資源簡(jiǎn)介

基因工程和植物克隆知識(shí)點(diǎn)總結(jié)
專題一基因工程:
1、基因工程的概念:基因工程是狹義的遺傳工程:指按照人們的愿望，將某種生物的目的基因，通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，移到另一種生物的細(xì)胞中，并使基因所攜帶的遺傳信息在受體細(xì)胞中表達(dá)，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型用生物產(chǎn)品的技術(shù)。
(1)基因工程操作水平是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，又叫做重組DNA技術(shù)。
(2)基因工程技術(shù)的變異原理:基因重組
基本原理是讓人們感興趣的基因(即目的基因)在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定和高效地表達(dá)；可以定向改變生物的性狀， 培養(yǎng)人們需要的生物品種。
★(3)基因工程的核心:構(gòu)建重組DNA分子
2、基因工程誕生的理論基礎(chǔ): DNA是生物遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的確立以及遺傳信息傳遞方式的認(rèn)定。
3、基因工程創(chuàng)建的技術(shù)保障:限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和質(zhì)粒載體的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用。
4、基因分離和重組的必要手段是:限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶
★5、不同DNA分子可以連接的原因是不同生物的DNA分子都是雙螺旋結(jié)構(gòu)。受體細(xì)胞中目的基因可以表達(dá)的原因是不同生物共用一套遺傳密碼子。
6、 基因工程的基本工具——限制性核酸內(nèi)切酶、DNA 連接酶和載體(或運(yùn)載體)
★基因工程的基本上工具酶——限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶， 注意一定不能答載體
(1)“分子手術(shù)刀” ——限制性核酸內(nèi)切酶
①來(lái)源:主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的。
②功能:能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)，因此具有專一性。
⑧結(jié)果:將DNA分子切割成片段，頂端具有粘性末端或平末端（回文結(jié)構(gòu)特點(diǎn))
④注意:不切割細(xì)菌自身細(xì)胞內(nèi)的DNA序列(沒(méi)有相應(yīng)序列)，不切割單鏈RNA序列。
(2)”分子“縫合針”——DNA連接酶
①作用:將具有末端堿基互補(bǔ)的2個(gè)DNA片段連按在一起，即將外源基因和載體DNA連接在一起，稱為重組DNA分子，作用的化學(xué)鍵是縫合磷酸二酯鍵。
②與DNA聚合酶作用的異同:DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接兩個(gè)DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵。
(3)“分子運(yùn)輸車”——載體
1.載體具備的條件:①能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。
②具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，供外源DNA片段插入。
③具有標(biāo)記基因， 供重組DNA的鑒定和選擇。
④大小合適，具有一定的安全性，對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)傷害。
2.最常用的載體是質(zhì)粒，它是一種能夠自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，是一種遺傳物質(zhì)，獨(dú)立于擬核(或細(xì)胞核)之外，裸露(即不與蛋白質(zhì)結(jié)合)。
③其它載體: λ 噬菌體、動(dòng)植物病毒，質(zhì)粒和噬菌體主要載入大腸桿菌等，動(dòng)植物病毒載入動(dòng)物或植
物細(xì)胞內(nèi)。
④在進(jìn)行基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的。
★注意:標(biāo)記基因通常用抗生素抗性基因或熒光蛋白質(zhì)基因
7、基因工程的基本操作程序:獲得目的基因，形成重組DNA分子(核心關(guān)鍵) ;將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，目的基因的表達(dá)。
第一步:獲得目的基因—— 一般需要限制性核酸內(nèi)切酶在目的基因兩側(cè)切取
★獲取目的基因的方法: (1) 如果目的基因序列已知可以用化學(xué)方法合成目的基因或用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的基因;
(2)如果目的基因序列未知可以建立一個(gè)包括目的基因在內(nèi)的基因文庫(kù)，從基因文庫(kù)中獲取(此方法不一定需要限制性核酸內(nèi)切酶)。
第二步:形成重組DNA分子: (1) 目的:使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
(2)需要的工具:通常用相同的限制性核酸內(nèi)切酶分別切割目的基因和載體DNA(如質(zhì)粒)，可以形成相同的粘性末端。再用DNA連接酶將目的基因和載體DNA連接在一起，形成重組DNA分子。
注意:限制性核酸內(nèi)切酶的選擇是常考點(diǎn):原則是不損壞目的基因和標(biāo)記基因(至少保留一個(gè)) ，為了防止任意連接，盡量用兩種限制酶分別切割目的基因和載體DNA。
(3)重組DNA分子組成:至少有目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因，有時(shí)還考慮復(fù)制原點(diǎn)。
①啟動(dòng)子又稱為啟動(dòng)部位:是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，屬于基因的一部分，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。
化學(xué)合成方法，如逆轉(zhuǎn)錄法合成的基因沒(méi)有啟動(dòng)子和終止子結(jié)構(gòu)，需要在載體中加入。
②終止子:也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端，轉(zhuǎn)錄停止的信號(hào)。
③標(biāo)記基因的作用:是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有重組DNA分子，主要是含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。常用的標(biāo)記基因是抗生素抗性基因。
第三步:將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞
(1)轉(zhuǎn)化的概念:將目的基因與載體連接后，導(dǎo)入特定的受體細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程(并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程)。目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)可以隨重組載體復(fù)制出大量的目的基因。
(2)常用的導(dǎo)入(或轉(zhuǎn)化)方法:
①將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞:采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(主要適用于雙子葉植物和裸子植物)，其次還有基因槍法和花粉管通道法等。
②將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞:最常用的方法是顯微注射技術(shù)。此方法的受體細(xì)胞多是受精卵。
③將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞:原核生物作為受體細(xì)胞的原因是繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少，最常用的原核細(xì)胞是大腸桿菌，其轉(zhuǎn)化方法是:先用Ca2+ (氯化鈣)處理細(xì)胞， 增加大腸桿菌細(xì)胞壁的通透性使其成為感受態(tài)細(xì)胞，再將重組表達(dá)載體DNA分子和感受態(tài)細(xì)胞溶于緩沖液中混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收 DNA分子、完成轉(zhuǎn)化過(guò)程
第四步:篩選含有目的基因的受體細(xì)胞:原因:有的細(xì)胞沒(méi)有接納重組DNA分子(一般較多)。重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有重組DNA分子的受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)。
第五步:目的基因的檢測(cè)和表達(dá)
(1)首先檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術(shù)。
基因探針:是指用放射性同位素或熒光分子等標(biāo)記的已知DNA分子單鏈。
(2)其次檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,方法是采用用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交。
(3)最后檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)(一般作為抗原)，
用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交(此方法用蛋白質(zhì)的特定空間結(jié)構(gòu)結(jié)合，不是堿基互補(bǔ)配對(duì))。
(4)有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物是否出現(xiàn)抗蟲(chóng)性狀，進(jìn)行抗蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)。
8、基因工程的應(yīng)用
(1) .轉(zhuǎn)基因植物——植物基因工程:抗蟲(chóng)、抗病、抗逆轉(zhuǎn)基因植物，利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)。
①抗蟲(chóng)棉，抗鹽堿地的農(nóng)作物，耐寒的番茄，抗除草劑的玉米，富含賴氨酸的轉(zhuǎn)基因玉米，改變花卉的花色等。 ②優(yōu)點(diǎn): 與傳統(tǒng)育種相比，培育新品種所需時(shí)間較短，克服了遠(yuǎn)緣親本難以雜交的障礙。
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法:利用農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒中的T-DNA分子可以整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上的特性，將目的基因插入Ti質(zhì)粒中的T-DNA分子中間—>農(nóng)桿菌( 氯化鈣處理)—>侵染植物細(xì)胞-→T-DNA攜帶目的基因整合到植物細(xì)胞的染色體DNA上。
(2).轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一動(dòng)物基因工程: 提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)、用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物。
①如導(dǎo)入人的生長(zhǎng)激素基因的鯉魚(yú)，比一般的鯉魚(yú)長(zhǎng)的快且大。
②用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物:乳腺生物反應(yīng)器(乳房生物反應(yīng)器)
③轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作器官移植的供體:最大的難題是解決免疫排斥問(wèn)題
如:利用基因工程技術(shù)，使哺乳動(dòng)物本身變成“批量生產(chǎn)藥物的工廠”
大概過(guò)程:目的基因(蛋白基因+乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子)→顯微注射法導(dǎo)入哺乳動(dòng)物受精卵 —>培養(yǎng)成早期胚胎—>移植到母體子宮內(nèi)孕育—>分娩出產(chǎn)生藥品蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(一 定是雌性動(dòng)物)
(3)基因工程藥物蛋白質(zhì)類藥品制劑
①胰島素:是一種蛋白質(zhì)類激素，存在于人和動(dòng)物的胰臟中。方法一般是:從人的胰島β細(xì)胞中提取mRNA—>逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單鏈DNA—>雙鏈DNA—>與載體結(jié)合—>重組DNA分子—>氯化鈣處理大腸桿菌—>篩選含有目的基因的大腸桿菌生產(chǎn)胰島素原(沒(méi)有生物活性)—>人工加工得到成熟的胰島素。
②干擾素:是病毒侵入細(xì)胞后產(chǎn)生的糖蛋白，它有α、β和γ三大類型。具有抗病毒、抗細(xì)胞分裂和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，是治療病毒性肝炎和腫瘤的藥物。a-干擾素是我國(guó)第一個(gè)基因重組新藥。
③乙型肝炎疫苗:用乙型肝炎病毒的抗原基因作為目的基因，導(dǎo)入酵母菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)抗原。
(4)基因治療:是向目標(biāo)細(xì)胞(有基因缺陷的細(xì)胞)中引入正常功能的基因，以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷(注意沒(méi)有替換掉有缺陷的基因)。正常功能基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達(dá)到治療病癥的目的，這是治療遺傳病的最有效的手段。
基因治療包括:體外基因治療(多數(shù))和體內(nèi)基因治療。
補(bǔ)充:基因診斷:是指用基因探針，利用DNA分子雜交原理，鑒定被檢測(cè)樣本上的遺傳信息，從而達(dá)到檢測(cè)病癥的目的，如鐮刀形貧血癥，苯丙酮尿癥，癌癥等。
(5)基因工程與生態(tài)環(huán)境保護(hù)
工程菌:用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表達(dá)的菌類細(xì)胞株系一般稱為工程菌。
①利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)聚羥基烷酯，用于合成可降解的新型塑料。
②改造分解石油的細(xì)菌，提高其分解石油的能力。如超級(jí)細(xì)菌
③利用轉(zhuǎn)基因微生物吸收環(huán)境中的重金屬，降解有毒化合物和處理工業(yè)廢水。
解決方案選擇:其原則是可行性和簡(jiǎn)便性。
(6)蛋白質(zhì)工程:利用基因工程技術(shù)對(duì)天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，以便獲得具有理想生物學(xué)功能的蛋自質(zhì)(自然界沒(méi)有的蛋白質(zhì)種類)。
★專顆二 克隆技術(shù)
1、無(wú)性繁殖的優(yōu)點(diǎn):保持親本的遺傳性狀;一次產(chǎn)生后代的數(shù)量很大，可以迅速擴(kuò)大其種群的數(shù)量。
2、克隆即無(wú)性繁殖指只由一個(gè)模板分子、母細(xì)胞或母體直接形成新一代分子、細(xì)胞或個(gè)體。
克隆技術(shù)是指從眾多的基因或細(xì)胞群體中通過(guò)無(wú)性繁殖和選擇獲得且的基因或特定類型細(xì)胞的操作技術(shù)。
3、基因克隆和細(xì)胞克隆是現(xiàn)代生物技術(shù)中的關(guān)鍵技術(shù)，在基礎(chǔ)科研、遺傳育種和腫瘤生物治療等方面廣泛應(yīng)用。
4、將重組DNA分子導(dǎo)入特定的宿主細(xì)胞的導(dǎo)入過(guò)程叫轉(zhuǎn)化。在被轉(zhuǎn)化的宿生細(xì)胞中可以隨著重組載體復(fù)制出大量的目的基因。
5、胚胎細(xì)胞克隆不屬于嚴(yán)格意義上的動(dòng)物個(gè)體克隆。
6、克隆的基本條件:細(xì)胞具有的發(fā)育全能性是生物克隆的基本條件。具體描述為以下3條
(1)具有含物種完整基因組細(xì)胞核的活細(xì)胞(如乳腺上皮細(xì)胞)。
(2)能有效調(diào)控細(xì)胞核發(fā)育的細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)(如去核的卵細(xì)胞質(zhì))。(3)完成胚胎發(fā)育的必要環(huán)境條件(如誘導(dǎo)核—質(zhì)重組細(xì)胞生長(zhǎng)分化的實(shí)驗(yàn)條件和懷胎母體的子宮環(huán)境)。
7、植物克隆技術(shù)的基礎(chǔ)是植物組織培養(yǎng)。理論基礎(chǔ)(原理) :植物細(xì)胞具有全能性
8、植物細(xì)胞的全能性
(1)由于不同種植物，不同基因型的同種植物個(gè)體間遺傳性的差異，細(xì)胞全能性表達(dá)程度不同。擬南芥、煙草和番茄等容易再生新植株，而小麥、玉米和水稻等作物在多次繼代培養(yǎng)后，會(huì)喪失細(xì)胞全能性表達(dá)能力。
(2)全能性最強(qiáng)的細(xì)胞是受精卵。
(3)長(zhǎng)期培養(yǎng)中培養(yǎng)植物胚胎發(fā)生和器官形成能力下降，可能是因?yàn)?br/>①遺傳物質(zhì)改變，如染色體畸變、細(xì)胞核變異或非整倍體的產(chǎn)生等。
②是細(xì)胞或組織中的激素平衡平衡被打破，或細(xì)胞對(duì)外源生長(zhǎng)物質(zhì)的敏感性下降。
③是因?yàn)楫a(chǎn)生了缺乏成胚性的細(xì)胞系。
(4)在生物的生長(zhǎng)發(fā)有過(guò)程中，細(xì)胞并不會(huì)表現(xiàn)出全能性，原因是基因在特定的時(shí)間和空間條件下進(jìn)行選擇性表達(dá)，使得細(xì)胞進(jìn)行分化形成不同的組織或器官。
9、植物組織培養(yǎng)技術(shù)
(1)程序:配置含有適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的含0. 7% —1%瓊脂的培養(yǎng)基—>切取小組織塊 (外植體)—>獲得愈傷組織—>生出新植株；
歸納為兩個(gè)生理過(guò)程:脫分化(避光)和再分化(需光照每天14.5小時(shí)，葉綠素合成需要光照)
★(2)成功的條件:離體培養(yǎng)；無(wú)菌操作(培養(yǎng)和多種操作工具進(jìn)行高壓蒸汽滅菌法滅菌，外植體消毒)；適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(或植物激素) ;適宜的環(huán)境條件(如光照和溫度)。
(3)愈傷組織:未分化，細(xì)胞排列疏松而無(wú)規(guī)則，高度液泡化(即液泡小，數(shù)量多)，呈無(wú)定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞團(tuán)。形成愈傷組織是需要?jiǎng)?chuàng)傷的刺激和植物激素的調(diào)節(jié)。
★愈傷組織經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)可分散得到單個(gè)細(xì)胞，這些細(xì)胞具有細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核大,液泡體積小的胚性細(xì)胞的特點(diǎn)。需要放在搖床上進(jìn)行震蕩，作用是增加液體溶氧量，使細(xì)胞體系分布均勻，有利于物質(zhì)傳遞。愈傷組織再分化的產(chǎn)物:
①給子適宜條件，有的植物可以直接發(fā)育成根、芽、花(如風(fēng)信子)器官等，即器官培養(yǎng)。雄性花器官的培養(yǎng)成果顯著，如子房的培養(yǎng)、胚囊的培養(yǎng)均已經(jīng)取得進(jìn)展。
②給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基中成分的誘導(dǎo)，可分化出芽和根的分生組織，再發(fā)育成完整植株。
★③愈傷組織分散為單個(gè)的胚性細(xì)胞，再依次到細(xì)胞團(tuán)—>球形胚—>心形胚—>胚狀體， 再發(fā)育成完整植株。
實(shí)現(xiàn)植物器官發(fā)生和形態(tài)建成，主要通過(guò)平衡植物激素配比進(jìn)行，也有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的配比。
(4)地位：是植物克隆的技術(shù)基礎(chǔ)。
10、原生質(zhì)體——細(xì)胞內(nèi)有代謝活性的原生質(zhì)部分，包括質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。”
1制備方法:在0.5-0.6mol/L 的甘露醇溶液環(huán)境(維持較高滲透壓，防止原生質(zhì)體吸水脹破)下，
用纖維素酶和果膠酶(即酶解法)混合液處理離體的根尖，葉片、愈傷組織成懸浮培養(yǎng)細(xì)胞等，消化除去細(xì)胞壁，獲得球形的原生質(zhì)體。
(2)原生質(zhì)體的應(yīng)用:①進(jìn)行植物體細(xì)胞雜交技術(shù):即用兩種不同種植物原生質(zhì)體進(jìn)行誘導(dǎo)(方法:電刺激或聚乙二醇誘導(dǎo))融合—>雜種細(xì)胞(或重組細(xì)胞)—>培養(yǎng)生出新細(xì)胞壁(成功標(biāo)志)→培養(yǎng)成愈傷組織—>胚狀體—>新植株。
②轉(zhuǎn)基因植物: 借助基因工程方法，將外源遺傳物質(zhì) (DNA)導(dǎo)入受體細(xì)胞(包括原生質(zhì)體受體)中，或通過(guò)細(xì)胞融合、顯微注射等將不同來(lái)源的遺傳物質(zhì)重新組合，再通過(guò)對(duì)這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或重組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，獲得具有特定性狀的新植株。——植物細(xì)胞工程技術(shù)
③實(shí)例:使抗蟲(chóng)害、抗干旱、抗鹽堿、抗低溫和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)作物新品種的培育進(jìn)入廠新高潮。原生質(zhì)體的培養(yǎng)結(jié)合基因工程操作，也為許多遺傳學(xué)，植物生理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)問(wèn)題提供了良好的研究系統(tǒng)。
11、多途徑的植物克隆實(shí)踐
(1)、轉(zhuǎn)基因植株:將外源遺傳物質(zhì)(DNA) 導(dǎo)入宿主細(xì)胞，培育出抗逆、高產(chǎn)及優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植株。
(2)植物細(xì)胞培養(yǎng)的其他多種研究和應(yīng)用廣泛開(kāi)展:例如

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