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葉盤法的原理及影響因素
先看一道試題：
科學家利用葉盤法將葡萄的相關基因導入番茄，得到早熟番茄。葉盤法的具體做法是：先將實驗材料的葉子表面進行消毒，再用消毒過的打孔器從葉子上取下圓形小片，即葉盤。將它放在土壤農桿菌培養液中浸泡4～5min，然后用濾紙吸干，放在特殊培養基上培養兩天后，轉移到含有適當抗生素的選擇培養基上繼續培養。數周后，葉盤周圍會長出愈傷組織并分化成幼苗。請回答：
（1）科學家培養早熟番茄應用了基因工程技術，該技術的原理是 ，科學家利用葉盤法時屬于基因工程的第三步，即 。
（2）農桿菌通常感染 植物和裸子植物，是因為這些植物在傷口處的細胞會分泌大量的 化合物，吸引農桿菌。農桿菌能夠介導轉化的原因是： 。
（3）愈傷組織經后續處理可以得到早熟番茄幼苗，這是因為愈傷組織細胞中含有 和 。
答案：
（1）基因重組 將目的基因導入受體細胞
（2）雙子葉 酚類 含有的Ti質粒上的T-DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上
（3）番茄全套的遺傳物質 葡萄相關基因
解析：
（1）基因工程技術的原理是基因重組。葉盤法是將葡萄的相關基因導入番茄，是基因工程的第三步，即將目的因導入受體細胞。
（2）農桿菌通常感染雙子葉植物和裸子植物，是因為這些植物在傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農桿菌。農桿菌能夠介導轉化的原因是含有的Ti質粒上的T-DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上。
（3）愈傷組織經后續處理可以得到早熟番茄幼笛，這是因為愈傷組織細胞中含有番茄全套的遺傳物質和葡萄相關基因。
植物細胞利用農桿菌Ti質粒轉化常用的方法稱為葉盤法。葉盤法實際上是對共培養法加以改進后而創立的一種轉化方法。
那么，其原理是什么？影響因素有哪些？
葉盤法的步驟：
先將實驗材料(如煙草)的葉子表面進行消毒，再用消毒過的不銹鋼打孔器從葉子上取下圓形小片，即葉盤。
在超凈工作臺上，為了對葉盤進行接種處理，需將它放在土壤農癌桿菌培養液中浸泡4－5min，然后用濾紙吸干，放在看護培養基上進行培養，注意需將葉子背面接觸培養基。所謂看護培養基，是特定的固體培養基上均勻分布一層胡蘿卜細胞或其他細胞的懸浮液，然后覆蓋一層濾紙即成。
葉盤在看護培養基上培養兩天后，轉移到含有適當抗生素的選擇培養基上進行培養。將經過共培養的外植體轉移到加有選擇壓的脫菌分化和愈傷組織誘導培養基上。在光照的條件下，25℃進行選擇培養。選擇培養2－3周后，外植體的轉化細胞將分化出抗性不定芽，或者產生抗性愈傷組織。將這些抗性材料轉移到相應繼代選擇培養基上，或者轉入附加選擇壓的生長和分化培養基中，令其生長和誘導分化。待不定芽長到1cm以上時，切下并插入含有選擇壓的生根培養基上進行根培養，兩周左右長出不定根。最后分化出幼苗。
對這些幼苗的進一步檢測(如用Southern 印跡法、Northern 印跡法、免疫分析法等) 可以確定它們是否含外源基因以及外源基因的表達情況。
葉盤法的機理：
葉盤法實際上是對共培養法加以改進后而創立的一種轉化方法。用農桿菌感染葉片外植體并短期共培養。在培養過程中，農桿菌的vir基因被誘導，它的活化可以啟動T-DNA向植物細胞的轉移。共培養后，也要進行轉化的外植體的篩選、愈傷組織的培養、誘導分化等步驟，以得到再生植株（如圖）。
葉盤法的優點和影響因素：
葉盤法由于不需進行原生質體操作等，方法簡單，獲得轉化植株也更快，是用植物外植體為材料進行轉基因的一個良好途徑。影響遺傳轉化因素也有很多，如植物基因型，農桿菌類型，外源基因的選擇、預培養和共培養時間等。
例、葉盤轉化法是Horsch 等人于1985年發展起來的一種轉化法，以培育轉基因耐鹽毛白楊為例，操作程序是先將毛白楊葉子表面進行消毒，再用消毒過的打孔器從葉子上取下圓形小片，即葉盤。然后進行下列操作，請回答:
（1）毛白楊葉盤與重組農桿菌共培養以進行遺傳轉化：農桿菌能夠介導轉化的原因是 。
（2）脫分化和篩選培養：葉盤接種在含卡那霉素的培養基上,卡那霉素的作用是 ， 作為運載體的Ti 質粒應含有 基因，運載體上的 是 RNA聚合酶識別和結合的位點。
（3）獲得抗性植株：葉盤周圍長出愈傷組織后分別轉移到誘導“生芽”和“生根”的培養 基中，此過程培養基中加入的植物激素主要是 。
（4）耐鹽基因的檢測與鑒定:
①分子水平：可采用 的方法來檢測轉基因毛白楊提取液中有無相應的耐鹽蛋白。
②個體水平:請設計個體水平檢測方案 。
答案:
（1）含有的Ti質粒上的T-DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上
（2）篩選出被重組農桿菌感染的葉盤 卡那霉素抗性基因 啟動子
（3）生長素和細胞分裂素
（4）抗原-抗體雜交 將轉基因毛白楊種植在鹽堿地中觀察其生長狀況

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