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第2節
基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個步驟？
基因工程操作的每一步涉及的技術和方法有哪些？
本節聚焦
1
2
1997年，我國政府首次批準商業化種植轉基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉基因抗蟲棉品種100多個，減少農藥用量40萬噸，增收節支社會經濟效益450億元。你知道轉基因抗蟲棉的機制是什么嗎？培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？
【從社會中來】
轉基因抗蟲棉與普通棉花
提示：蘇云金桿菌通過產生蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統來殺死棉鈴蟲，將該細菌的“殺蟲基因”轉到棉花里，讓棉花也能產生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。
Bt抗蟲蛋白基因、簡稱Bt基因
蘇云金桿菌
與載體拼接
棉花細胞
抗蟲棉
提取
表達Bt基因
導入
Bt基因
重組DNA分子
培育轉基因抗蟲棉的簡要過程
1.目的基因的篩選與獲取
2.基因表達載體的構建
3.將目的基因導入受體細胞
4.目的基因的 檢測與鑒定
【從社會中來】
基因工程的一般操作程序主要包括四個步驟：目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。
基因工程的基本操作程序
目的基因的篩選與獲取
基因表達載體的構建
將目的基因導入受體細胞
目的基因的檢測與鑒定
前提
核心
關鍵
保證
4 3 2 1
目 錄
目的基因的篩選與獲取
基因表達載體的構建
將目的基因導入受體細胞
目的基因的檢測與鑒定
定義：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預
期表達產物等的基因。
根據不同的需要，目的基因不同，主要是指編碼蛋白質的基因。
如：與生物抗逆性、優良品質、生產藥物、毒物降解和工業用酶等相關的基因。
資料：蘇云金桿菌通過產生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統來殺死棉鈴蟲。
科學家將“殺蟲基因”轉入棉花中，棉花產生Bt 抗蟲蛋白抵抗蟲害。
目的基因
1.目的基因
第一步 目的基因的篩選與獲取
從相關的已知結構和功能清晰的基因中篩選目的基因
科學家已經明確Bt基因的序列信息，也對Bt抗蟲蛋白有深入了解
隨著測序技術的發展，以及序列數據庫（如GenBank）、序列比對工具（如BLAST）等的應用，越來越多的基因的結構和功能為人們所知。
2.篩選合適的目的基因
第一步 目的基因的篩選與獲取
（1）常用PCR特異性地快速擴增目的基因。
發明者：穆里斯；
PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫；
PCR的含義：依據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。
（2）還可以通過構建基因文庫來獲取目的基因。
（3）人工合成目的基因
3. 獲取目的基因的方法
第一步 目的基因的篩選與獲取
將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，結合質粒導入受體菌群體中儲存，這個受體菌群就是該生物的基因文庫。
3. 獲取目的基因的方法
（2）還可以通過構建基因文庫來獲取目的基因。
基因組文庫
cDNA文庫
某生物體內全部DNA
限制酶
與載體 連接導入
許多DNA片段
受體菌群體
某生物某時期的mRNA
逆轉錄等
與載體 連接導入
cDNA（互補DNA）
受體菌群體
在明確目的基因堿基序列的基礎上，利用DNA合成儀自動化合成所需的DNA片段。
☆僅適用于較短的DNA，如：PCR引物、基因探針。
3. 獲取目的基因的方法
（3）人工合成目的基因
3′
5′
DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有鏈的3′-端，即子鏈的延伸方向是5 ′→3 ′。
由于DNA聚合酶不能將單個的核苷酸連接成鏈，因此子鏈合成需要引物（一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸）。
DNA聚合酶
3′
5′
模板鏈
體內DNA復制參與的組分 在DNA復制中的作用 PCR中參與的組分
打開DNA雙鏈
提供DNA復制的模板
合成子鏈的原料
催化合成DNA子鏈
使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸
說明：PCR所用原料實為dNTP，dNTP和ATP類似，可通過基團轉移為反應提供能量。
解旋酶
DNA母鏈
4種脫氧核苷酸
DNA聚合酶
引物（通常為小的單鏈RNA）
無需解旋酶，用高溫代替
DNA母鏈
4種脫氧核苷酸
耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
引物
（通常為小的單鏈DNA）
反應還需要其它條件，如緩沖溶液、Mg2+（激活DNA聚合酶）
4.利用PCR獲取和擴增目的基因
dNTP的作用：既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。
4種脫氧核苷酸
(實質是4種脫氧核苷三磷酸dNTP)
原料：
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
1）變性：
當溫度上升到_______以上時， 斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條 。
氫鍵
單鏈DNA
待擴增的DNA片段
第一步：變性
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
變性
90℃
思考：變性的溫度為何是90℃以上的一個溫度范圍，而不是95℃？
因為變性的溫度與氫鍵的數量有關。當氫鍵數量越多時，所需溫度就越高；反之，當氫鍵數量越少時，所需溫度也就越低。
擴增過程：
2）復性：
當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通 過 與兩條單鏈DNA結合。
第二步：復性
引物1
引物2
DNA引物
3’
5’
3’
5’
堿基互補配對
5’
5’
思考：什么是引物？為什么需要引物？引物結合在模板鏈的什么位置？
①引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。
②因為Taq酶不能從0開始添加核苷酸。
③引物結合在DNA模板鏈 3'端位置，引導子鏈從 5'端→3'端方向復制。
3’
3’
3）延伸：
當溫度上升到______左右時，溶液中的4種____________在耐高溫的____________的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。
第三步：延伸
引物1
引物2
Taq酶
Taq酶
3’
5’
3’
5’
脫氧核苷酸
5’
5’
DNA聚合酶
72℃
3’
3’
3’
3’
思考1：為什么溫度要上升至72℃？
思考2：Taq酶結合在引物的3’還是5’端？
72℃是Taq酶的最適溫度
Taq酶結合在引物的3’端
A
G
C
T
待擴增的DNA片段
4種脫氧核苷酸
引物
耐高溫的DNA聚合酶
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
變性
溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈
復性
溫度降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合
延伸
溫度升至72℃左右，溶液中4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶作用下合成新的DNA鏈
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
3′
第一輪循環的產物作為第二輪反應的模板，經過變性、復性和延伸三步產生第二輪循環的產物。
第二輪循環的產物作為第三輪反應的模板，經過變性、復性和延伸三步產生第三輪循環的產物。
受熱變性
引物
耐高溫的
DNA聚合酶
（2）過程：
PCR小結
4.利用PCR獲取和擴增目的基因
（1）條件：
緩沖溶液、DNA模板、與兩條模板鏈結合的2種引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶。
（3）結果：1個模板DNA分子經過n輪循環，以_____形式擴增，可以擴增出 個DNA片段。　　　　
指數
2n
PCR小結
（4）儀器：　　　
PCR擴增儀（PCR儀）
（5）鑒定PCR產物的方法：　　　
瓊脂糖凝膠電泳
4.利用PCR獲取和擴增目的基因
100bp
200bp
300bp
400bp
500bp
600bp
700bp
800bp
1,200bp
1,000bp
900bp
標準
樣品1
樣品2
樣品3
較小的DNA片段在凝膠中移動相對容易，較大的DNA片段移動難。當電泳結束時，比較DNA樣品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置（標準），這些已知大小的片段稱為DNA分子量標準樣。
深入思考：用PCR可以擴增mRNA嗎？
mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉錄成cDNA在進行擴增。
由mRNA逆轉錄形成cDNA的過程是：
第一步，逆轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；
第二步，核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；
第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。
PCR反應過程視頻講解
重難點：利用PCR獲得和擴增目的基因
【素養提升①】獲得所需的目的基因：
一
5'
3'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
目的片段
第一輪
【思考】第幾輪PCR循環結束時，可出現兩條單鏈等長的目的片段？
5'
3'
5'
3'
引物A
3'
5'
5'
3'
引物B
目的片段
1.若兩條引物均從DNA分子端部結合，
則第 輪PCR循環結束時出現兩條單鏈等長的目的片段。
重難點：利用PCR獲得和擴增目的基因
【素養提升①】獲得所需的目的基因：
2.若一條引物從DNA分子端部結合，另一條引物從DNA分子中間部位結合，
則第 輪PCR循環結束時出現兩條單鏈等長的目的片段。
5'
3'
5'
3'
引物A
3'
5'
5'
3'
引物B
目的片段
第一輪
第二輪
目的片段
5'
3'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
二
5'
3'
5'
3'
5'
3'
目的片段
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
長鏈-中長鏈DNA____個
含有引物A的DNA____個
含有引物B的DNA____個
2
1
1
引物A
引物B
擴增一次
重難點：利用PCR獲得和擴增目的基因
【素養提升①】獲得所需的目的基因：
3.若兩條引物均從DNA分子中間部位結合時，
則第 輪PCR循環結束時出現兩條單鏈等長的目的片段。
中長鏈-短鏈DNA____個
2
長鏈-中長鏈DNA____個
含有引物A的DNA____個
含有引物B的DNA____個
2
3
3
擴增兩次
中長鏈-短鏈DNA____個
4
長鏈-中長鏈DNA____個
含有引物A的DNA____個
含有引物B的DNA____個
2
7
7
短鏈-短鏈DNA______個
2
出現完整的目的基因
擴增三次
中長鏈-短鏈DNA____個
長鏈-中長鏈DNA____個
含有引物A的DNA____個
含有引物B的DNA____個
短鏈-短鏈DNA______個
擴增四次
2
8
15
15
6
擴增次數 1次 2次 3次 4次 n次
DNA總數 21 22 23 24 2n
長鏈-中長鏈DNA
中長鏈-短鏈DNA
短鏈-短鏈DNA
含引物A(或B) 的DNA
2
0
0
2
2
2
4
0
2
2
6
8
2
2n-2
2n-2n
1
3
7
15
2n-1
長鏈條數：始終是最初DNA分子的兩條鏈。
中鏈條數：始終是最初DNA分子的兩條長鏈為模板形成的，并且每復制一次，新形成的中鏈增加兩條。
短鏈條數：所有的DNA分子中，除長鏈和中鏈外，余下的即為短鏈。
復制過程中共需引物_______對
2n-1
一個DNA，一對引物（A與B），通過PCR擴增n次：
①子代DNA分子中等長鏈DNA分子數為：______個
②子代DNA分子中不等長鏈DNA分子數為：_______個
③子代DNA分子中含模板鏈DNA分子數為：_______個
④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子數為：______個
⑤復制過程中共需引物________個
⑥第n次復制需要引物_________個
2n-2n
2n
2
2n-1
2n＋1 - 2
2n
PCR擴增DNA規律
重難點：利用PCR獲得和擴增目的基因
【素養提升②】引物的設計：
1．PCR擴增的 (填“是”或“不是”)
完整的模板DNA分子，
理由是 。
2．如果已知某目的基因的序列和結構，利用PCR篩選和擴增出該目的基因的關鍵是 。
3.要保證目的基因能與載體相連接，要在兩種引物的 分別
添加上 。
不是
PCR擴增的僅僅是兩種引物之間所對應的特定DNA片段
根據目的基因兩端（ ′端）的核苷酸序列設計引物
5′端
限制酶的識別序列
3
重難點：利用PCR獲得和擴增目的基因
【素養提升③】引物的設計：
4.圖2是某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理，
第1組不合理的原因： 。
第2組不合理的原因： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ會因局部發生堿基互補配對而失效
引物Ⅰ′自身折疊后會因出現局部堿基互補配對而失效
設計引物的原則：
①兩種引物之間:
；
②每種引物內部:
；
不能在局部發生堿基互補配對
不能在局部發生堿基互補配對
1．PCR是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術，與人體細胞內DNA分子復制相比，下列有關敘述錯誤的是（ ）
A．都遵循堿基互補配對原則
B．DNA聚合酶作用的最適溫度不同
C．都是邊解旋邊復制的過程
D．復制方式都是半保留復制
C
獲取了足夠量的目的基因后，能直接把目的基因導入受體細胞嗎？
就算可以進行轉錄和翻譯成蛋白質，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂進行復制，導致子代細胞不再含有目的基因
游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解
不能原因
4 3 2 1
目 錄
目的基因的篩選與獲取
基因表達載體的構建
將目的基因導入受體細胞
目的基因的檢測與鑒定
第二步 基因表達載體的構建
1.目的
2.基因表達載體的組成
☆基因表達載體的構建是基因工程的核心工作
（1）讓目的基因在受體細胞中穩定存在，并遺傳給下一代；
（2）使目的基因能夠表達和發揮作用。
U
A
A
G
U
C
C
C
T
T
G
G
A
A
A
游離的核糖核苷酸
RNA聚合酶
mRNA
DNA
1. 解旋
RNA聚合酶與編碼蛋白質的一段DNA結合，使DNA雙鏈解開，堿基暴露出來。
游離的核糖核苷酸與DNA模板鏈上的堿基互補配對，在RNA聚合酶的作用下開始mRNA的合成。
新結合的核糖核苷酸連接到正在合成的mRNA分子上。
4. 釋放
3. 連接
2. 配對
合成的mRNA從DNA鏈上釋放。而后，DNA雙螺旋恢復。
真核生物基因的結構
RNA聚合酶識別和結合位點
結束轉錄
mRNA
目的基因
標記基因
啟動子：
終止子：
復制原點
是一段有特殊序列結構的DNA片段，位于基因的上游，緊挨轉錄的起始位點，是RNA聚合酶的識別和結合位點，啟動轉錄過程。
一段特殊DNA序列，位于基因的下游，終止轉錄。
2.基因表達載體的組成
有時為了滿足應用需要，會在載體中人工構建誘導型啟動子，當誘導物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達。
便于重組DNA分子的篩選
DNA復制的起始位點。
載體≠表達載體：
1.二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。
2.表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構。
辨析
目的基因插入位點是隨意的嗎？應注意什么？
思考
提示： 隨意的；
目的基因的表達需要 與 的調控，
所以目的基因應插入到啟動子和終止子 的部位。
不是
啟動子
終止子
之間
易錯提醒
項目 啟動子 終止子 起始密碼子 終止密碼子
本質 ______ _____ _______ _______
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 ________________________________________________ ____________________________ _____________________ ________________________
DNA
DNA
mRNA
mRNA
RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA
使轉錄在所需要的地方停下來
翻譯的起始信號(編碼氨基酸)
翻譯的結束信號(不編碼氨基酸)
啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
目的基因
限制酶切割位點
先用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶（同尾酶）切割載體和含有目的基因的片段，再用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體上，形成重組DNA分子。
標記基因
啟動子
限制酶切割位點
終止子
復制原點
限制酶
限制酶
DNA連接酶
3.基因表達載體的構建程序
1、單酶切（同一種酶）：
（1）目的（結果）：
產生相同的黏性末端，以便進行連接
（2）DNA連接酶處理后會出現幾種產物：
①目的基因——載體連接物
②載體——載體連接物
③目的基因——目的基因連接物
②③分別叫做載體的自身環化和目的基因的自身環化
拓展：限制酶的選擇
單酶切缺點：
①質粒、目的基因自身環化；②質粒與目的基因反向連接
問題探討
選擇兩種不同的限制酶同時對目的基因和質粒切割
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
-G
-CTTAA
如何防止目的基因和質粒的自身環化以及目的基因的反向連接？
雙酶切的優點:
① 防止質粒重新環化
② 防止質粒與目的基因反向連接
③ 防止目的基因自身環化
知識擴展：限制酶的選擇原則
(3)確保出現相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質粒，如圖中 ；為避免目的基因和質粒自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖也可選擇 和 兩種限制酶。
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇 ，而不選擇 。
(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇 。
PstⅠ
SmaⅠ
SmaⅠ
PstⅠ
PstⅠ
EcoRⅠ
根據常規質粒的結構確定限制酶的種類
3．如圖是基因工程中基因表達載體的模式圖，若結構X是表達載體所必需的，則X最可能是（ ）

A．熒光蛋白基因
B．啟動子
C．限制酶
D．起始密碼子
B
4．如圖是利用基因工程技術培育轉基因植物，生產可食用疫苗的部分過程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性核酸內切酶。下列說法錯誤的是（ ）

A．圖示過程是基因工程的核心步驟
B．表達載體構建時需要用到限制酶SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來
D．除圖示組成外，表達載體中還應該含有啟動子和終止子等結構
B
4 3 2 1
目 錄
目的基因的篩選與獲取
基因表達載體的構建
將目的基因導入受體細胞
目的基因的檢測與鑒定
轉化是指目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。基因工程中不同生物轉化方法不同。
將目的基因導入
植物細胞
將目的基因導入
動物細胞
將目的基因導入
微生物細胞
農桿菌轉化法
花粉管通道法
——顯微注射法(受精卵)
——Ca2+處理法（大腸桿菌）
1.轉化
2.目的基因導入受體細胞的方法
第三步 將目的基因導入受體細胞
復習：
1.基因工程的基本操作程序；
2.獲取目的基因的方法；
3.PCR原理、條件、過程、結果；
4.構建基因表達載體的目的
5.基因表達載體的組成；
6.如何構建基因表達載體；
7.將目的基因導入受體細胞的方法？
導入植物細胞（植物細胞轉化方法）：
花粉管通道法
第三步 將目的基因導入受體細胞
花粉
外源DNA
花粉管
子房
胚珠
有多種操作方式：
例如可以用微量注射器將含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
也可以在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。
導入植物細胞（植物細胞轉化方法）：
花粉管通道法
第三步 將目的基因導入受體細胞
適用生物：開花植物
農桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有侵染能力。農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T-DNA（可轉移的DNA）轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。
根據農桿菌的這種特點，如果將目的基因插入Ti質粒的T-DNA中，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞。
T-DNA
T i 質 粒
目的基因
導入植物細胞（植物細胞轉化方法）：
2.農桿菌轉化法
第三步 將目的基因導入受體細胞
農桿菌轉化法
Ti質粒
T-DNA
目的基因
構建表達載體
含目的基因的Ti質粒
轉入農桿菌
含重組Ti質粒的農桿菌
導入植物細胞
表現新性狀的植物
植物細胞
染色體DNA
植物葉片切下與農桿菌共培養，然后篩選轉化細胞，或將花序培養在農桿菌溶液中，獲得種子，然后篩選、鑒定
第三步 將目的基因導入受體細胞
植物組織培養
第一次拼接：將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上；
第一次導入：將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌；
提醒：農桿菌轉化法中的兩次拼接、兩次導入
兩次拼接：
兩次導入：
表現出新性狀的植株
第二次拼接：指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上(非人工操作)。
第二次導入：指含目的基因的T-DNA導入受體細胞(非人工操作)。
導入動物細胞（動物細胞轉化方法） ：
常用顯微注射法將目的基因注入受精卵
第三步 將目的基因導入受體細胞
構建基因表達載體并提純
利用顯微注射法將基因表達載體注入動物的受精卵中
早期胚胎培養
胚胎移植（移植到同期發情的母畜子宮內）
獲得具有新性狀的動物
導入原核細胞（細菌轉化方法）
一般用Ca2+處理使大腸桿菌處于一種易于吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態（感受態），然后將重組的基因表達載體導入其中。
第三步 將目的基因導入受體細胞
利用轉基因大腸桿菌生產藥物
實例：
5．下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關敘述，正確的是（ ）

A．②的構建需要限制性內切核酸酶和DNA聚合酶的參與
B．③侵染植物細胞后，重組 Ti 質粒整合到④的染色體DNA上
C．⑤只要表現出抗蟲性狀就表明植株發生了定向的可遺傳變異
D．若④的染色體上含抗蟲基因，⑤就表現出抗蟲性狀
C
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目 錄
目的基因的篩選與獲取
基因表達載體的構建
將目的基因導入受體細胞
目的基因的檢測與鑒定
檢測目的基因進入受體細胞后，是否穩定維持和表達其遺傳特性。
類型 檢測內容 方法
分子水平的檢測
個體生物學水平的鑒定
受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否轉錄出了mRNA
PCR等技術
目的基因是否翻譯成蛋白質
抗原-抗體雜交技術
個體是否具有相應性狀
抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等
1.目的
2.檢測內容及方法
第四步 目的基因的檢測與鑒定
逆轉錄
①PCR等技術檢測
提取
待測DNA
轉基因
生物
PCR
通過電泳檢測是否擴增出目的基因
提取
待測mRNA
轉基因
生物
PCR
利用目的基因的核苷酸序列設計引物。
PCR中的引物應該根據什么進行設計？
思考
②DNA分子雜交技術
將受體DNA/RNA提取出來，進行PCR擴增
探針
使探針與PCR擴增后的產物進行雜交，如果出現雜交帶，就說明目的基因整合到受體生物的染色體DNA上或者轉錄出了mRNA
基因探針：簡稱探針，是一段帶有檢測標記（同位素、熒光分子或化學發光催化劑），且順序已知的，與目的基因互補的核酸序列(DNA或RNA)。
基因是否翻譯為蛋白質——抗原-抗體雜交技術
Bt抗蟲蛋白
個體生物學水平的鑒定
接種棉鈴蟲觀察性狀表現，或采摘抗蟲棉的葉子飼喂棉鈴蟲，觀察抗蟲效果。
第四步 目的基因的檢測與鑒定
抗性鑒定
獲取質粒、噬菌體等載體
篩選和獲取目的基因
用限制酶切割載體和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA連接酶連接，構建基因表達載體
將含有目的基因的表達載體導入受體細胞
檢測和鑒定目的基因是否穩定維持和表達其遺傳特性
基因工程的基本操作程序
轉基因抗蟲棉在世界范圍被廣泛種植，有效控制了棉鈴蟲的種群數量，顯著減少了農藥的用量。面對棉鈴蟲的危害，有了抗蟲棉是否就可以一勞永逸、高枕無憂呢？根據棉鈴蟲對傳統農藥產生抗性的發展歷史，科研人員推測棉鈴蟲中存在對Bt抗蟲蛋白產生抗性的可能。請你查閱資料，了解以下問題：
1．在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉Bt基因的抗蟲棉產生了嚴重的抗性？證據是什么？
2．科研工作者在發現棉鈴蟲出現抗性之前，就應該想辦法應對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？
【到社會中去】
練習與應用
一、概念檢測
1. 研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因afp合到土壤農桿菌的Ti質粒上，然后用它侵染番茄細胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關表述是否正確。
（1）afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。 （ ）
（2） 構建含有afp基因的Ti質粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶。 （ ）
（3） 只要檢測出番茄細胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功。（ ）
2. 利用PCR既可以快速擴增特定基因，也可以檢測基因的表達。下列有關PCR的敘述錯誤的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶
B. 變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶
C. 復性過程中引物與模板鏈的結合遵循堿基互補配對原則
D. 延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和 4種核糖核苷酸
√
×
×
D
二、拓展應用
1. 研究人員在研究轉基因煙草中外源卡那霉素抗性基因的遺傳穩定性時，發現44株轉基因煙草中有4株該基因的遺傳不符合孟德爾遺傳規律，在它們的自交后代中出現了較多的沒有卡那霉素抗性的植株。請查找相關資料，嘗試對這個問題作出解釋。
【提示】外源基因插入基因組中可能為單位點插入，或者同一染色體多位點插入，或者不同染色體多位點插入。大多數情況下，插入的位點難以做到定點插入；插入的拷貝數也是隨機的。因此，外源基因在轉基因植物中的遺傳是很復雜的。例如，科研人員在對轉GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的煙草進行基因表達分析時，發現部分轉基因植株的染色體DNA中整合了多個拷貝的基因，從而導致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩定性。
2. 八氫番茄紅素合酶（其基因用psy表示） 和胡蘿卜素脫飽和酶（其基因用crtl表示）參與β-胡蘿卜素的合成。pmi為磷酸甘露醇異構酶基因，它編碼的蛋白質可使細胞在特殊培養基上生長。科學家將psy和crtl基因轉入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡蘿卜素，由此生產出的大米稱為 “黃金大米”。請根據以上信息回答下列問題。
普通大米（左）和“黃金大米”（右）
【這項研究成果發表在《自然 生物技術》（Nature Biotechnology ）雜志上】
（1）科學家在培育“黃金大米”時，將ctrl 和psy基因導入含pmi基因的質粒中，構建了質粒pSYN 12424。該項研究的目的基因是______ ，標記基因是_____ ，質粒pSYN 12424的作用是______ 。
【提示】ctrl 基因和psy基因 Pmi基因 將目的基因送入水稻細胞。
（2）在構建質粒載體時，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的識別序列？為什么？
【提示】不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的識別序列，限制酶可能將它切斷。
二、拓展應用
（3）請查找相關資料，了解科學家為什么 要培育“黃金大米”以及當前關于“是否要推廣 '黃金大米’”的各種爭論。你還可以提出自己的看法，并與同學交流討論。
【提示】維生素A在人體內具有非常重要的生理功能，對視力、骨骼生長、免疫功能等都有調節作用。但是，人體不能合成維生素A，需要從食物中攝取。維生素A缺乏癥是南亞地區常見的由營養不良導致的疾病，該地區的居民一般以秈稻作為主食。β-胡蘿ト素是維生素A的前體，在人體內它可以轉化為維生素A。因此，科學家將兩個參與β-胡蘿ト素合成的酶的基因轉入了秈稻中，使其胚乳中富含β-胡蘿ト素，期望讓人們通過日常食用主食就能補充足夠量的維生素A，從而降低維生素A缺乏癥的患病率。關于“是否要推廣黃金大米”的爭論主要圍繞其安全性、有效性等方面展開。
二、拓展應用
DNA片段的擴增及電泳鑒定
探究·實踐
（1）DNA片段的擴增
①利用PCR可以在體外進行DNA片段的擴增。
②PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。
③PCR儀實質就是一臺能夠自動調控溫度的儀器。一次PCR一般要經歷30次循環。
（2）DNA片段的電泳鑒定
①DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
②PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。凝膠中的DNA分子通過染色（EB染色），可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。
實驗原理
加樣孔
電源
材料用具：試劑
①PCR反應體系的配方
材料 用量
10倍濃縮的擴增緩沖液（含 ） 5μL
20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為 ） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶 （即 的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量為1pg-1μg） 5～10μL
Mg2+
dNTP
耐高溫
DNA片段的擴增及電泳鑒定
探究·實踐
實驗：DNA片段的擴增及電泳鑒定
材料用具：試劑
②無菌水、瓊脂糖；
③電泳緩沖液（TAE或TBE）；
④凝膠載樣緩沖液（內含指示劑溴酚藍和蔗糖）；
⑤核酸染料（常用核酸染料為溴化乙錠，簡稱EB）；
→配制凝膠；
→增加導電性；維持電泳過程中合適的pH;
→溴酚藍作為前沿指示劑可以預測電泳進程；蔗糖：可以增加樣品密度；
→使核酸染色，便于觀察；
材料用具：用具
①PCR儀
②微量離心管
③微量移液器
④一次性吸液槍頭
⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）
→自動控溫，實現DNA的擴增
→實際上是進行PCR反應的場所
→用于向微量離心管轉移PCR配方中的液體
→微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭
DNA片段的擴增及電泳鑒定
探究·實踐
微量離心管
推動桿
調節旋鈕
卸槍頭按鈕
體積刻度
吸液桿
槍頭
（注意：加不同樣品時，需要更換槍頭）
PCR反應體系的配方 10倍濃縮的擴增緩沖液 5 μL
20 mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液 1 μL
20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL
20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL
H2O 28～33 μL
1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1～2 U
模板DNA 5～10 μL
總體積 50 μL
注：模板DNA的用量為1pg～1μg 1．PCR加樣操作
按照右表，用微量移液器依次將各組分加入微量離心管中。（注意：酶和緩沖液要在冰塊上緩慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和緩沖液一般分裝成小份，避免反復融化導致活性降低甚至失活。）
方法步驟
2．離心
蓋嚴離心管，離心10s，使反應液集中在離心管底部。
3 ．PCR
參照上表設置PCR循環程序。
循環程序 變性 復性 延伸
預變性 94℃，5min
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
瓊脂糖凝膠電泳的操作步驟
電泳
4．制備凝膠
根據DNA片段大小，用電泳緩沖液配制適合濃度的瓊脂糖溶液（一般為0.8%～1.2%）。瓊脂糖用沸水浴或微波爐熔化，稍冷卻加入適量核酸染料混勻。
將瓊脂糖溶液倒入模具，并插入大小合適的梳子（用以形成加樣孔）。
待凝膠凝固后，將梳子拔出。
5．電泳加樣
將凝膠放入電泳槽，加電泳緩沖液沒過凝膠約1mm。將PCR擴增產物與凝膠載樣緩沖液（內含有指示劑）混合，用移液器緩慢注入加樣孔。其中一個加樣孔中加入Maker（指示分子大小的參照物）。
6．電泳
接通電源，設定電壓（一般1～5V/cm），待指示劑前沿遷移至接近凝膠邊緣時，停止電泳。
7．觀察、照相
取出凝膠在紫外燈下觀察、照相。
注意事項
1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？
2.你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因。
提示：可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。進行電泳鑒定的結果應該是一條條帶，該片段大小約為750bp。
提示：如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當等。如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質量不好等。
結果分析與評價
基因工程的基本操作程序
目的基因的篩選與獲取
基因表達
載體的構建
（核心工作）
將目的基因
導入受體細胞
目的基因的檢測與鑒定
篩選
獲取
有效方法
從相關已知結構和功能清晰的基因中篩選
人工合成
構建基因文庫
PCR
含義
條件
過程
結果
儀器
產物鑒定方法
變性
復性
延伸
循環
目的
構建步驟
組成
植物
微生物
動物
花粉管通道法
農桿菌轉化法
顯微注射法
Ca2+
處
理
分子水平
個體水平
DNA
mRNA
蛋白質
PCR
等技術
抗原-抗體
雜交法

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