè)基因是否成功導(dǎo)入水稻
B.四個(gè)基因轉(zhuǎn)錄時(shí)都以DNA的同一條單鏈為模板
C.應(yīng)選用含潮霉素的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化成功的水稻細(xì)胞
D.基因表達(dá)載體中的四個(gè)基因在水稻細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄
3.（2022·北京一模）下圖表示pBR322質(zhì)粒和人生長(zhǎng)激素基因所在片段的結(jié)構(gòu)信息，將二者構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌并進(jìn)行篩選。下列敘述錯(cuò)誤的是（　　）
pBR322質(zhì)粒 人生長(zhǎng)激素基因
注：AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，TetR表示四環(huán)素抗性基因。
A.應(yīng)選擇的限制酶組合是酶F和酶G
B.所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因
C.用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出含重組質(zhì)粒的受體菌
D.同時(shí)用三種限制酶處理圖中質(zhì)粒，電泳后可得到4個(gè)條帶
考向3　基因工程的基本操作程序
4.（2022·佛山一模）戊型肝炎是由戊型肝炎病毒（HEV）引起的一種急性傳染性肝炎，發(fā)病率和死亡率都很高。世界首支戊型肝炎疫苗是我國(guó)科研工作者通過基因工程技術(shù)研制成功的。如圖為一種戊肝疫苗研制的技術(shù)流程圖，其中ORF2蛋白是戊肝病毒的表面抗原，能引起人體特異性免疫反應(yīng)。據(jù)圖分析并回答下列問題：
注：引物P1（5'—CTAGCTAGCGCCACCATGCCTACCCCCTCTCCTGC—3'）含NheⅠ酶切位點(diǎn)；
引物F1（5'—CGCGATCCTTACTAAGGGTAATCAACTGTCCTCC—3'）含BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)。
（1）過程①需要　　　　　　　酶的參與。過程②除引物和模板外，還需往緩沖液中加入　　　　　　　　　。
（2）實(shí)驗(yàn)中使用的pBV220載體上應(yīng)該具有　　　　　　　　　　　　　　　　。過程③需要的關(guān)鍵酶有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
（3）過程④常用的方法是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
過程⑤需要依據(jù)　　　　　　　　　　　原理對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
（4）與普通滅活或減活疫苗相比，上述方法制備的疫苗的主要優(yōu)點(diǎn)是　　　　　　　　　　　　　　　。
構(gòu)核心概念
練教材長(zhǎng)句
鏈接選擇性必修3教材 P72“資料卡”。
（1）限制酶主要來源于原核生物，但為什么不會(huì)切割自身DNA分子？
（2）
鏈接選擇性必修3教材 P72正文。
（2）用作基因工程載體的質(zhì)粒需要具有能　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　等特點(diǎn)。
鏈接選擇性必修3教材 P81“資料卡”。
（3）農(nóng)桿菌能作為基因工程的載體，是因?yàn)椤　　　　　　　　　　。?dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能　　　　　　　　　　　　　，并且將其　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
拎教材“冷”點(diǎn)
鏈接選擇性必修3教材 P72旁欄思考題。
（1）DNA連接酶和DNA聚合酶的不同點(diǎn)體現(xiàn)在：DNA連接酶連接的是　　　　　　，而DNA聚合酶是把　　　　　　　　　連接到已有的DNA片段上。
鏈接選擇性必修3教材P77“旁欄思考”
（2）PCR引物既可以是DNA單鏈，也可以為　　　　　。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，也需要　　　　，一般為RNA片段。
（3）真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要　　　　　激活，因此，一般要添加到PCR反應(yīng)緩沖溶液中。
第50講　基因工程的工具和操作
考點(diǎn)1　基因工程的原理和基本工具
【概念落實(shí)】
1.（1）重組DNA　生物類型　生物產(chǎn)品　（2）基因重組　（3）遠(yuǎn)緣雜交不親和　遺傳性狀
2.（1）原核生物　數(shù)千　特定核苷酸序列　磷酸二酯鍵　黏性末端　①4　②平末端　（2）磷酸二酯鍵　大腸桿菌　黏性末端　黏性末端和平末端　（3）環(huán)狀雙鏈DNA分子　噬菌體　有一個(gè)至多個(gè)　自我復(fù)制　受體DNA　標(biāo)記
【診斷·加強(qiáng)】
（1）×　（2）×　（3）×　（4）√　（5）×　提示：一般來說，天然載體往往不能滿足人類的所有要求，因此人們常根據(jù)不同的目的和需要，對(duì)某些天然的載體進(jìn)行人工改造。
【典題固法】
【高考典例】
例1　C　解析：據(jù)題意可知，限制酶EcoR Ⅰ的識(shí)別序列為，則理論上，該序列出現(xiàn)的概率為1/（4×4×4×4×4×4）＝1/4 096，即4 096個(gè)堿基對(duì)序列中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)限制酶EcoR Ⅰ的識(shí)別序列，故用EcoR Ⅰ完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到DNA片段的平均長(zhǎng)度（堿基對(duì)個(gè)數(shù)）約為4 000，C符合題意。
例2　 （1）EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ　（2）磷酸二酯鍵　（3）自我復(fù)制　限制酶切割位點(diǎn)　用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞　（4）RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列
解析：（1）由題圖可以看出，EcoRⅠ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分別形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.coli DNA連接酶可用于連接黏性末端，T4 DNA連接酶可用于連接黏性末端和平末端。（2）DNA連接酶催化DNA鏈的5'端與另一DNA鏈的3'端生成磷酸二酯鍵。（3）復(fù)制原點(diǎn)是在基因組上復(fù)制起始的一段序列，可以保證質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制。質(zhì)粒上有限制酶切割位點(diǎn)，該位點(diǎn)可被限制酶切開并使外源目的基因插入其中。若質(zhì)粒DNA分子上有某種抗生素抗性基因，則可以用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞。（4）啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)。
【對(duì)點(diǎn)演練】
1.A　解析：DNA連接酶不能連接單鏈DNA片段，DNA聚合酶是將單個(gè)脫氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，B錯(cuò)誤；E.coli DNA連接酶只能連接有黏性末端的DNA片段，C錯(cuò)誤；T4 DNA連接酶既可以連接有黏性末端的DNA片段，也可以連接有平末端的DNA片段，D錯(cuò)誤。
2.B　解析：將經(jīng)過堿性磷酸單酯酶處理的載體與外源DNA連接時(shí)，由于5'－OH與3'－OH不能連接而形成切口（nick），因此經(jīng)堿性磷酸單酯酶處理的載體不會(huì)發(fā)生自身環(huán)化，A正確；外源DNA不能用堿性磷酸單酯酶處理，如用堿性磷酸單酯酶處理，載體與外源DNA不能連接形成重組DNA，B錯(cuò)誤；T4 DNA連接酶可連接黏性末端和平末端，C正確；DNA進(jìn)行半保留復(fù)制，1個(gè)重組DNA經(jīng)過2次復(fù)制，可得到2個(gè)不含nick的子代DNA，D正確。
3.（1）Hind Ⅲ和BamHⅠ　（2）CaCl2（或Ca2＋）　氨芐青霉素　Hind Ⅲ和BamHⅠ　（3）將插入T－DNA中的DNA序列轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞染色體DNA上　（4）能，只有T－DNA之間的DNA序列可以轉(zhuǎn)移至染色體DNA上，本例中氨芐青霉素抗性基因不能轉(zhuǎn)移到染色體DNA上，個(gè)體發(fā)育過程中會(huì)隨著細(xì)胞分裂而逐漸丟失，因而不會(huì)轉(zhuǎn)移至近緣生物中
解析：（1）高效構(gòu)建基因表達(dá)載體宜采用雙酶切，即選用Hind Ⅲ和BamHⅠ同時(shí)切割質(zhì)粒和目的基因。（2）篩選時(shí)需要用到抗性基因，在本質(zhì)粒中抗性基因是氨芐青霉素抗性基因，因此在重組體篩選時(shí)需要用到含氨芐青霉素的培養(yǎng)基。使用DNA連接酶連接后的重組質(zhì)粒中，原來切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶酶切位點(diǎn)在重組質(zhì)粒中再次出現(xiàn)，可以使用同樣的限制酶（HindⅢ和BamHⅠ）將重組質(zhì)粒再次切開。（4）因?yàn)門－DNA中插入啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和終止子之后并不影響T－DNA的作用，所以T－DNA會(huì)把T－DNA中插入的DNA片段轉(zhuǎn)移到染色體DNA上，這樣氨芐青霉素抗性基因?qū)o法轉(zhuǎn)移到染色體DNA上而保留在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)中的DNA無法穩(wěn)定的保存和復(fù)制，在個(gè)體發(fā)育過程中隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而丟失，從而降低了抗性基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。
考點(diǎn)2　基因工程的基本操作程序
【概念落實(shí)】
1.（1）結(jié)構(gòu)和功能清晰　序列數(shù)據(jù)庫(kù)　目的基因　PCR　基因文庫(kù)　（2）①上游　RNA聚合酶　下游　目的基因　②限制酶　同種　相同末端　DNA連接酶　目的基因片段　（3）花粉管通道　T－DNA　染色體　顯微注射　受精卵　Ca2＋　（4）PCR　抗原—抗體雜交　個(gè)體生物學(xué)
2.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)　DNA復(fù)制　脫氧核苷酸　引物　2n　變性　90　復(fù)性　50　延伸　72　5'端向3'　（2）①緩沖溶液　②耐高溫的DNA聚合酶　③單鏈核酸　3'　④高溫　⑤原料　能量　（3）2n　2n－1　2n－2
【診斷·加強(qiáng)】
1.（1）√　（2）√　（3）×　（4）×　（5）×
2.限制酶和DNA連接酶
3.植物組織培養(yǎng)
4.PCR是用DNA雙鏈做模板的，不能直接用單鏈RNA進(jìn)行PCR　單鏈cDNA
【典題固法】
【高考典例】
例1　（1）胰蛋白酶或膠原蛋白酶　血清　（2）利用PCR獲取和擴(kuò)增、通過構(gòu)建基因文庫(kù)來獲取　終止子　RNA聚合酶　基因轉(zhuǎn)錄出mRNA　（3）基因的選擇性表達(dá)　（4）誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的技術(shù)是指誘導(dǎo)已分化的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，而體細(xì)胞核移植技術(shù)是指將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞中，使這個(gè)重新組合的細(xì)胞發(fā)育成新胚胎，繼而發(fā)育成個(gè)體的技術(shù)　（5）基因工程、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)
解析：（2）體外獲取目的基因的方法有多種，如基因文庫(kù)法、 PCR技術(shù)、人工合成法。基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子等結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)子是 RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了啟動(dòng)子才能驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)。（3）iPGCs細(xì)胞是由iPS細(xì)胞增殖、分化而來的，兩者在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能方面不同的根本原因是基因的選擇性表達(dá)。（4）誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的技術(shù)與體細(xì)胞核移植技 術(shù)存在明顯的區(qū)別，主要表現(xiàn)在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的技術(shù)是 將已分化的細(xì)胞誘導(dǎo)為類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞 （iPS），再誘導(dǎo)iPS分化為誘導(dǎo)原始生殖細(xì)胞（iPGCs） 的技術(shù)；而體細(xì)胞核移植技術(shù)是將動(dòng)物一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞中，使這個(gè)重新組合的細(xì)胞發(fā)育成新胚胎，繼而發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)。（5）分析題意可知，該實(shí)驗(yàn)流程中用到的生物技術(shù)有基因工程、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)。
例2　（1）調(diào)節(jié)害蟲胰蛋白酶活性，從而使害蟲不能正常消化食物　（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（或表達(dá)載體的構(gòu)建）　（3）T－DNA　（4）基因—DNA分子雜交技術(shù)、mRNA—分子雜交技術(shù)、抗原—抗體雜交技術(shù)　（5）效果　（6）定向改變　害蟲發(fā)生基因突變后，在胰蛋白酶抑制劑的選擇下，抗性基因頻率逐漸增高，從而提升了其抗胰蛋白酶抑制劑的能力，或胰蛋白酶抑制劑基因發(fā)生突變后不能編碼出胰蛋白酶抑制劑
解析：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理：農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。根據(jù)農(nóng)桿菌的這一特點(diǎn)，如果將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以把目的基因整合到植物細(xì)胞中染色體的DNA上。在自然選擇的作用下，種群的基因頻率會(huì)發(fā)生定向改變，導(dǎo)致生物朝一定方向不斷進(jìn)化。
例3　（1）逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）　（2）特異性核苷酸序列　退火（復(fù)性）　（3）曾感染新冠病毒，已康復(fù)　已感染新冠病毒，是患者　（4）獲取S蛋白基因→構(gòu)建S蛋白基因與載體的表達(dá)載體→導(dǎo)入受體細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定 （檢測(cè)受體能否產(chǎn)生S蛋白）
解析：（1）分析題意可知，新冠病毒的遺傳物質(zhì)是RNA，而RT－PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的過程屬于逆轉(zhuǎn)錄過程，逆轉(zhuǎn)錄過程需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）。（2）PCR過程需要加入引物，設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)有一段已知目的基因的核苷酸序列，在該過程中為了確保新冠病毒核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性，在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)必須依據(jù)新冠病毒RNA中的特異性核苷酸序列來進(jìn)行。PCR過程每次循環(huán)分為3步，分別為變性（90～95 ℃）、復(fù)性（55～60 ℃）、延伸（70～75 ℃），故其中溫度最低的一步是復(fù)性。（3）某人同時(shí)進(jìn)行了新冠病毒核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)，若核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性而抗體檢測(cè)結(jié)果為陽性，說明該個(gè)體曾經(jīng)感染過新冠病毒，機(jī)體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體，將病毒消滅，則核酸檢測(cè)為隱性，但由于抗體有一定的時(shí)效性，能在體內(nèi)存在一段時(shí)間，故抗體檢測(cè)為陽性；若核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽性，說明該個(gè)體體內(nèi)仍含有病毒的核酸，機(jī)體仍進(jìn)行特異性免疫過程，能產(chǎn)生抗體，則說明該人已經(jīng)感染新冠病毒，為患者。（4）基因工程的基本操作流程是：獲取目的基因→基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定，結(jié)合題意，本基因工程的目的是獲得大量的S蛋白。
例4　（1）④②③①　（2）耐高溫的DNA聚合酶　延伸　引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與單鏈DNA結(jié)合　（3）病原菌DNA　（4）在生物體外大量快速擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)
【對(duì)點(diǎn)演練】
1.（1）短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因　逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶　（2）新冠病毒的核苷酸序列　復(fù)性　（3）檢測(cè)樣本中存在新冠病毒RNA，其逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可與探針特異性結(jié)合，PCR過程中探針被水解而發(fā)出熒光　（4）抗原與抗體特異性結(jié)合
解析：（1）PCR技術(shù)的目的是大量擴(kuò)增目的基因片段，用于基因工程或檢測(cè)。以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，是逆轉(zhuǎn)錄過程，需要用到逆轉(zhuǎn)錄酶；PCR過程中需要用到Taq酶。（2）探針是可以與模板結(jié)合的一小段DNA序列，故設(shè)計(jì)的依據(jù)是一段已知目的基因的核苷酸序列，即新冠病毒的核苷酸序列。變性過程是DNA雙鏈打開的過程，復(fù)性時(shí)，引物與探針結(jié)合到模板DNA上。（3）根據(jù)題意，當(dāng)酶催化子鏈延伸至探針處時(shí)會(huì)水解探針，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而發(fā)出熒光。因此，樣本中有新冠病毒核酸時(shí)，能進(jìn)行快速?gòu)?fù)制，導(dǎo)致其熒光信號(hào)加強(qiáng)。
2.B　解析：若基因成功導(dǎo)入，則加入以基因的某一個(gè)片段制成的探針，會(huì)形成DNA雜交帶，該方法稱為分子雜交技術(shù)，A正確；DNA的兩條鏈反向平行，假設(shè)圖中DNA分子上面一條鏈為5'→3'方向，RNA聚合酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄時(shí)只能與模板鏈的3'端結(jié)合，結(jié)合圖示啟動(dòng)子的方向可知，EcCAT的模板鏈為下鏈，OsGLO1的模板鏈為上鏈，EcGCL和TSR的模板鏈為下鏈，故4個(gè)基因轉(zhuǎn)錄時(shí)不是都以DNA的同一條單鏈為模板，B錯(cuò)誤；結(jié)合圖示可知，潮霉素抗性基因在T－DNA中，會(huì)整合到植物的染色體上，因此用含潮霉素的培養(yǎng)基可以篩選轉(zhuǎn)化成功的水稻細(xì)胞，C正確；搭載到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T－DNA片段中的4個(gè)基因會(huì)隨著T－DNA的轉(zhuǎn)移而整合到植物的染色體上，因此基因表達(dá)載體中的四個(gè)基因在水稻細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，D正確。
3.C　解析：為避免切割后DNA片段的自身環(huán)化，又保留質(zhì)粒上的標(biāo)記基因，切割時(shí)應(yīng)選擇的限制酶組合是酶F和酶G，A正確；所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于對(duì)含有目的基因的受體菌進(jìn)行選擇，B正確；用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選出的有導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌和導(dǎo)入原質(zhì)粒的受體菌，C錯(cuò)誤；據(jù)圖可知，同時(shí)用三種限制酶處理圖中質(zhì)粒，因酶E有兩個(gè)作用位點(diǎn)，故將質(zhì)粒切割成了4個(gè)DNA片段，電泳后可得到4個(gè)條帶，D正確。
4.（1）逆轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄）　Taq酶、dNTP　（2）Nhe Ⅰ 和 BamH Ⅰ 酶切位點(diǎn)、標(biāo)記基因　限制酶、DNA 連接酶　（3）Ca2＋轉(zhuǎn)化法　抗原、抗體特異性結(jié)合　（4）僅需注射病毒的部分蛋白進(jìn)入人體，更安全
解析：（1）①表示逆轉(zhuǎn)錄，需要逆轉(zhuǎn)錄酶的參與；②表示PCR，需要耐高溫的DNA聚合酶的催化，還需要原料dNTP。（2）根據(jù)引物上含有Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)可知，pBV220載體上應(yīng)該含有Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)，另外還需要有標(biāo)記基因，便于篩選和鑒定目的基因。③表示構(gòu)建基因表達(dá)載體，需要限制酶和DNA連接酶的參與。（3）④表示將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，常用鈣離子處理法。⑤表示目的基因的檢測(cè)和鑒定，常用抗原、抗體雜交法檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物，原理是抗原、抗體的特異性結(jié)合。（4）與普通滅活或減活疫苗相比，上述方法制備的疫苗只需要注射病毒的部分蛋白進(jìn)入人體即可，相對(duì)來說更安全。
課堂小結(jié)與延伸
【構(gòu)核心概念】
限制性內(nèi)切核酸酶　DNA連接酶　質(zhì)粒、動(dòng)植物病毒、噬菌體　PCR技術(shù)　基因表達(dá)載體　花粉管通道法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法　顯微注射法　感受態(tài)法　檢測(cè)與鑒定
【練教材長(zhǎng)句】
（1）提示：限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并在特定的位點(diǎn)進(jìn)行切割。
（2）自我復(fù)制、有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因及對(duì)受體細(xì)胞無害
（3）農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒　將Ti質(zhì)粒上的T－DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞　整合到該細(xì)胞的染色體DNA上
【拎教材“冷”點(diǎn)】
（1）兩個(gè)DNA片段　單個(gè)的脫氧核苷酸
（2）RNA單鏈　引物　（3）M

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