資源簡介

(共29張PPT)
第1節 重組DNA技術的基本工具
第3章基因工程
1944年
1950年
1953年
1958年
1961年
1967年
1944年，艾弗里（O. Avery, 1877-1955)等人通過肺炎鏈球菌的轉化實驗，不僅證明了遺傳物質是DNA,還證明了DNA可以在同種生物的不同個體之間轉移。
1950年，埃德曼（P.V.Edman,1916-1977)發明了一種測定氨基酸序列的方法。2年后，桑格（F.Sanger,1918-2013)首次完成了對胰島素氨基酸序列的測定。
1953年，沃森（J.D.Watson,1928-)和克里克（F.Crick,1916-2004)建立了DNA雙螺旋結構模型并提出了遺傳物質自我復制的假說。
1958年，梅塞爾森（M. Meselson, 1930-)和斯塔爾（F. W. Stahl,1929-)用實驗證明了DNA的半保留復制。隨后不久，克里克提出中心法則。
1961年，尼倫伯格（M. W. Nirenberg,
1927-2010)和馬太（J. H. Matthaei，1929一）破譯了第一個編碼氨基酸的密碼子。截至1966年，64個密碼子均被成功破譯。
1967年，科學家發現，在細菌擬核DNA之外的質粒有自我復制能力，并可以在細菌細胞間轉移。
基因工程的誕生和發展
1970年
20世紀70年代初
1972年
1973年
1977年
1982年
1970年，科學家在細菌中發現了第一個限制性內切核酸酶（簡稱限制酶）
20世紀70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉錄酶被相繼發現。這些發現為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創造了條件。
1972年，伯格（P.Berg,1926-)首先在體外進行了DNA改造的研究，成功地構建了第一個體外重組DNA分子。
1973年，科學家證明質粒可以作為基因工程的載體，構建重組DNA,導入受體細胞，使外源基因在原核細胞中成功表達，并實現物種間的基因交流。至此，基因工程正式問世。
1977年，桑格等科學家發明了DNA序列分析的方法，為基因序列圖的繪制提供了可能。此后，DNA合成儀的問世為體外合成DNA提供了方便。
1982年，第一個基因工程藥物－重組人胰島素被批準上市。基因工程藥物成為世界各國研究和投資開發的熱點。
1983年
1984年
1985年
1990年
21世紀以來
2013年
1983年，科學家采用農桿菌轉化法培育出世界上第一例轉基因煙草。此后，基因工程進入了迅速發展的階段。
1984年，我國科學家朱作言（1941-)領導的團隊培育出世界上第一條轉基因魚。
1985年，穆里斯（K. Mullis, 1944-2019)等人發明PCR,為獲取目的基因提供了有效手段。
1990年，人類基因組計劃啟動。2003年改計劃的測序任務順利完成
21世紀以來，科學家發明了多種高通量測序技術，可以實現低成本測定大量核酸序列，加速了人們對基因組序列的了解。
2013年，華人科學家張鋒（1982-)及其團隊首次報道利用最新的基因組編輯技術－CRISPR(成簇規律間隔短回文重復）技術編輯了哺乳動物基因組。該技術可以實現對特定基因的定點插入、敲除或替換。
本節聚焦
1.重組DNA技術所需的三種基本工具是什么？它們的作用分別是什么？
2.基因工程載體需要具備什么條件？
番木瓜容易受番木瓜環斑病毒的侵襲。當番木瓜被這種病毒感染后，產量會大大下降。科學家通過精心設計，用“分子工具”培育出了轉基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環斑病毒。DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。那么，科學家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？
從社會中來
（1）所用的分子工具：限制性內切核酸酶、DNA連接酶，載體。
（2）限制性內切核酸酶的特征：準確切割DNA分子，得到所需要的目的基因。
DNA連接酶的特征：能將目的基因連接到載體上。
載體的特征：能將目的基因導入受體細胞中。
一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”
1.限制酶的來源：主要是從原核生物中分離純化出來的
2.作用：識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開
3.作用部位：磷酸二酯鍵，限制酶只切割兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵
4.作用特點：
（1）具有專一性
①識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列
②切割特定序列中的特定位點
（2）可用于切割DNA獲取目的基因和切割載體
雙鏈DNA的結構和磷酸二酯鍵的位置示意圖
限制酶切割DNA分子產生兩種不同末端的示意圖
（箭頭表示酶的切割位置）
資料卡
（1)限制性內切核酸酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。
（2)區別限制酶的特異性和專一性：
①限制酶的特異性是指一種限制酶一般只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的位點切割DNA分子；
②限制酶的專一性是指其只能切割DNA,而不能作用于RNA、蛋白質等其他底物。不同種類的限制酶識別的序列和切割的位點不同，這與酶的專一性是一致的。
二、DNA連接酶——“分子縫合針”
2.DNA連接酶的作用：可以將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵
1.DNA連接酶的種類和特點
種類 E.coil DNA連接酶 T4 DNA連接酶
來源 大腸桿菌 T4噬菌體
特點 只能連接雙鏈DNA 片段互補的黏性末端 既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端的效率較低
思考：
切割后的兩條DNA鏈連接時為什么要對DNA連接酶進行選擇？
E·coil DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端連接起來，不能連接平末端。而T4DNA連接酶既可以連接黏性末端，又可以連接平末端，所以必須根據被限制酶切割后產生的末端進行選擇。
三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
1.載體的作用：
（1）作為運載工具，將目的基因導入受體細胞中
（2）在受體細胞內對目的基因進行大量復制
2.作為載體的必要條件：
（1）能在受體細胞中復制并穩定保存
（2）具有一個至多個限制酶切割位點
（3）帶有特殊的標記基因
（4）對受體細胞無害
（3）常用載體——質粒
①質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環狀雙鏈DNA分子。
②質粒DNA分子上有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段插入其中。
③質粒DNA分子上有特殊的標記基因，如四環素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，便于重組DNA分子的篩選。
④在基因工程操作中，真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上經過人工改造的。
大腸桿菌及質粒結構模式圖
常用載體的種類及用途
種類 用途
質粒 將外源基因導入大腸桿菌等受體細胞
λ噬菌體的衍生物 植物病毒 將外源基因導入植物細胞
動物病毒 將外源基因導入動物細胞
思考·討論 P73
1. 剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？
剪刀代表限制酶，透明膠條代表DNA連接酶。
2. 你制作的黏性末端的堿基能不能互相配對？如果不能，可能是什么原因造成的？
可能是剪切位點或連接位點的選擇不對（也可能是其他原因）。比如在書寫將要重組的兩個DNA分子時，一般要求有同一種限制酶的識別和切割位點，這樣切割后才會露出相同的黏性末端，否則黏性末端不同，堿基就無法配對。
3. 你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？
不能。真正的基因是有遺傳效應的DNA片段，且含有幾百至幾千個不等的堿基對。
四、DNA的粗提取與鑒定
1.提取DNA的基本思路：DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當的物理和化學方法對它們進行提取
2.DNA粗提取的原理
DNA不溶于酒精，某些蛋白質溶于酒精
DNA不溶于酒精，某些蛋白質溶于酒精
DNA不溶于酒精，某些蛋白質溶于酒精
初步分離DNA和蛋白質
溶解DNA
鑒定DNA
思考：
1.過濾時能否用濾布代替紗布？
2.如果研磨不充分會對實驗結果產生怎樣的影響？
不可以，因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提前的DNA量
研磨不充分，會使DNA分子不能從細胞核中釋放出來，從而使研磨液中的DNA含量減少，影響最終提取的DNA量
課堂練習
1.如圖所示限制性核酸內切酶切割某DNA的過程，從圖中可知，該限制性核酸內切酶能識別的堿基序列及切點是( )
A.CTTAAG，切點在C和T之間 B.CTTAAC，切點在G和A之間
C.GAATTC，切點在G和A之間 D.CTTAAG，切點在C和T之間
C
2.下列關于基因工程的有關敘述，正確的是( )
A.基因工程常用的工具酶是限制酶、DNA連接酶、載體
B.一種限制酶能識別幾種特定的核苷酸序列，并在特定的切點上切割DNA
C.質粒是一種常用載體，是擬核或細胞核外能自主復制的很小的環狀DNA分子
D.DNA連接酶可代替DNA聚合酶用于DNA的復制
3.以下關于基因工程操作工具的敘述，正確的是( )
A.DNA連接酶能夠催化核糖核苷酸之間形成磷酸二酯鍵
B.限制酶能識別并切割DNA分子內一段特定的核苷酸序列
C.質粒一般具有復制原點、酶切位點和抗生素合成基因等
D.DNA聚合酶可將目的基因和載體連接形成重組DNA
C
B
4.某線性DNA分子含有5000個堿基對（bp），先用限制酶a切割，再把得到的產物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的識別序列和切割位點如圖所示。下列敘述錯誤的是( )
酶a切割產物（bp） 酶b再次切割產物（bp）
2100；1400；1000；500 1900；200；800；600；1000；500
A.酶a與酶b切斷的化學鍵相同
B.酶a與酶b切出的黏性末端能相互連接
C.酶a與酶b在該DNA分子上的切割位點數分別為3個和5個
D.限制酶將1個DNA分子片段切成2個片段需消耗2個水分子
C
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