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綠色熒光蛋白基因
先看一道試題：
某研究小組利用轉基因技術，將綠色熒光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3-GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設計了引物1和引物2用于PCR擴增，PCR產物電泳結果如圖乙所示。下列敘述正確的是（ ）
A.Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因的表達
B.翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C.2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3-GFP基因純合子
D.若用引物1和引物3進行PCR，能更好地區分雜合子和純合子
解析：由題意可知，GFP基因插入后，兩個基因共同使用同一個啟動子，Gata3基因的啟動子可以控制GFP基因的表達，A錯誤；由于啟動子區在左側，基因的編碼區在右側，因此轉錄的方向是從左到右， mRNA的 5'端為Gata3基因，3'端為GFP基因，因此翻譯先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；插入前，引物1和引物2擴增出來的片段比插入后要小，故插入前是小片段，4號條帶的小鼠是野生型，插入后是大片段，2號條帶的小鼠是Gata-GFP基因純合子，C錯誤；用引物1和引物3，只能擴增插入GFP基因，不能擴增未插入GFP的基因，因此純合子，兩條染色體都插入了GFP，可以擴增得到片段，而雜合子一條染色體插入了GFP基因，可以PCR擴增，另外一條沒有插入GFP基因，無法PCR擴增，因此，二者都可以得到一樣的片段，無法區分，D錯誤。故答案為B。
這道題，以綠色熒光蛋白（GFP）基因和目的基因Gata3的重組后導入模型小鼠進行純合子的鑒定為情境考查基因工程的必備知識。
那么，什么是綠色熒光蛋白（GFP）基因？綠色熒光蛋白有哪些應用？Gata3目的基因有哪些應用？
綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein，簡稱GFP)是一種在美國西北海岸所盛產的水母中所發現的一種蛋白質。這類學名為Aequorea victoria的水母有著美麗的外表，生存歷史超過1.6億年。
1.綠色熒光蛋白（GFP）和應用
1962年，下村修正是在這種水母的發光器官內發現天然綠色熒光蛋白。它之所以能夠發光，是因在其包含238個氨基酸的序列中，第65至67個氨基酸(絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸)殘基，可自發地形成一種熒光發色團（可以通過熒光顯微鏡觀察）。
當蛋白質鏈折疊時，這段被深埋在蛋白質內部的氨基酸片段，得以“親密接觸”，導致經環化形成咪唑酮，并發生脫水反應。但此時還不能發射熒光，只有當有分子氧存在的條件下，發生氧化脫氫，方能導致綠色熒光蛋白發色團的“成熟”，形成可發射熒光的形式。
當綠色熒光蛋白的基因和目的基因相融合時，蛋白質既能保持其原有的活性，綠色熒光蛋白的發光能力也不受影響。
通過顯微鏡觀察這種發光的“標簽”，科學家就能做到對蛋白質的位置、運動、活性以及相互作用等一目了然。
在一個活體中有數萬種不同的蛋白質，這些蛋白質精細地控制著重要的化學進程。如果蛋白機制發生故障，通常就會發生疾病。綠色熒光蛋白可幫助研究這類機制，這就是為什么綠色熒光蛋白成為生物科學極其重要的工具。在它的幫助下，科學家還能對各種細胞的作用，比如，腦神經細胞是如何發育起來的，或者癌癥細胞是如何擴散的等等。今天，已經有了許多新的不同的綠色熒光蛋白變體，這就進一步完善了綠色熒光蛋白作為基因標志在生物研究中的廣泛應用。
2.目的基因GATA3
細胞在受到內源或外源刺激時會發生DNA損傷，在所有的DNA損傷中，DNA雙鏈斷裂是最嚴重的損傷，如得不到及時有效的修復，將會導致基因組的不穩定，進而誘發癌癥。
大家比較認可的是GATA3是一種轉錄因子，該基因編碼一種屬于GATA轉錄因子家族的蛋白質。GATA-3是一種基因，它編碼轉錄因子GATA-3。轉錄因子是控制基因表達的蛋白質，而GATA-3在一些重要的生物學過程中起著重要的調節作用。需要注意的是，GATA-3在不同的組織和疾病中具有不同的表達模式和功能。
同濟大學毛志勇課題組研究表明，GATA3既參與正常乳腺上皮細胞生長及分化，又在乳腺癌發生、發展、轉移等過程發揮重要作用，臨床研究顯示GATA3是乳腺癌中的三大突變率最高的基因之一，然而GATA3是怎樣參與到腫瘤發生，它是抑癌基因還是原癌基因仍沒有清晰的界定。
他們研究發現，GATA3的突變可能導致基因組不穩定進而誘發癌癥的發生，GATA3在乳腺癌發生中可能是抑癌基因。
從上述的基因作用來看，兩者重組后，通過綠色熒光蛋白（GFP）基因表達的綠色熒光蛋白可以進行癌細胞的追蹤，通過抑癌基因（GATA3）可以研究癌細胞的發生和治療方法。另外，GATA3還在許多領域的研究中作為目的基因。
例1、采用CRISPR/Cas9基因編輯技術可將增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因定點插入到受精卵的Y染色體上，獲得轉基因雄性小鼠。該轉基因小鼠與野生型雌性小鼠交配，通過觀察熒光可確定早期胚胎的性別。下列操作錯誤的是（ ）
A．基因編輯處理的受精卵在體外培養時，不同發育階段的胚胎需用不同成分的培養液
B．基因編輯處理的受精卵在體外培養至2細胞期，須將其植入同期發情小鼠的子宮，才可獲得表達EGFP的小鼠
C．分離能表達EGFP的胚胎干細胞，通過核移植等技術可獲得大量的轉基因小鼠
D．通過觀察早期胚胎的熒光，能表達EGFP的即為雄性小鼠胚胎
解析：進行胚胎體外培養時，需配制不同成分的營養液，不同發育階段的胚胎需用不同成分的培養液，以培養不同時期的胚胎，A正確；受精的卵母細胞應培養到8細胞期，須將其植入同期發情小鼠的子宮，才可獲得表達EGFP的小鼠，B錯誤；得到大量的胚胎干細胞經過核移植技術，可獲得大量的轉基因小鼠，C正確；Y染色體只存在于雄性體內，由題干可知，綠色熒光蛋白存在于受精卵的Y染色體上，因此通過觀察早期胚胎的熒光，能表達EGFP的即為雄性小鼠胚胎，D正確。故答案為B。
例2、下圖為綠色熒光小鼠制備流程圖, Gfp是綠色熒光蛋白基因，請分析回答:
（1）構建表達載體需要的酶是: ，表達載體包含綠色熒光蛋白基因Gfp、標記基因、 、終止子和復制原點等。
（2）圖中載體上的NEO基因是一種抗生素抗性基因，圖中步驟③所用的G418是一種抗生素(對細胞有毒害作用)，添加G418的目的是 。
（3）圖中所用的胚胎干細胞來自于 。
（4）圖中步驟⑤要將細胞注射入圖中囊胚的 位置,圖中步驟⑥胚胎移植前要對代孕母鼠用激素處理,目的是 。
（5）可以使用 方法在蛋白質水平上鑒定小鼠是否存在綠色熒光蛋白。
答案：
（1）限制性核酸內切酶、DNA連接酶 啟動子
（2）篩選出導入目的基因的胚胎干細胞
（3）早期胚胎或原始性腺
（4）內細胞團　　 同期發情處理
（5）抗原－抗體雜交
解析：本題考查基因工程和胚胎工程。
（1）基因工程中，基因表達載體的構建需要限制性核酸內切酶、DNA連接酶。表達載體包括啟動子、終止子、標記基因、目的基因。
（2）NEO基因是一種抗生素抗性基因，而G418 是一種抗生素（對細胞有毒害作用），所以添加G418可將導入目的基因的胚胎干細胞篩選出來。
（3）胚胎干細胞來自早期胚胎或原始性腺。
（4）內細胞團將發育成各種組織和器官，所以應注射入內細胞團中，胚胎移植前要進行同期發情處理。
（5）在蛋白質水平鑒定蛋白質采用抗原－抗體雜交方法。

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