資源簡(jiǎn)介

新人教生物一輪復(fù)習(xí)學(xué)案
第51講　DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
課標(biāo)要求 1.按照實(shí)驗(yàn)操作步驟，進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)（活動(dòng)）。 2.利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定，或運(yùn)用軟件進(jìn)行虛擬PCR實(shí)驗(yàn)（活動(dòng)）。
實(shí)驗(yàn)17　DNA的粗提取與鑒定
實(shí) 驗(yàn) 回 歸
1.實(shí)驗(yàn)原理
（1）提取的原理
①DNA不溶于　　　　，但某些蛋白質(zhì)可以，利用這一原理，可初步分離DNA與蛋白質(zhì)。
②DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于　　　　的NaCl溶液。
（2）鑒定的原理：DNA＋二苯胺試劑　　　　。
2.方法步驟
（1）稱取約30 g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10 mL研磨液，充分　　　　。
（2）在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4 ℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。
（3）在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的　　　　溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），靜置2～3 min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的　　　　。將玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分。
（4）取兩支20 mL的試管，各加入2 mol·L－1的NaCl溶液5 mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCl溶液中。然后，向兩支試管中各加入4 mL的　　　　試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5 min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。呈　　　　的試管中含有DNA。
實(shí) 驗(yàn) 提 煉
1.DNA與蛋白質(zhì)的溶解性
項(xiàng)目 溶解規(guī)律 2 mol·L－1NaCl溶液 0.14 mol·L－1 NaCl溶液
DNA 溶解 析出
蛋白質(zhì) NaCl溶液濃度從 2 mol·L－1降低到0.14 mol·L－1過程中，溶解度逐漸增大 部分發(fā)生鹽析沉淀 溶解
2.實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
（1）取材原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大。
（2）過濾含DNA的研磨液時(shí)不能用濾紙代替紗布，否則會(huì)因DNA被吸附到濾紙上，而導(dǎo)致DNA大量損失。
（3）加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
（4）二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果
素 養(yǎng) 點(diǎn) 撥
試劑的選擇和使用
生物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)材料進(jìn)行處理、實(shí)驗(yàn)具體操作及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的檢測(cè)等過程中，經(jīng)常用到多種試劑，根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理、材料性質(zhì)、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡冗x擇合適的材料尤為重要，試劑的正確使用也影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
（1）用二苯胺鑒定DNA時(shí)需水浴加熱，試回顧還有哪些試劑使用或?qū)嶒?yàn)過程中需水浴加熱？請(qǐng)舉例說明。
（2）高中生物實(shí)驗(yàn)中，哪些試劑使用時(shí)需現(xiàn)用現(xiàn)配？試舉例。
典 題 固 法
1.（2022·山東卷）關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說法錯(cuò)誤的是（　　）
A.過濾液沉淀過程在4 ℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解
B.離心研磨液是為了加速DNA的沉淀
C.在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)
2.（2021·山東卷）粗提取DNA時(shí)，向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液進(jìn)行下列處理后再進(jìn)行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對(duì)含量較高的白色絲狀物的處理方式是（　　）
A.加入適量的木瓜蛋白酶
B.37～40 ℃的水浴箱中保溫10～15 min
C.加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精
D.加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至2 mol·L－1→過
濾→調(diào)節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14 mol·L－1
3.（2019·江蘇卷）下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的敘述，錯(cuò)誤的是（　　）
A.用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近
B.DNA析出過程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂
C.預(yù)冷的乙醇可用來進(jìn)一步純化粗提的DNA
D.用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行水浴加熱
實(shí)驗(yàn)18　 DNA片段擴(kuò)增及電泳鑒定
實(shí) 驗(yàn) 回 歸
1.實(shí)驗(yàn)原理
（1）擴(kuò)增原理：PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠　　　　　　　的儀器。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。
（2）電泳原理：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷　　　　的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳。PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長(zhǎng)為　　　　的紫外燈下被檢測(cè)出來。
2.PCR反應(yīng)條件
①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境；②DNA模板；③分別與模板DNA兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物（一小段　　　　　　）；④A、T、G、C 4種　　　　　　；⑤耐高溫的DNA聚合酶，一般用　　　　　　　；⑥能嚴(yán)格控制　　　　變化的溫控設(shè)備。
3.實(shí)驗(yàn)過程
（1）擴(kuò)增DNA片段
①在微量離心管中依次加入各組分（配方略）。
②待所有的組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10 s，使反應(yīng)液集中在管的底部。
③參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。
循環(huán)程序 變性 復(fù)性 延伸
預(yù)變性 　　　℃，5 min / /
30次 94 ℃，30 s 　　　℃，30 s 　　　℃，1 min
最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
（2）電泳
①根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖　　　　。稍冷卻后，加入適量的　　　　染料混勻。
②將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸⒉迦牒线m大小的梳子，以形成加樣孔。
③待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入　　　　內(nèi)。
④將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1 mm為宜。
⑤將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。
⑥接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5 V·cm－1。待指示劑前沿遷移接近　　　　時(shí)，停止電泳。
⑦取出凝膠置于　　　　下觀察和照相。
實(shí) 驗(yàn) 提 煉
實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
（1）為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。
（2）該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購(gòu)買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20 ℃儲(chǔ)存。使用前將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
（3）在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
（4）在操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。
典 題 固 法
1.（2021·湖北卷）某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對(duì)）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對(duì)）。為了減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是（　　）
A.增加模板DNA的量
B.延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間
C.延長(zhǎng)延伸的時(shí)間
D.提高復(fù)性的溫度
2.（2022·衡水調(diào)研）下列有關(guān)電泳的敘述，不正確的是（　　）
A.電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程
B.待測(cè)樣品中DNA分子的大小和構(gòu)象、凝膠的濃度等都會(huì)影響DNA在電泳中的遷移速率
C.進(jìn)行電泳時(shí)，帶電粒子會(huì)向著與其所帶電荷相同的電極移動(dòng)
D.PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定
第51講　DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定
實(shí)驗(yàn)17　DNA的粗提取與鑒定
【實(shí)驗(yàn)回歸】
1.（1）①酒精　②2 mol·L－1　（2）藍(lán)色
2.（1）研磨　（3）酒精　DNA　（4）二苯胺　藍(lán)色
[素養(yǎng)點(diǎn)撥]　（1）提示：斐林試劑。另外，探究溫度對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)體系也需要在不同溫度中水浴保溫。　（2）提示：斐林試劑、雙縮脲試劑和二苯胺試劑等。
【典題固法】
1.B　解析：低溫時(shí)DNA酶的活性較低，過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解，A正確；離心研磨液是為了使細(xì)胞碎片沉淀，B錯(cuò)誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色，C正確；細(xì)胞中有的蛋白質(zhì)不溶于酒精，在95%的冷酒精中與DNA一起析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)，D正確。
2.A　解析：在得到的濾液中加入適量的木瓜蛋白酶，能夠?qū)⑷旧w上的蛋白質(zhì)成分分解，容易取出DNA相對(duì)含量較高的白色絲狀物，A正確；加入木瓜蛋白酶后在37～40 ℃的水浴箱中保溫10～15 min，能夠提高DNA的相對(duì)含量，但是僅進(jìn)行水浴加熱不能提高DNA的含量，B錯(cuò)誤；加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精，可以令DNA快速析出，但是不能提高DNA的相對(duì)含量，C錯(cuò)誤；加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至2 mol·L－1，經(jīng)過濾后調(diào)至0.14 mol·L－1，2 mol·L－1 NaCl溶液是為了溶解DNA，0.14 mol·L－1是為了析出DNA，不能提高DNA的含量，D錯(cuò)誤。
3.A　解析：哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞中無細(xì)胞核和細(xì)胞器，不能提取到DNA，雞血、菜花、豌豆、菠菜等都具有細(xì)胞核，可以通過不同的方法提取DNA，用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量差異很大，A錯(cuò)誤；為防止DNA斷裂，在DNA析出過程中攪拌操作要輕柔且沿著一個(gè)方向，B正確；DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精溶液，預(yù)冷的酒精溶液可用來進(jìn)一步純化粗提的DNA，C正確；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色，D正確。
實(shí)驗(yàn)18　DNA片段擴(kuò)增及電泳鑒定
【實(shí)驗(yàn)回歸】
1.（1）自動(dòng)調(diào)控溫度　（2）相反　300 nm
2.DNA或RNA　脫氧核苷酸　Taq DNA聚合酶　溫度
3.（1）③94　55　72　（2）①熔化　核酸　③電泳槽　⑥凝膠邊緣　⑦紫外燈
【典題固法】
1.D　解析：PCR過程中，引物和模板不完全配對(duì)會(huì)形成非特異條帶，增加模板DNA的量不會(huì)減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生；延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間，有利于雙鏈DNA解聚為單鏈，不能減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生；延長(zhǎng)延伸的時(shí)間，有利于合成新的DNA鏈，但不能減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生；在一定溫度范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可減少引物和模板間的非特異性結(jié)合。
2.C　解析：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳，即帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程，A正確，C錯(cuò)誤。

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