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高考生物核心必備知識背誦 NO.7
選必3 第3章 基因工程 核心必備知識
課本P67—69，問題
1.艾弗里等人通過肺炎鏈球菌的轉化實驗，不僅證明了遺傳物質是DNA，還證明了什么？
1.DNA可以在同種生物的不同個體之間轉移。
2.科學家證明質粒可以作為基因工程的載體，構建重組DNA，導入受體細胞，使外源基因在原核細胞中成功表達，并實現了什么，至此基因工程問世？
2.物種間的基因交流。
3.基因工程的工具和工具酶分別是什么？
3.工具：限制酶、DNA連接酶、載體 工具酶：限制酶、DNA連接酶
4.由基因工程的概念分析：操作環境？操作水平？目的？原理？優勢？其他名稱？
4.操作環境：體外
操作水平：DNA分子水平
目的：產生符合人們需要的新的生物類型和生物產品
原理：基因重組
基因工程最大的優勢：定向改造生物的遺傳性狀 其他名稱：重組DNA技術、 轉基因技術
5.基因拼接的原理？外源基在受體細胞中表達的原理？
5.目的基因和載體都是由脫氧核苷酸組成的，都是雙螺旋結構
生物界共用一套遺傳密碼。
6.啟動子、起始密碼子、終止子、終止密碼子的比較
啟動子≠起始密碼；終止子≠終止密碼，密碼子是mRNA上的，參與翻譯過程
第1節 重組DNA技術的基本工具
1.限制酶的全稱？主要來源？在原核生物中的作用？
1.限制性內切核酸酶
來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。
切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的
2.限制酶的作用特點？作用結果？ 作用的化學鍵？
2.作用特點：識別特定的核苷酸序列，切割特定部位的磷酸二酯鍵
結果：產生黏性末端或平末端 磷酸二酯鍵
3.限制酶不破壞自身DNA的原因是什么？
3.①細胞自身的DNA分子沒有該限制酶的識別序列 ②甲基化酶對識別序列進行了修飾
4. DNA連接酶的作用？分類及連接的末端？
4.恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵
①E.coliDNA連接酶：來源于大腸桿菌； 只能連接黏性末端
②T4DNA連接酶：來源于T4噬菌體； 能連接黏性末端、平末端（效率較低）
5.DNA聚合酶和DNA連接酶有什么區別？
5.①DNA聚合酶催化單個核苷酸連接到已有的核酸片段3’端，形成磷酸二酯鍵；DNA連接酶催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵
②DNA聚合酶催化形成與模板鏈互補的DNA鏈；DNA連接酶催化DNA片段連接起來，不需要模板
6.載體的種類？質粒的結構？
6.質粒、噬菌體、動植物病毒
一種裸露的、結構簡單的、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的雙鏈環狀DNA分子。
7.作為載體必須具備的條件？
7.①能在受體細胞中復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制
②具有一至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入。
③具有標記基因，便于重組DNA分子的篩選
④對受體細胞無害。
8.（1）DNA粗提取與鑒定的原理？
（2）不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞的原因？
（3）研磨后過濾的方案是？
（4）①4℃冰箱放置幾分鐘的作用？②攪拌時應輕緩、并沿一個方向的原因？
（5）鑒定試劑
（6）提取和分離DNA用塑料離心管的原因是？
8.（1）①DNA不溶于酒精，某些蛋白質溶于酒精 ②DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，溶于2mol/L的NaCl溶液③鑒定原理：DNA遇二苯胺試劑呈現藍色
（2）哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA
（3）①4℃冰箱靜置后取上清液 ②直接將研磨液倒入塑料離心管中，離心后取上清液
（4）①抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解 ②減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子
（5）二苯胺
（6）細胞破碎后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附；由于細胞內DNA的含量本來就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會更少。
第2節 基因工程的基本操作程序
1.基因工程的4步？
1.目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測和鑒定_
2.目的基因是指？Bt基因來自于哪種菌？ Bt抗蟲蛋白如何造成害蟲死亡？Bt抗蟲蛋白為何不會引起人畜死亡？
2.用于改變受體細胞性狀和獲得預期表達產物的基因 ，主要是編碼蛋白質的基因，也可以是調控因子
蘇云金桿菌
當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡
Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環境中才能表現出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體，所以不會引起人畜死亡
3.獲取目的基因的方法？
3.從基因文庫中獲取、利用PCR技術獲取和擴增、人工合成
4.基因文庫構建的方法？從人的基因組文庫中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細胞卻未得到蛋白A，原因是？
4.反轉錄法、直接分離法
基因A有內含子，在大腸桿菌中，其初始轉錄產物中與內含子對應的RNA序列不能被切除，無法表達出蛋白A
5. PCR的原理？條件？產物的鑒定方法
5.原理：DNA半保留復制。
條件：一定的緩沖液（需加入Mg2+）、2種引物、模板DNA、耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）、四種脫氧核苷酸 鑒定方法：瓊脂糖凝膠電泳
6.PCR的過程？用PCR可以擴增mRNA嗎？ 反轉錄的過程？
6.①變性：加熱至90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈；
②復性：冷卻至50℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合；
③延伸：加熱至72℃左右，在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，溶液中的四種脫氧核苷酸加到引物的3’端，合成新的DNA鏈。
不可以，需要逆轉錄成cDNA再進行擴增
①逆轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；②核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；③以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA
7.基因工程的核心步驟？構建基因表達載體的目的？為什么不直接把目的基因導入受體細胞，而要用載體？
7.基因表達載體的構建
目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達和發揮作用。
提示：游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，就算可以進行轉錄并翻譯成蛋白質，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂而進行復制，導致子代細胞中不再含有目的基因。若將目的基因插入載體，由于載體可以在細胞內復制，隨著細胞分裂，載體會帶著目的基因存在于每個子代細胞中。這樣，基因工程才有意義。
8.基因表達載體的組成及每部分的作用？
8.組成：目的基因＋啟動子＋終止子＋標記基因+復制原點 ①啟動子：RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄 ②終止子：終止轉錄，使轉錄在所需要的地方停下來。 ③標記基因：用于重組DNA分子的篩選
9.目的基因與載體結合用到的限制酶有什么要求？切割后兩個DNA片段之間連接形成的產物？
9.同種限制酶或者產生相同末端的限制酶（同尾酶） 目的基因-目的基因、目的基因-載體、載體-載體三種
10. 使用兩種切割后能產生不同黏性末端的限制酶切割目的基因和質粒的目的是什么？
10.可以防止目的基因自身環化、質粒自身環化、目的基因和質粒反向連接（或保證目的基因和質粒正確連接）
11.在構建基因表達載體時，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的識別序列？為什么？
11.不能 如果目的基因序列中含有用到的限制酶的識別序列，限制酶可能將它切斷，破壞目的基因。
12.（1）轉化的概念？（2）常用的轉化方法？
12.（1）指目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。
（2）①將目的基因導入植物細胞： 農桿菌轉化法，花粉管通道法。受體細胞多是體細胞。
②將目的基因導入動物細胞：最常用的方法是 顯微注射技術。此方法的受體細胞多是 受精卵。
③將目的基因導入微生物細胞：方法是：Ca2+ 處理法。最常用的原核細胞是 大腸桿菌
13.（1）T-DNA的作用？（2）原核生物作為受體細胞的優勢是？（3）Ca2+ 處理法的過程？（4）花粉管通道法的操作是？
13.（1）將目的基因導入受體細胞，并整合到受體細胞的染色體DNA上。
（2）繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少
（3）先用Ca2+處理細胞，使其成為容易吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，再將重組基因表達載體導入其中
（4）可以用微量注射器將含目的基因的DNA直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。
14.采用農桿菌轉化法導入目的基因時，為什么目的基因可以整合到染色體的DNA上 目的基因插入染色體DNA上的目的是什么？農桿菌轉化法中兩次拼接、兩次導入的辨析？
14.由于Ti質粒上的T-DNA可轉移到受體細胞且能整合到受體細胞的染色體DNA上,而目的基因又插入到了T-DNA上,所以目的基因可以整合到受體細胞的染色體DNA上。
使目的基因的遺傳特性得以穩定維持和表達
①第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T DNA的中間部位；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T DNA被拼接到受體細胞染色體的DNA上。
②第一次導入是將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌，第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T DNA導入受體細胞。
15.檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因的方法及原理是？核酸分子雜交的具體操作？
15.方法是采用 PCR技術（DNA半保留復制）或核酸分子雜交技術（堿基互補配對）——注意，首填PCR，因為是課本正文出現的。
用放射性同位素標記（或熒光標記）的目的基因作探針與受體細胞的染色體DNA進行雜交，如果顯示出雜交帶，表明目的基因已插入染色體DNA中
16.檢測目的基因是否轉錄出了mRNA，方法及原理是？核酸分子雜交的具體操作？
16.方法是采用PCR技術（DNA半保留復制）或核酸分子雜交技術（堿基互補配對）
用放射性同位素標記（或熒光標記）的目的基因作探針與受體細胞的mRNA雜交， 如果顯示出雜交帶，表明目的基因已轉錄
17. 檢測目的基因是否翻譯成蛋白質的方法及原理是？
17.方法是從轉基因生物中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原－抗體雜交。原理：抗體與抗原特異性結合
18.個體生物學水平在是否具有抗性及抗性程度方面如何鑒定？
18.①抗蟲棉：采摘抗蟲棉葉片飼喂棉鈴蟲 ②耐鹽水稻：用一定濃度的鹽水澆灌水稻
③抗除草劑植物：噴灑除草劑 ④抗病毒（菌）植物：病毒（菌）接種實驗
⑤轉基因產品：提取轉基因產品與天然產品的功能進行活性比較
19.構建基本表達載體時，若目的基因插入到啟動子的上游，則轉基因動物無法產生相應的外源蛋白，原因是？
19.目的基因不能轉錄。
20.經檢測,抗旱基因已經導入到煙草細胞,但未檢測出抗旱基因轉錄出的mRNA,從構建基因表達載體的角度推測,最可能的原因是？
20.基因表達載體上目的基因首端未加入啟動子
21.制備乳腺生物反應器生產藥物為什么要加乳腺蛋白質基因啟動子？
21.該啟動子能夠在乳腺組織中特異啟動目的基因的表達（只有加上乳腺上皮細胞中特異性表達的啟動子，才能保證藥用蛋白基因在山羊的乳腺細胞中表達）
22.構建基因表達載體時，科研人員選用了花椰菜花葉病毒CAMV35S啟動子修飾合成的微型人胰島素基因，達到驅動微型人胰島素基因表達的目的。試推測，修飾目的基因采用病毒啟動子的原因可能是？
22.病毒啟動子驅動微型人胰島素基因的表達不受核基因的調控
23.不同的限制酶切割可能產生相同的黏性末端，這在基因工程操作中有什么意義？
23.識別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶。同尾酶構建載體時，切割位點的選擇范圍擴大。例如，我們選擇了用某種限制酶切割載體，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有該限制酶的識別序列，那么用該限制酶切割含有目的基因的DNA片段時，目的基因就很可辦能被切斷；這時可以考慮用合適的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的識別序列）來或缺目的基因。
24.當真核生物的基因以原核生物作為受體細胞時：
①若無法獲得該蛋白，原因可能是什么？
①真核生物的基因有內含子，原核生物沒有真核生物所具有的切除內含子對應的RNA序列的機制，其初始轉錄產物中與內含子對應的RNA序列不能被切除，因此無法表達出該蛋白
②以上情況如何解決？
②使用cDNA作為目的基因或使用酵母菌等真核生物作為受體細胞
③若可以獲得該蛋白，但是蛋白質無活性，原因可能是？
③原核生物缺少高爾基體和內質網等細胞器，無法對真核生物的蛋白質進行正確的加工
④以上情況如何解決？
④人工體外再加工或使用酵母菌等真核生物作為受體細胞
第3、4節 基因工程的應用及蛋白質工程
1.基因工程菌的概念？用大腸桿菌生產人胰島素的流程是怎樣的？目前除了可以利用大腸桿菌生產人胰島素，還可以用酵母菌來生產人胰島素，請從細胞的結構與功能相適應的角度考慮，二者生產的人胰島素有何不同？
1.用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類稱為基因工程菌
①人胰島素基因的篩選和獲取：用RT-PCR（逆轉錄PCR）獲取人胰島素基因（cDNA）
②人胰島素基因表達載體的建構：用限制酶和DNA連接酶將人胰島素基因（要添加啟動子、終止子）與質粒拼接，構建基因表達載體；
③將人胰島素基因導入大腸桿菌細胞：用Ca+處理大腸桿菌，將重組質粒導入大腸桿菌；
④人胰島素基因的檢測與鑒定：檢測篩選出成功轉化的大腸桿菌
⑤進行發酵培養（菌種擴大培養、配置培養基、滅菌、接種、發酵、產物的分離和提純）
大腸桿菌是原核生物，沒有內質網和高爾基體，無法對合成的胰島素肽鏈進行加工，沒有生物活性；酵母菌是真核生物，有內質網和高爾基體，可以對合成的胰島素肽鏈進行一定的加工和修飾，有生物活性。
2.獲得乳腺生物反應器時，要將藥用蛋白基因和哪些調控組件重組在一起？乳腺生物反應器經過有性生殖產生的后代一定可以產生目標蛋白嗎？膀胱生物反應器哪些方面優于乳腺生物反應器？研制膀胱生物反應器時，應如何處理目的基因？
2.乳腺中特異表達的基因的啟動子等調控組件重組在一起
不一定
①目的基因在受體細胞中不是成對存在的，相當于雜合子，配子中可能不含該基因，則有性生殖產生的后代中可能不含目的基因②有性生殖產生的后代可能為雄性，不能分泌乳汁
不局限于性別與生長期（乳腺生物反應器必須是雌性，且泌乳期才會分泌）
將目的基因與膀胱上皮細胞中特異表達的基因的啟動子重組
3.為什么可以用豬的器官解決人類器官移植的來源問題？利用轉基因技術對豬的器官進行改造，培育不會引起免疫排斥反應的轉基因克隆豬器官，采用什么方法？
3.①豬的內臟構造、大小、血管分布與人的極為相似
②與靈長類動物相比，豬體內隱藏的、可導致人類疾病的病毒要少得多
在器官供體的基因組中導入某種調節因子，以抑制抗原決定基因的表達或設法除去抗原決定基因，然后再結合克隆技術，培育出不會引起免疫排斥反應的轉基因克隆豬器官。
4.由蛋白質工程的概念分析：基礎、手段和目的分別是什么？
4.基礎：蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系 手段：改造或合成基因
目的：改造現有蛋白質，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類生產和生活的需求
5.蛋白質工程的目標？直接操作對象？ 確定目的基因的堿基序列后，怎樣才能合成或改造目的基因？ 為什么蛋白質工程改造基因而不是直接改造蛋白質？
5.根據人們對蛋白質功能的“特定需要”，對蛋白質的結構進行分子設計改造 基因
確定目的基因的堿基序列后，可以人工合成目的基因，或應用基因定點突變技術來進行堿基的替換、增添等進而改造基因
①蛋白質的高級結構十分復雜，直接改造難度大；②蛋白質是由基因編碼的，改造了基因可以間接改造蛋白質；③基因可以遺傳，蛋白質無法遺傳
6.蛋白質工程的基本思路？
6.從預期的蛋白質功能出發→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質
7.設計試管嬰兒與試管嬰兒有什么區別？
7.植入前對胚胎進行遺傳學診斷
8.降低人對小鼠單抗了抗體的免疫反應的思路？
9.了解：人鼠嵌合抗體----蛋白質工程
為了克服鼠源性單克隆抗體存在的問題，科學家利用基因工程方法使小鼠的抗體人源化。通過構建人一鼠嵌合抗體，在一定程度上減弱了人抗鼠抗體。嵌合抗體指的是鼠單克隆抗體的恒定區基因被人抗體的恒定區基因通過基因重組技術所替換而編碼并在合適的宿主細胞中表達而產生的單克隆抗體。
基本原理:抗體分子的特異性識別、抗原結合由輕鏈和重鏈可變區決定的，而異源蛋白產生的人抗鼠抗體反應的主要是抗體恒定區。將小鼠單抗恒定區用人源化恒定區代替而拼接成嵌合抗體，使其重鏈和輕鏈的可變區來自小鼠，恒定區來自人類。簡言之嵌合抗體既具有抗原結合特異性，又大大地降低了鼠單抗的異源性。嵌合抗體是基因工程抗體最早研究出來的一種抗體，在腫瘤治療和診斷方法已被廣泛的應用。雖然嵌合抗體在一定程度上減弱了人抗鼠抗體反應，但仍存在一少部分鼠源成分。這直接導致抗體被迅速清除，從而降低治療效果。
10.總結
（一）PCR技術：
（1）名稱：多聚酶鏈式反應
（2）原理：DNA半保留復制
（3）過程：PCR由變性—復性--延伸三個基本反應步驟構成：會解釋三個步驟
①變性：加熱至90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈；
②復性：冷卻至50℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合；
③延伸：加熱至72℃左右，在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，溶液中的四種脫氧核苷酸加到引物的3’端，合成新的DNA鏈。
④重復循環變性—復性--延伸三過程就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
（4）PCR反應體系的成分
DNA模板：從樣本或細胞中提取的微量總DNA
原料∶ dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），提供原料和能量
酶∶ TaqDNA聚合酶（耐高溫的DNA聚合酶，從嗜熱菌中分離得到）
引物∶與目的DNA片段兩條母鏈各自的3’端序列互補
Mg2+：激活DNA聚合酶活性所必需
PCR緩沖液∶維持pH，保護TaqDNA聚合酶
（5）DNA在體內復制的條件
模板∶DNA分子的兩條鏈
原料、能量∶dATP、dGTP、dCTP、dTTP
酶∶ 解旋酶、DNA聚合酶等
引物∶RNA引物，溫和的反應條件
（6）與體內DNA分子復制的不同點：①酶不同； ②引物不同 ③溫度條件不同
（7）PCR技術可用于基因工程四個基本步驟中的：目的基因的篩選與獲取、目的基因的檢測與鑒定
（二）引物
（1）引物的作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸
（2）需要引物的原因：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3’端延伸DNA鏈，因此DNA的復制需要引物
（3）設計兩種引物的原因：基因的兩條反向平行鏈都做模板，其堿基序列不同，且DNA聚合酶只能從3’端延伸子鏈，用2種引物才能確保DNA兩條鏈同時被擴增
（4）需要大量引物的原因：子鏈是在引物的引導下合成的，引物隨子鏈DNA數量的增多而被消耗
需要引物的數量：（2n-1)×2，當擴增4次，共產生 16 個DNA時，消耗30 個引物。
（5）PCR擴增的產物的特異性：由引物的特異性決定；引物是根據目的基因兩端的核苷酸序列設計的
（6）兩引物間固定長度(等長)的DNA序列在PCR擴增3次后首先出現
（7）復制方向:是沿子鏈5’→3’，從引物的3’端延伸子鏈
（8）如果需要在引物上加限制酶的識別序列： 需要在引物的5’加
（9）在引物的5’端設計兩種限時酶識別序列的原因：便于目的基因和載體的定向正確連接
了解：引物的5'端可修飾，引物的5' 端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點，加標記熒光，引入啟動子序列等。
引物的3'端不可修飾；引物的延伸是從3'端開始的，不能進行任何修飾。
（10）如果引物中GC含量較高，可適當提高復性溫度
（11）設計引物時，引物自身不能有堿基互補配對的序列：避免引物自連，不能得到目的產物
（12）設計引物時，兩引物之間不能有堿基互補配對的序列：防止兩引物之間結合形成雙鏈，降低引物與DNA模板鏈結合的效率
（13）引物設計不能太短：防止非目的基因的獲得
（14）復性溫度過高，得不到產物的原因：引物不能穩定的與模板結合（引物與模板結合的穩定性遭到破壞）
例：進行擴增時，反應的溫度和時間需根據具體情況進行設定，下列選項中____的設定與引物有關，____的設定與擴增片段的長度有關。 ①變性溫度 ②復性溫度 ③延伸溫度 ④變性時間 ⑤退火時間 ⑥延伸時間
答案：② ⑥
（15）目前在PCR反應中使用TaqDNA聚合酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是_____________。
答案：TaqDNA聚合酶熱穩定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活
（16）為方便構建重組質粒，設計引物時需要增加適當的_________位點。設計引物時需要避免引物之間形成_______________________，而造成引物自連。(限制酶 堿基互補配對)
（17）為便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的_______端加上限制性酶切位點，且常在兩條引物上設計加入不同的限制性酶切位點，主要目的是___________________________。
（5' 使DNA片段能定向插入表達載體，減少自連）
（18）PCR后期，反應速率下降的原因：酶的活性降低、引物和dNTP濃度降低、反應產物增多
（19）變性溫度過低會導致雙鏈不能充分解開；
（20）退火溫度過高會導致引物不能充分與模板鏈結合，導致目標產物的量減少
（三）基因文庫的構建
（四）基因的選擇性表達
生物體內所有細胞（除哺乳動物成熟紅細胞外）均具有相同的基因，但是有的基因在所有細胞中都表達（如呼吸酶基因），但是有的基因只在特定細胞中選擇性表達（如胰島素基因在所有體細胞中均存在，所以所有細胞中的DNA均可與胰島素基因探針形成雜交帶。但是其僅在胰島B細胞中表達，所以只在胰島B細胞中能轉錄出相應的mRNA，因此只有胰島B細胞中的mRNA與胰島素基因探針形成雜交帶。）
（五）DNA片段的擴增及電泳鑒定
預變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合。
1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？
1.可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。進行電泳鑒定的結果應該是一條條帶，該片段大小約為750bp。
2.你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因。
2.如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當等。如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質量不好等。
3.留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物
總結：
1.不能出現擴增產物：
（1）引物自身有堿基互補配對的序列，導致引物自連
（2）復性溫度過高，引物不能穩定的與模板結合
（3）變性溫度過低會導致雙鏈不能充分解開；
（4）酶的活性降低 （5）Mg2+濃度過低
（6）模板DNA含有雜蛋白（抑制耐高溫的DNA聚合酶活性的雜蛋白）
2.出現非目的序列產物：（1）引物設計太短 （2）兩引物之間堿基互補配對 （3）復性溫度過低
選必3 第3章 基因工程 核心必備知識 達標驗收
課本P67—69，問題
1.艾弗里等人通過肺炎鏈球菌的轉化實驗，不僅證明了遺傳物質是DNA，還證明了什么？
2.科學家證明質粒可以作為基因工程的載體，構建重組DNA，導入受體細胞，使外源基因在原核細胞中成功表達，并實現了什么，至此基因工程問世？
3.基因工程的工具和工具酶分別是什么？
4.由基因工程的概念分析：操作環境？操作水平？目的？原理？優勢？其他名稱？
5.基因拼接的原理？外源基在受體細胞中表達的原理？
6.啟動子、起始密碼子、終止子、終止密碼子的比較
第1節 重組DNA技術的基本工具
1.限制酶的全稱？主要來源？在原核生物中的作用？
2.限制酶的作用特點？作用結果？ 作用的化學鍵？
3.限制酶不破壞自身DNA的原因是什么？
4. DNA連接酶的作用？分類及連接的末端？
5.DNA聚合酶和DNA連接酶有什么區別？
6.載體的種類？質粒的結構？
7.作為載體必須具備的條件？
8.（1）DNA粗提取與鑒定的原理？
（2）不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞的原因？
（3）研磨后過濾的方案是？
（4）①4℃冰箱放置幾分鐘的作用？②攪拌時應輕緩、并沿一個方向的原因？
（5）鑒定試劑
（6）提取和分離DNA用塑料離心管的原因是？
第2節 基因工程的基本操作程序
1.基因工程的4步？
2.目的基因是指？Bt基因來自于哪種菌？ Bt抗蟲蛋白如何造成害蟲死亡？Bt抗蟲蛋白為何不會引起人畜死亡？
3.獲取目的基因的方法？
4.基因文庫構建的方法？從人的基因組文庫中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細胞卻未得到蛋白A，原因是？
5. PCR的原理？條件？產物的鑒定方法
6.PCR的過程？用PCR可以擴增mRNA嗎？ 反轉錄的過程？
7.基因工程的核心步驟？構建基因表達載體的目的？為什么不直接把目的基因導入受體細胞，而要用載體？
8.基因表達載體的組成及每部分的作用？
9.目的基因與載體結合用到的限制酶有什么要求？切割后兩個DNA片段之間連接形成的產物？
10. 使用兩種切割后能產生不同黏性末端的限制酶切割目的基因和質粒的目的是什么？
11.在構建基因表達載體時，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的識別序列？為什么？
12.（1）轉化的概念？（2）常用的轉化方法？
13.（1）T-DNA的作用？（2）原核生物作為受體細胞的優勢是？（3）Ca2+ 處理法的過程？（4）花粉管通道法的操作是？
14.采用農桿菌轉化法導入目的基因時，為什么目的基因可以整合到染色體的DNA上 目的基因插入染色體DNA上的目的是什么？農桿菌轉化法中兩次拼接、兩次導入的辨析？
15.檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因的方法及原理是？核酸分子雜交的具體操作？
16.檢測目的基因是否轉錄出了mRNA，方法及原理是？核酸分子雜交的具體操作？
17. 檢測目的基因是否翻譯成蛋白質的方法及原理是？
18.個體生物學水平在是否具有抗性及抗性程度方面如何鑒定？
19.構建基本表達載體時，若目的基因插入到啟動子的上游，則轉基因動物無法產生相應的外源蛋白，原因是？
20.經檢測,抗旱基因已經導入到煙草細胞,但未檢測出抗旱基因轉錄出的mRNA,從構建基因表達載體的角度推測,最可能的原因是？
21.制備乳腺生物反應器生產藥物為什么要加乳腺蛋白質基因啟動子？
22.構建基因表達載體時，科研人員選用了花椰菜花葉病毒CAMV35S啟動子修飾合成的微型人胰島素基因，達到驅動微型人胰島素基因表達的目的。試推測，修飾目的基因采用病毒啟動子的原因可能是？
23.不同的限制酶切割可能產生相同的黏性末端，這在基因工程操作中有什么意義？
24.當真核生物的基因以原核生物作為受體細胞時：
①若無法獲得該蛋白，原因可能是什么？
②以上情況如何解決？
③若可以獲得該蛋白，但是蛋白質無活性，原因可能是？
④以上情況如何解決？
第3、4節 基因工程的應用及蛋白質工程
1.基因工程菌的概念？用大腸桿菌生產人胰島素的流程是怎樣的？目前除了可以利用大腸桿菌生產人胰島素，還可以用酵母菌來生產人胰島素，請從細胞的結構與功能相適應的角度考慮，二者生產的人胰島素有何不同？
2.獲得乳腺生物反應器時，要將藥用蛋白基因和哪些調控組件重組在一起？乳腺生物反應器經過有性生殖產生的后代一定可以產生目標蛋白嗎？膀胱生物反應器哪些方面優于乳腺生物反應器？研制膀胱生物反應器時，應如何處理目的基因？
3.為什么可以用豬的器官解決人類器官移植的來源問題？利用轉基因技術對豬的器官進行改造，培育不會引起免疫排斥反應的轉基因克隆豬器官，采用什么方法？
4.由蛋白質工程的概念分析：基礎、手段和目的分別是什么？
5.蛋白質工程的目標？直接操作對象？ 確定目的基因的堿基序列后，怎樣才能合成或改造目的基因？ 為什么蛋白質工程改造基因而不是直接改造蛋白質？
6.蛋白質工程的基本思路？
7.設計試管嬰兒與試管嬰兒有什么區別？
8.降低人對小鼠單抗了抗體的免疫反應的思路？

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